La toxicité des nanoparticules d'or chez la souris due à une interaction nanoparticule/médicament provoque des lésions rénales aiguës

Introduction

La nanotechnologie joue un rôle de plus en plus important au XXIe siècle, les nanomatériaux étant à la base des progrès de la nanotechnologie. Les développements récents dans la fabrication de nanoparticules ont facilité l'utilisation de nanomatériaux innovants dans le monde entier [1, 2]. Les nanomatériaux ont un diamètre de 100  nm ou moins, et les exemples incluent les nanoparticules d'or, d'argent, de silice, de platine et de dioxyde de titane, ainsi que les fullerènes et les nanotubes de carbone [3, 4]. Ces matériaux peuvent trouver des applications dans la technologie de stockage électronique, la médecine génique/régénérative et les dispositifs électroniques, et sont à la base de nouvelles industries au XXIe siècle [5]. Cependant, les nanoparticules telles que les PM2,5 provoquent une grave pollution de l'environnement, des maladies respiratoires telles que l'asthme et des cardiopathies ischémiques [6]. De plus, les particules de diesel émises par les automobiles peuvent avoir des effets biologiques en pénétrant dans le cerveau et les organes reproducteurs [7], les particules fines fibreuses telles que l'amiante induisent un mésothéliome et les nanomatériaux fibreux industriels tels que les nanotubes de carbone peuvent avoir un impact négatif sur la santé humaine [8, 9]. De nombreuses inconnues demeurent donc concernant les effets biologiques des nanoparticules.

L'or (Au) a une faible tendance à l'ionisation et une stabilité élevée et a été utilisé comme métal précieux à des fins décoratives depuis l'antiquité. Les nanoparticules d'or récemment développées sont largement utilisées dans les applications médicales et d'ingénierie en raison de leurs propriétés optiques caractéristiques [10, 11], et leurs excellentes propriétés optoélectroniques ont entraîné leur utilisation dans les cellules solaires organiques, les sondes de capteur et les matériaux conducteurs [12, 13] . Les nanoparticules d'or sont utilisées dans l'industrie chimique comme catalyseurs pour la synthèse de résine acrylique. Ils présentent également une activité catalytique à basse température supérieure pour l'oxydation du CO par rapport aux nanoparticules de platine, ce qui entraîne leur utilisation comme catalyseur de purification des gaz d'échappement. D'autres applications des nanoparticules d'or sont attendues à l'avenir, mais il y a eu peu de recherches sur la toxicité des nanoparticules d'or et leur interaction potentielle avec les médicaments.

Le domaine de la nanotechnologie s'étend à mesure que les chercheurs explorent la sécurité, la pharmacologie et la pharmacocinétique des nanoparticules. Il a été démontré que les nanoparticules de silice provoquent une cytotoxicité, une hépatotoxicité et des lésions placentaires [14, 15], et les nanotubes de carbone peuvent induire un mésothéliome pulmonaire [16]. Cependant, on sait peu de choses sur les effets pharmacologiques résultant des interactions entre les nanoparticules et les médicaments. Dans cette étude, nous avons étudié la toxicité des particules d'or de 10, 50 et 100  nm de diamètre (GnP10, GnP50 et GnP100, respectivement) chez la souris afin de clarifier leur innocuité chez les mammifères. De plus, nous avons examiné les effets de ces nanoparticules sur la toxicité du paraquat (PQ, une hépatotoxine et néphrotoxine bien connues) [17], du cisplatine (CDDP, un agent antitumoral largement utilisé) [18, 19] et du 5-aminosalicylique acide (5-ASA, un anti-inflammatoire courant) [20].

Résultats et discussion

Nous avons d'abord mesuré la taille des particules des nanoparticules d'or à l'aide d'un Zetasizer, puis observé les particules en utilisant la microscopie électronique à transmission (Fig. 1a, b, c). Les diamètres moyens des nanoparticules GnP10, GnP50 et GnP100 étaient respectivement de 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 et 97,0 ± 27,1  nm (Fig. 1). De plus, les nanoparticules d'or s'agrègent lorsqu'elles sont mesurées par microscopie électronique mais ne s'agrègent pas lorsqu'elles sont administrées à des souris. De plus, nous avons mesuré la concentration en ions or par ICP-MS, mais aucun ion n'a été détecté (données non présentées). Les surfaces des nanoparticules d'or ont été modifiées avec de l'acide citrique pour augmenter l'affinité des nanoparticules pour l'eau, mais cette modification n'a présenté aucune autre fonctionnalité.

Ultrastructures de nanoparticules d'or. Micrographies électroniques de GnP10 (a ), GnP50 (b ), et GnP100 (c ) nanoparticules

Nous avons examiné si le GnP présentait une hépatotoxicité et une néphrotoxicité en administrant une dose maximale de 4  mg/kg à des souris par la veine caudale. Aucune hépatotoxicité ou néphrotoxicité n'a été observée lorsque des nanoparticules d'or seules ont été administrées (Fig. 2). Les valeurs ALT et AST des souris ayant reçu GnP10, 50 et 100 seuls (Fig. 2a, b) étaient similaires aux valeurs témoins, tout comme les valeurs BUN et Cr. Une seule administration de GnP à des souris n'a pas provoqué de lésions hépatiques ou rénales, ni de lésions cardiaques, pulmonaires ou spléniques (Fig. 2), indiquant que les nanoparticules d'or ne sont pas toxiques lorsqu'elles sont administrées seules à des souris.

Effet des nanoparticules d'or sur la toxicité induite par le cisplatine. Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de cisplatine (CDDP) à 0 (barres vides) ou 100 mol/kg (barres pleines), ainsi qu'une injection IV de véhicule ou de nanoparticules d'or (4 mg/kg). 24 heures après l'injection, les taux sériques des enzymes hépatiques alanine aminotransférase (ALT ; panel a ) et l'aspartate aminotransférase (AST ; panel b ) et les taux plasmatiques d'azote uréique du sang (BUN ; panneau c ) et la créatinine (Cr ; panneau d ) ont été déterminés à l'aide de kits disponibles dans le commerce (voir la section « Analyses biochimiques »). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM ; n =4). Différence significative (*P <0,05, **P <0,01) entre les groupes traités par véhicule et CDDP

Il a été rapporté que des dommages au foie et aux reins étaient induits par la co-administration de nanoparticules de silice, de nanoargiles ou de nanoparticules de polystyrène avec des médicaments ou des produits chimiques [14, 21, 22]. Nous avons donc co-administré des nanoparticules d'or avec du PQ (une toxine foie-rein) ou les médicaments CDDP ou 5-ASA (qui provoquent des effets néphrotoxiques hépatiques indésirables). La figure 2 montre les résultats de l'interaction entre les nanoparticules d'or et le CDDP. La co-administration de GnP10 ou GnP50 et de CDDP a augmenté l'ALT et induit des lésions hépatiques (Fig. 2a), et la co-administration de GnP10 et CDDP a augmenté BUN et Cr, induisant des lésions rénales (Fig. 2c, d). Nous avons ensuite étudié l'interaction entre le GnP et le 5-ASA, un médicament anti-inflammatoire largement utilisé qui cause des dommages au foie et aux reins. La co-administration de GnP10 ou GnP50 avec CDDP a augmenté l'ALT et induit des lésions hépatiques (Fig. 3a), tandis que la co-administration avec 5-ASA a augmenté BUN et Cr et induit des lésions rénales (Fig. 3c, d). Ensuite, nous avons étudié l'interaction entre le GnP et le PQ, un produit agrochimique largement utilisé qui cause des dommages au foie et aux reins. La co-administration de GnP10 et de PQ a augmenté les taux de BUN et de Cr et induit des lésions rénales (Fig. 4c, d) mais pas de lésions hépatiques (Fig. 4a, b). La co-administration des plus petites particules d'or testées, GnP10, avec CDDP, 5-ASA ou PQ a donné les valeurs d'ALT, BUN et Cr les plus élevées observées dans cette étude. Les particules 10 fois plus grosses de GnP100 n'ont pas causé de dommages au foie ou aux reins lorsqu'elles ont été co-administrées avec le CDDP, le 5-ASA ou le PQ. Ces résultats montrent que le GnP est toxique lorsque des particules de moins de 100  nm de diamètre sont co-administrées avec du CDDP, du 5-ASA ou du PQ.

Effet des nanoparticules d'or sur la toxicité induite par l'acide 5-aminosalicylique. Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale d'acide 5-aminosalicylique (5-ASA) à 0 (barres vides) ou 500 mg/kg (barres pleines), ainsi qu'une injection IV de véhicule ou de nanoparticules d'or (4 mg/kg). 24 heures après l'injection, les taux sériques des enzymes hépatiques alanine aminotransférase (ALT ; a ) et l'aspartate aminotransférase (AST ; B) et les taux plasmatiques d'azote uréique du sang (BUN ; c ) et la créatinine (Cr ; d ) ont été déterminés à l'aide de kits disponibles dans le commerce (voir la section « Analyses biochimiques »). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM ; n =4). Différence significative (*P <0,05, **P <0,01) entre les groupes traités par véhicule et 5-ASA

Effet des nanoparticules d'or sur la toxicité induite par le paraquat. Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de paraquat (PQ) à 0 (barres vides) ou 50 mg/kg (barres pleines), ainsi qu'une injection IV de véhicule ou de nanoparticules d'or (4 mg/kg). 24 heures après l'injection, les taux sériques des enzymes hépatiques alanine aminotransférase (ALT ; a ) et l'aspartate aminotransférase (AST ; b ) et les taux plasmatiques d'azote uréique du sang (BUN ; c ) et la créatinine (Cr ; d ) ont été déterminés à l'aide de kits disponibles dans le commerce (voir la section « Analyses biochimiques »). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM ; n =4). Différence significative (*P <0,05, **P <0,01) entre les groupes traités par véhicule et PQ

L'observation de l'hématoxyline et de l'éosine rénales après la co-administration de GnP10 avec CDDP, 5-ASA ou PQ (Fig. 5) a montré des lésions des tubules, suggérant l'induction d'une lésion rénale aiguë. Ensuite, nous avons mesuré l'IL-6 et le TNF-α dans le sérum pour étudier la cause sous-jacente des lésions rénales aiguës induites par la GnP10. La figure 6 montre les taux sériques d'IL-6 3h après la co-administration de GnP10 avec CDDP, 5-ASA ou PQ. L'IL-6 n'a pas été détectée dans le groupe GnP10 seul, mais une augmentation de l'IL-6 a été observée lorsque GnP10 était co-administré avec CDDP, 5-ASA ou PQ. Le TNF-a n'a été détecté dans aucun groupe (données non présentées). Ces résultats suggèrent que l'IL-6 est impliquée dans les lésions rénales aiguës induites par le GnP10 et le CDDP, le 5-ASA ou le PQ.

Analyse histologique des tissus rénaux de souris traitées aux nanoparticules d'or. À 24 heures post-IV, administration de GnP10 uniquement (a ), GnP10 avec CDDP (b ), GnP10 avec 5-ASA (c ), et GnP10 avec PQ (d ), les tissus ont été collectés, fixés avec du paraformaldéhyde à 4 %, sectionnés et colorés à l'hématoxyline et à l'éosine. Les flèches désignent les sites de lésions rénales

Taux d'IL-6 dans le sérum, mesurés par ELISA. Les souris ont reçu une injection IV de GnP10 avec CDDP, 5-ASA ou PQ. Les taux de cytokines ont été mesurés 3h après l'administration. Les valeurs sont la moyenne ± erreur standard (SE ; n =4)

Nous avons étudié l'effet de la co-administration de nanoparticules d'or et de médicaments sur les effets secondaires (c'est-à-dire les dommages au foie et aux reins). La plus petite taille de particule, GnP10, a induit des lésions rénales et hépatiques lors de la co-administration avec CDDP, 5-ASA ou PQ. Nous avons également co-administré du GnP10 avec de l'acétaminophène, de la streptomycine ou de la tétracycline à des souris et n'avons observé aucun dommage au foie ou aux reins (données non présentées). Nous avons précédemment rapporté que les nanoparticules de silice induisent des lésions hépatiques, en fonction de la taille des particules [23], et que les nanoparticules de polystyrène peuvent induire des lésions hépatiques lors de la co-administration avec un médicament, en fonction de la taille des particules [24]. Xia et al. ont rapporté que les nanoparticules d'or plus petites sont plus génotoxiques in vitro [25]. Prises ensemble, les nanoparticules d'or deviennent hautement toxiques en raison des interactions avec les médicaments à mesure que la taille des particules est réduite.

La co-administration de Gnp10 avec le cisplatine, le 5-ASA ou le PQ a augmenté les taux d'IL-6 (Fig. 6). L'IL-6 n'était pas élevée par l'administration de GnP10 seule (figure 6) ou par l'administration de CDDP, PQ ou 5-ASA seule (données non présentées). Il a été rapporté précédemment que l'IL-6 était impliquée dans l'induction de lésions hépatiques [26] et rénales aiguës [27, 28]. Nous pensons que Gnp10 induit l'IL-6, qui à son tour induit des lésions hépatiques et rénales, mais le mécanisme sous-jacent reste incertain. Bauza et al. rapportent que l'IL-6 induit des lésions hépatiques en induisant des facteurs de transcription dans les hépatocytes [29]. Comprendre l'implication des facteurs de transcription spécifiques aux cellules dans les lésions hépatiques et rénales induites par l'IL-6 nécessitera d'autres expériences sur le mécanisme à l'origine de la cytotoxicité des nanoparticules d'or.

Récemment, les nanoparticules d'or ont attiré l'attention en tant que biomatériau fonctionnel utilisé dans les systèmes d'administration de médicaments [30], et des recherches sur le traitement du cancer à l'aide de nanoparticules d'or sont activement menées. Par exemple, Anselmo et al. ont rapporté que les nanoparticules de silice-or recouvertes de PEG augmentaient la température locale lors de l'absorption de la lumière et des tumeurs solides dissoutes thermiquement [31], montrant que les nanoparticules d'or sont des matériaux prometteurs pour le traitement du cancer. Cependant, nous avons constaté que l'interaction entre le médicament anticancéreux cisplatine et les nanoparticules d'or induisait des lésions rénales (Fig. 2), suggérant que l'utilisation de nanoparticules d'or dans le traitement du cancer nécessite une étude de leur sécurité lorsqu'elles sont co-administrées avec le médicament.

Conclusions

En résumé, Gnp10 a causé des lésions rénales lors de la co-administration avec CDDP, PQ ou 5-ASA. Le GnP50 n'a causé de lésions rénales que lorsqu'il était co-administré avec du 5-ASA, contrairement au GnP100. Nous avons démontré que les nanoparticules d'or peuvent endommager les reins et que cet effet peut être exacerbé de manière synergique à la suite d'interactions avec des produits chimiques ou des médicaments. D'autres études basées sur ces données seront nécessaires pour élucider pleinement les profils toxicologiques des nanoparticules proposées à des fins diagnostiques ou thérapeutiques.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Des suspensions de particules d'or coiffées de citrate-ligand de 10, 50 et 100  nm de diamètre ont été obtenues auprès de NANOCOMPOSIX, INC. (San Diego, CA, USA). Les distributions de taille des particules ont été analysées en utilisant un Zetasizer (Sysmex Co., Kobe, Japon) et un microscope électronique à transmission TEM JEOL JEM-1011. Les diamètres moyens étaient de 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 et 87,0 ± 27,1  nm (Fig. 1, Fig. 1 supplémentaire). Les suspensions aqueuses (1 µmg/mL) ont été soigneusement dispersées par sonication avant utilisation et diluées avec de l'eau. La présence d'or ionisé dans les suspensions de nanoparticules d'or a été examinée par ICP-MS, et aucun or ionisé n'a été détecté. Des volumes identiques de chaque suspension ont été injectés à des souris pour chaque expérience. Les tailles géométriques des particules ont été caractérisées par MET. Le paraquat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), le cisplatine et l'acide 5-aminosalicylique (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japon) ont été dissous dans une solution saline et conservés à -20°C jusqu'à utilisation. Tous les réactifs étaient de qualité recherche.

Animaux

Des souris mâles BALB/c âgées de huit semaines ont été achetées auprès de Funabashi Farm Co., Ltd. (Chiba, Japon). Les animaux ont été maintenus dans un environnement contrôlé (température de 23 ± 1,5 °C; lumière cycle lumière/obscurité de 12 h) avec un accès libre à la nourriture standard pour rongeurs et à l'eau. Les souris ont reçu 1 semaine pour s'acclimater avant de commencer les expériences. Les protocoles expérimentaux étaient conformes aux directives éthiques de l'École supérieure des sciences pharmaceutiques de l'Université Teikyo Heisei, compilées à partir des directives pour l'expérimentation animale de l'Association japonaise des sciences des animaux de laboratoire.

Analyses biochimiques

L'alanine aminotransférase sérique (ALT), l'aspartate aminotransférase sérique (AST), l'azote uréique du sang (BUN) et la créatinine (Cr) ont été mesurés à l'aide de kits disponibles dans le commerce (Wako Pure Chemical Industries) selon les protocoles du fabricant. Brièvement, le sérum collecté (10 mL) a été combiné avec 1 mL de réactif de couleur A (contenant de l'uréase) et incubé à 37 °C pendant 15 min. Suite à l'ajout de 1 mL de réactif de couleur B, l'échantillon a été incubé à 37 °C pendant 10 min. L'absorbance a été mesurée à une longueur d'onde de 570 nm. L'interleukine (IL)-6 et le TNF-α ont été analysés à l'aide d'un kit ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (BioSource International, CA, USA). Toutes les analyses ont été effectuées en stricte conformité avec les instructions du fabricant.

Analyse histologique

24h après l'administration de la dose, les animaux ont été sacrifiés et les foies ont été prélevés et fixés avec du paraformaldéhyde à 4 %. Après le traitement et la coupe, des coupes de tissus minces ont été colorées à l'hématoxyline et à l'éosine pour observation histologique.

Analyse statistique

Les analyses statistiques ont été effectuées avec les formulaires complémentaires Statcel, 3rd Excel Software (EMS publication Co., Ltd., Saitama, Japon). Toutes les données sont présentées sous forme de moyennes ± erreur standard de la moyenne (SEM). Des différences significatives entre les groupes témoins et expérimentaux ont été déterminées à l'aide du test de Dunnett ; un P une valeur inférieure à 0,05 a été considérée comme significative.

Disponibilité des données et des matériaux

Non applicable.

Abréviations

ALT :

Alanine aminotransférase

AST :

Aspartate aminotransférase

BUN :

Azote uréique du sang

PQ :

Paraquat

Cr :

Créatinine