Conception de liposomes Aptamer-Gold chargés de nanoparticules sensibles au pH encapsulant de la morine pour traiter le cancer

Introduction

L'une des causes de décès les plus répandues [1], le cancer, peut entraîner des pertes économiques substantielles et des dommages aux humains. Des efforts considérables ont été consacrés au développement de médicaments intelligents pour le traitement du cancer [2]. En raison de leur capacité à protéger les médicaments jusqu'à ce qu'ils atteignent le site cible, les nanoparticules de polymère peuvent potentiellement améliorer l'administration de médicaments thérapeutiques [3]. Pour garantir que l'agent thérapeutique est délivré au site actif, des nanoparticules hautement réactives sont utilisées. Ces nanoparticules peuvent être conçues pour varier en propriétés matérielles sous différents stimuli biologiques. Les nanoparticules réactives sont conçues à l'aide de différents stimuli, y compris des stimuli externes (par exemple, la température et la lumière) et des stimuli biologiques (par exemple, le pH ou les conditions redox). Les nanoparticules sensibles au pH ont suscité l'intérêt de la recherche en raison des changements de pH après l'endocytose des nanoparticules. Les matériaux qui répondent au pH attirent également l'attention car la fonction de réponse au pH peut être facilement intégrée dans une gamme de structures polymères pour concevoir un ensemble de nanoparticules qui répondent au pH. Les nanoparticules peuvent réagir au pH par une altération de la chimie de surface, un changement dans la taille ou la forme des particules et la décomposition ou la libération de substances. Ce changement dans les propriétés des nanoparticules peut être utilisé pour réguler l'absorption cellulaire et la libération contrôlée. Par conséquent, les nanoparticules sensibles au pH offrent une stratégie puissante pour la conception de systèmes d'administration thérapeutique.

L'hydrate de morin (3,5,7,2′,4′-pentahydroxyflavone) (Fig. 1) est une substance active naturelle isolée de plantes médicinales ou de plantes chinoises [4]. C'est un composé de progestérone et un métabolite secondaire du phénol dans les plantes. Le morin est largement répandu dans la nature et exerce de bons effets antioxydants, anticancéreux [5] et anti-inflammatoires significatifs. Le potentiel de Morin pour diverses applications a suscité un intérêt considérable [6], mais ce potentiel est considérablement limité par la faible solubilité dans l'eau et la faible biodisponibilité de la substance [7].

Structure chimique de l'hydrate de Morin

Les liposomes (creux) composés de lécithine et de céramide, entre autres, ont une structure bicouche constituée de molécules lipidiques amphiphiles [8]. Les liposomes offrent des caractéristiques souhaitables, telles que la biocompatibilité, la fonctionnalité, des effets secondaires réduits et la capacité d'encapsuler de grandes quantités de médicaments [9, 10]. Ils peuvent transporter efficacement des agents hydrophiles et hydrophobes et les protéger des conditions extérieures, en les transportant avec succès vers des régions tissulaires ciblées [11]. Une efficacité améliorée est incorporée dans la conception pour faciliter la libération déclenchée par le pH du matériau anticancéreux dans l'interstitium tumoral via des liposomes sensibles au pH [12,13,14,15]. Ces liposomes sensibles au pH sont des liposomes spéciaux qui libèrent le médicament dans les environnements tissulaires et se déstabilisent rapidement dans les environnements acides, tels que les endosomes des tissus cancéreux [16,17,18].

Pour une sélectivité et une efficacité accrues du traitement des tumeurs, les liposomes sensibles au pH doivent être modifiés pour former des nanoparticules ciblées sur les tumeurs [19]. Les aptamères d'ADN ont récemment été développés en tant que capteurs de biodétection et d'imagerie hautement sélectifs et sensibles, ainsi que comme agents potentiels pour les thérapies ciblant le cancer [20]. Il a été démontré que l'aptamère d'ADN simple brin AS1411 fonctionne comme un agent chimiothérapeutique en raison de sa forte affinité de liaison pour les noyaux des cellules cancéreuses [21]. Cet aptamère (Apt) a été combiné avec des NP Au pour fabriquer une nanoconstruction à deux composants de NP Au chargées d'Apt qui peut interagir avec les noyaux des cellules cancéreuses. Certaines études ont également démontré que la conception d'hybrides liposomes-nanoparticules peut fournir une riche boîte à outils pour la fabrication de telles modalités multifonctionnelles [22]. Un système vésiculaire hybride liposome-Au NP composé de liposomes cationiques et de Au NP a été conçu pour améliorer la pénétration du médicament dans l'interstitium tumoral et renforcer l'activité anticancéreuse [23, 24].

Les nanoparticules d'or (Au NP) ont été considérées comme de bons vecteurs de médicaments et peuvent être modifiées avec des molécules bio-liées pour améliorer la spécificité ciblant le cancer [25]. Avec la modification de surface des NP Au, l'aptamère du groupe sulfhydryle peut être utilisé pour modifier la surface des NP Au, qui peut être ciblée par la liaison covalente Au-S, et le groupe sulfhydryle approprié sur la surface du nanogold peut être attaché à la surface du nano-or [26]. Du point de vue de l'ingénierie et des applications, les nanomatériaux d'or liés à des ligands fournissent une plate-forme puissante pour faciliter l'identification, la détection et le traitement ciblés.

Dans la présente étude, nous avons utilisé des liposomes sensibles au pH encapsulant du Morin et assemblé Au-Apt qui a été modifié à la surface des liposomes (Apt-Au@MSL, Fig. 3a). Morin, qui se caractérise par une faible solubilité dans l'eau et une faible biodisponibilité, a été transformé. La morphologie, la taille et d'autres propriétés de l'Apt-Au@MSL préparé ont été caractérisées. La nouvelle nanoparticule a montré des propriétés ciblées sur les tumeurs et une activité anticancéreuse élevée. L'activité anticancéreuse d'Apt-Au@MSL a été explorée in vitro et in vivo (Fig. 2).

Diagramme schématique proposé de notre Apt-Au@MSL conçu contenant du Morin pour l'administration de médicaments aux cellules cancéreuses avec une propriété de ciblage tumoral.

Matériaux et méthodes

Matériaux

L-α-Phosphatidylcholine (PC), cholestérol (Chol), hémisuccinate de cholestérol (CHEMS), Morin (≥ 99,99%), citrate de sodium (99,9%), HAuCl₄ ·3H₂ O (environ 99,9 %), la polyvinylpyrrolidone (PVP, poids 40 000), le NaOH (environ 98,0 %) et le HCl (37 %) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Chemical Co. (États-Unis). L'aptamère AS1411 avec une modification disulfure a été synthétisé par TaKaRa (Dalian, Chine) avec la séquence suivante :5'-HS-T-(C6-S-S-C6)-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3'. Le bromure de bleu de thiazolyle et de tétrazolium (MTT), l'iodure de propidium (PI), la calcéine et l'Alexa Fluor 488 Annexine V ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Chemical. Toutes les solutions aqueuses ont été préparées dans de l'eau bidistillée. Tous les autres réactifs étaient les meilleurs disponibles dans le commerce.

Synthèse des NP Au

Jusqu'à 1 mL de HAuCl₄ ·4H₂ O (1%) a été dissous dans 25 mL d'eau Milli-Q (pH = 5,5), et 50 mg de PVP ont été ajoutés à la solution. La solution obtenue a été versée dans un ballon tricol (150 mL) et a été traitée par irradiation micro-ondes (MW) pendant 5 min sous agitation mécanique. Par la suite, 1,5 mL de solution de citrate de sodium (1%) a été rapidement ajouté dans la solution et a été irradié à MW pendant 3 min. La solution a été recueillie par centrifugation à 10000 rpm pendant 5 min.

Synthèse des NP Apt-Au

La liaison disulfure des aptamères a été clivée en utilisant de la tris(2-carboxyéthyl)phosphine. Après 30 min, la solution d'aptamère (100 μL, 100 μM) a été ajoutée à 10 mL de solution 5 nM de Au-NPs puis incubée pendant 24 h pour former Au-Apt NPs. Après 1 jour, nous avons salé la solution du mélange avec 2,5 mL d'une solution à 500  mM de NaCl deux fois, séparés par 4 h [27].

Préparation de liposomes sensibles au pH

Des liposomes composés de PC d'œuf à CHEMS à Chol au rapport molaire de 33:13:5 et 5 % de Morin ont été préparés par hydratation du film. Egg PC, CHEMS, Chol et 2 mg Morin ont été dissous dans 8 mL CHCl₃ , et les solvants organiques ont été éliminés à 40°C avec un évaporateur rotatif. Pour les Morin-liposomes, le film lipidique mince résultant a été hydraté avec du PBS à 2 % (p/v) puis soniqué à l'aide d'une sonde à bain de glace pendant 15 min. Le liposome final a été synthétisé et stabilisé dans le système colloïdal. Pour les liposomes sensibles au pH Apt-Au@Morin (Apt-Au@MSL), le film lipidique a été hydraté avec 475 μg/mL de NPs Au-Apt dans 5% de dextrose suivi d'une sonication [23].

Caractérisation

La spectroscopie ultraviolet-visible (UV-Vis, S-3100 Photodiode Array, Scinco Co., Ltd., Corée) et la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) ont été réalisées (Nicolet iS50, États-Unis, Thermo Fisher Scientific). La morphologie de l'Apt-Au@MSL a été examinée par microscopie électronique à transmission (MET, HT7700, Tokyo Japon, Hitachi). Le pourcentage de libération de Morin a été détecté par spectroscopie UV-vis. La morphologie des Morin–liposomes et Apt-Au@MSL a également été observée par microscopie électronique à balayage (SEM, S-4800, Hitachi, Japon). La diffusion dynamique de la lumière (DLS) et les mesures du potentiel zêta ont été utilisées pour caractériser les propriétés optiques et les tailles des liposomes Morin et Apt-Au@MSL sur un analyseur de potentiel Brookhaven ZetaPALS.

Culture cellulaire

Les lignées cellulaires cancéreuses humaines, SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 et Hs68, ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) et maintenues dans le RPMI avec 10 % de sérum bovin fœtal à 37 °C et 5% de CO₂ .

Étude d'activité anticancéreuse in vitro

SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 et Hs68 ont été ensemencés sur des plaques à 96 puits (2,0 × 10 ³ cellules/puits) puis cultivées avec Apt-Au@MSL à des concentrations variables (0, 5, 10, 15, 20 et 30 g/mL). Au NPs et Morin ont été assignés comme groupes de contrôle. Le groupe témoin était constitué de cellules non traitées. Les plaques 96 puits ont été incubées dans un incubateur humidifié. Après incubation, 9,6 mL de solution de MTT (5 mg/mL) ont été ajoutés dans chaque puits et encore incubés pendant 2 h. Chaque groupe a été testé en triple, et IC₅₀ les valeurs ont été dérivées des valeurs moyennes de DO des tests en triple par rapport aux courbes de concentration de médicament. La luminosité de chaque groupe a été obtenue par microscopie confocale à fluorescence [28].

L'adhésion cellulaire a été surveillée à l'aide d'un système de détection électronique cellulaire en temps réel (RT-CES; ACEA Biosciences, Inc.) toutes les 10 min pendant 75 h. Pour déterminer l'adhésion cellulaire, chaque puits de la plaque a été ensemencé avec des cellules (1,0 x 10 ⁴ cellules/puits) avec un milieu frais jusqu'à un volume final de 200 μL puis incubé dans une solution Apt-Au@MSL à des concentrations variables (10, 20 et 30 μg/mL) à 10 h incubé pendant 12 h [29] . Le groupe blanc était constitué de cellules non traitées et les groupes témoins étaient constitués des groupes Morin et Morin-liposome.

Microscopie à fluorescence

Les cellules SGC-7901 ont été cultivées dans les plaques à 48 puits pendant la nuit à 37 °C, 5 % de CO₂ . Les cellules ont ensuite été traitées avec des solutions d'Apt-Au@MSL (10 et 30µg/mL) à différentes concentrations pendant 12µh. Les groupes témoins étaient constitués des groupes Morin et Morin-liposome. Par la suite, le milieu a été retiré. Le groupe témoin était constitué de cellules non traitées. Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS. Les cellules ont été colorées puis mesurées par co-coloration des cellules vivantes et mortes (le test LIVE/DEAD). Après co-coloration avec Calcéine-AM/PI pendant 30 min, les cellules ont été lavées avec du PBS deux fois pour éliminer l'excès de colorant, et des images de fluorescence ont été obtenues par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) (pour la calcéine-AM, Ex = 488 nm et Em = 515 nm ; PI Ex = 535 nm et Em = 615 nm [30]).

Analyse de la mort cellulaire par apoptose

Pour mesurer les effets anticancéreux d'Apt-Au@MSL, chaque puits d'une plaque à six puits a été ensemencé avec des cellules SGC-7901 (1,0 × 10 ⁵ cellules/puits) puis incubées dans des solutions Apt-Au@MSL à des concentrations variables (5, 10, 20 et 30 g/mL) pendant 12 h. Le groupe témoin était constitué de cellules non traitées et les groupes témoins étaient constitués des groupes Morin et Morin-liposomes. Après traitement, les cellules ont été recueillies et lavées deux fois avec du PBS. Les cellules ont été colorées au PI et à l'Annexine V-FITC puis analysées à l'aide d'un analyseur CytoFLEX (Beckman Coulter) (pour PI, Ex = 535 nm et Em = 615 nm ; Annexine V-FITC, Ex = 488 nm et Em = 525 nm ) [31].

Études sur la destruction des murs

Pour étudier la destruction de la paroi cellulaire dans un test anticancéreux, les cellules SGC-7901 ont été cultivées dans des plaques à six puits à 37 °C et 5 % de CO₂ . Les cellules cultivées sans le matériel ont été utilisées comme groupe témoin. Après que les cellules aient été cultivées avec Apt-Au@MSL à différentes concentrations (5, 10, 20 et 30 g/mL) pendant 12 h, elles ont été traitées avec une solution de Trypsine-EDTA à 0,25%. Toutes les cellules (y compris les cellules flottantes dans le milieu) ont été collectées à 2000µr/min pendant 5µmin. Les cellules collectées ont ensuite été post-fixées dans une solution de dialdéhyde glutarique à 2,5 % pendant 4 h [32]. Les cellules fixées ont été déshydratées dans une série de gradients d'acétone pendant 20 min. Les cellules ont finalement été soumises à une série de procédures, montées sur des grilles de cuivre et observées par MET (HT-7700, Hitachi, Japon).

Dosage Western Blot

L'expression protéique des cellules SGC-7901 a été détectée par analyse Western blot. Des cellules SGC-7901 (4,0 x 105 cellules/puits) ont été inoculées sur une plaque de culture de 9 cm et 20 μg/mL Apt-Au@MSL pendant 1, 6, 12 et 24 h. Les cellules ont été récoltées après traitement et mises en suspension dans un tampon de lyse cellulaire sur de la glace pendant 1 h. Le mélange a été placé dans une centrifugeuse à 11 000g à 4°C pendant 10 min, et le surnageant contenant la protéine cellulaire totale a été collecté. La concentration totale de protéines dans le surnageant a été déterminée en utilisant la méthode BCA. La protéine a ensuite été remise en suspension dans le tampon de charge et bouillie à 100°C pendant 10 minutes. Des échantillons contenant des quantités égales de protéines (40 pg/piste) ont été soumis à une SDS-PAGE (gels de tricine à 10 %). Ils ont ensuite été transférés sur des membranes de nitrocellulose (NC) à 100 V pendant 1,5 h et bloqués en utilisant du lait écrémé à 5% dans une solution saline tamponnée au Tris avec 0,1% de Tween-20 (TBST) pendant 1 h. Ensuite, la membrane NC a été incubée avec les anticorps primaires et le second anticorps, respectivement. Les bandes de protéines cibles ont été visualisées sur la membrane à l'aide des réactifs de détection de western blot ECL. La β-actine a été utilisée comme contrôle interne du chargement et du transfert égaux des protéines. L'expression des protéines a été quantifiée par Quantity-One Software, et le taux d'expression a été marqué sous la bande [33].

Modèle animal

Des souris nudes mâles BALB/c (~ 17 g) ont été achetées au Centre de recherche animale modèle de l'Université de Nanjing et élevées dans un environnement axénique (animaux exempts d'agents pathogènes spécifiques). Les modèles tumoraux ont été établis par injection sous-cutanée de suspension cellulaire (cellules SGC-7901, 100 μL, 1 × 10 ⁶ /mL) dans l'épaule des souris nude. Des images lumineuses de la tumeur ont été générées 15 jours après l'injection sous-cutanée des cellules tumorales. Toutes les expérimentations animales ont été menées conformément aux protocoles approuvés par l'Anhui Agricultural University Laboratory Animal Center (numéro de permis :SYXK 2016-007). Un pied à coulisse a été utilisé pour déterminer le diamètre longitudinal maximal (longueur) et le diamètre transversal maximal (largeur) de chaque tumeur. Le volume tumoral a ensuite été calculé en utilisant la formule longueur × largeur ² × 0,5 [34].

Étude anticancer In Vivo

Des tests de suivi ont été effectués lorsque le volume tumoral a atteint 50 mm ³ . Des souris réparties au hasard en cinq groupes ont été soumises aux traitements intraveineux suivants :PBS (100 μL), Morin, Morin-liposomes, Au-Apt et Apt-Au@MSL. Les souris ont été injectées par voie intraveineuse dans la queue à une dose de 2µmg/kg du matériel à traiter. Les tailles des tumeurs des souris ont été mesurées après 24 jours. Le poids corporel et la survie des souris ont également été déterminés. Les souris ont été euthanasiées et les tissus tumoraux et organiques des souris ont été collectés pour la coloration H&E [35, 36].

Après blocage et perméabilisation, les lames tumorales ont été lavées avec du PBS, colorées avec le test TUNEL et soumises à une contre-coloration DAPI. Les images de fluorescence ont été obtenues par CLSM. Pour l'imagerie DAPI, Ex = 358 nm et Em = 461 nm, et pour le test TUNEL, Ex = 450–500 nm et Em = 515–565 nm [37].

Test d'évaluation de la toxicité

Pour évaluer la toxicité du traitement Apt-Au@MSL sur les organes vitaux, les souris des quatre groupes de traitement ont été sacrifiées après 30 jours. Les organes importants (foie, rate, reins, cœur, poumons et tumeur) des souris de tous les groupes ont été collectés et colorés avec H&E. Des échantillons de sang ont également été prélevés et la glycémie a été mesurée. De plus, les poids des souris ont été déterminés [38].

Résultats et discussion

Caractérisation

La présente étude visait à développer un nouveau liposome qui possède les avantages des nanoparticules (Apt-loaded Au NPs) et peut être utilisé efficacement comme agent anticancéreux. Les propriétés de base des nouveaux liposomes sont importantes pour mener d'autres études. Apt-Au@MSL a été synthétisé comme décrit dans une étude précédente [23], avec des modifications mineures, puis caractérisé par différentes méthodes (Fig. 3). La figure 3b présente les résultats de la spectroscopie UV-vis, qui montre le pic caractéristique et peut surveiller la formation de NP Au. Des pics caractéristiques ont été observés dans le spectre UV-vis des NP Au à environ 530  nm. Plus précisément, l'analyse des spectres UV-vis a montré une forte absorbance UV, qui a été influencée par la modification de surface Apt. Les mêmes résultats ont été observés. Les pics caractéristiques ont été déplacés après que les liposomes sensibles au pH ont été recouverts de Morin. Le pic caractéristique de l'Apt-Au@MSL fabriqué était situé à 362 et 550  nm. Ces résultats indiquent que la synthèse a été achevée avec succès. Pour une caractérisation plus poussée, une spectroscopie FT-IR a été réalisée pour vérifier les résultats de la synthèse. Le décalage vers le rouge des pics caractéristiques de Morin-liposomes et Apt-Au@MSL a en outre indiqué la modification réussie de Morin (Fig. 3c). Nous avons effectué un test de libération de Morin dans du PBS à différents niveaux de pH pour déterminer la sensibilité au pH d'Apt-Au@MSL. Ces trois valeurs de pH simulent l'environnement neutre de la circulation sanguine, l'environnement légèrement acide de la tumeur et l'environnement acide du corps intracellulaire. Le pourcentage de libération de Morin a été détecté par spectroscopie UV-vis. À pH 5,0, environ 54 % de Morin ont été libérés dans les 24 h, et une libération continue a été observée dans les 96  h suivantes; pendant ce temps, à pH 7,4, seulement environ 10 % de Morin a été libéré en 24  h. Ces résultats montrent qu'Apt-Au@MSL présente une bonne stabilité dans des conditions physiologiques normales, empêchant les fuites de médicament ; cependant, le médicament est libéré rapidement dans le corps nucléaire. Ce comportement de libération du médicament peut améliorer efficacement l'effet du traitement (Fig. 3d). MET et SEM ont été menées pour élucider les structures du liposome et Apt-Au@MSL (Fig. 3f). MET a été menée pour élucider les structures des AuNPs. Comme le montre la figure 3g, les AuNP ont une taille de particule d'environ 10  nm, ce qui est cohérent avec la taille de la modification sur les liposomes (figure 3g). Les résultats SEM de la figure 3e indiquent que les liposomes bruts forment uniquement des vésicules unilamellaires avec un diamètre non uniforme d'environ 120 nm, ce qui est cohérent avec la taille déterminée par DLS. En revanche, Apt-Au@MSL montre que la morphologie des vésicules hybrides est attribuée à la modification Au-Apt. Le diamètre de 150  nm était également cohérent avec la taille déterminée par DLS (Fig. 3i). Notamment, l'étude MET des interactions entre les liposomes sensibles au pH et Au-Apt a révélé que les NP Au étaient associées presque exclusivement à la bicouche lipidique vésiculaire et localisées à la périphérie des vésicules (Fig. 3h). Les mesures du potentiel sont présentées sur la Fig. 3j, et les potentiels zêta des NPs Au et Au-Apt sont négatifs. Le résultat montre que les NP Au (− 57,1 ± 0,3 mV) et Au-Apt sont chargées négativement (− 31,7 ± 0,2 mV). Apt-Au@MSL a été modifié avec des Morin–liposomes chargés positivement, et le potentiel est passé à 36,4 ± 0,3 mV. L'adsorption de charges positives et négatives est le mécanisme par lequel Au-Apt et Morin-liposomes se lient. De plus, la figure 3k représente l'évolution du taux d'encapsulation de la particule au fil du temps, indiquant la stabilité de la particule sur une période de temps. Comme le montre la figure 3k, le taux d'encapsulation de la particule ne change pratiquement pas en 24  h, ce qui indique que la particule présente une bonne stabilité sur une période de temps. La courbe standard de concentration de Morin versus l'absorbance UV-Vis de Morin a été préparée pour étudier le taux d'encapsulation de Morin-liposome et Apt-Au@MSL. Les résultats ont révélé que l'efficacité de piégeage du Morin-liposome et de l'Apt-Au@MSL peut atteindre 90,2 % et 89,6 %, comme le montrent le tableau S1 et la figure S1

Images de caractérisation. un Illustration schématique de la synthèse d'Apt-Au@MSL. b Spectres d'absorption ultraviolette de Morin, Au NPs, Au-Apt, Morin–liposome et Apt-Au@MSL. c Spectromètres FT-IR de Morin, Morin-liposome et Apt-Au@MSL. d Le comportement de libération du Morin d'Apt-Au@MSL à différentes conditions de pH. e Image SEM du Morin–liposome. f Image SEM de l'Apt-Au@MSL. g Image MET des NP Au. h Image MET de l'Apt-Au@MSL. je Diamètres de Morin-liposome et Apt-Au@MSL déterminés au moins trois fois via DLS. j ζ-Potentiel des NPs Au, Apt-Au et Apt-Au@MSL. k Taux d'efficacité de piégeage (EE%) de Morin-liposome et Apt-Au@MSL

Test d'activité anticancéreuse d'Apt-Au@MSL

In Vitro

Morin présente une activité antitumorale supérieure mais a une faible biodisponibilité en raison de sa faible solubilité dans l'eau. Après que Morin a été encapsulé par des liposomes sensibles au pH et transformé en un matériau soluble dans l'eau, la surface du liposome a été modifiée en utilisant Au-Apt pour obtenir l'effet antitumoral ciblé. La figure 4a montre l'activité anticancéreuse d'Apt-Au@MSL par dosage MTT in vitro. La concentration du médicament est définie par la concentration de Morin. Le groupe traité par Morin n'a montré aucune activité anticancéreuse apparente, par rapport au groupe témoin. Cependant, le groupe traité avec du Morin encapsulé par des liposomes sensibles au pH a présenté une activité anticancéreuse accrue. Le résultat suggère que l'activité antitumorale du Morin-liposomes était supérieure à celle du Morin brut. Simultanément, nous avons constaté que l'activité antitumorale du liposome modifié par Apt (Apt-Au@MSL) était améliorée. Le tableau 1 répertorie les IC₅₀ valeurs de Morin, Morin-liposomes, Apt-Au@MSL et cisplatine. Morin, Morin-liposomes et Apt-Au@MSL ont présenté une large gamme d'activité anticancéreuse sur les cellules tumorales. Ils ont montré une nette préférence pour les cellules SGC-7901 avec une puissance élevée et une faible toxicité vis-à-vis des cellules humaines normales. L'IC₅₀ la valeur d'Apt-Au@MSL était de 15,6 ± 1,5 μg/mL pour les cellules SGC-7901. Ces résultats ont été confirmés par les tests RTCA. Les cellules SGC-7901 ont été cultivées avec Apt-Au@MSL à différentes concentrations; le groupe témoin a été traité avec du PBS et le groupe témoin était composé de Morin et de Morin-liposomes. L'adhérence et l'étalement ont été surveillés à l'aide d'iCELLigence (Fig. 4b). Les résultats étaient largement similaires à ceux obtenus par les tests MTT. L'activité antitumorale d'Apt-Au@MSL était significativement plus élevée que celles de Morin et Morin-liposomes. Apt-Au@MSL pourrait inhiber la prolifération des cellules SGC-7901 avec une augmentation de la concentration. Des changements dans la morphologie cellulaire après le traitement Apt-Au@MSL ont également été observés par microscopie à fluorescence. Comme le montre la figure 4c, les cellules SGC-7901 sans Apt-Au@MSL maintiennent l'intégrité structurelle de la cellule. En revanche, l'intégrité des cellules est compromise après le traitement des cellules avec Apt-Au@MSL à différentes concentrations.

un Viabilité cellulaire des cellules SGC-7901 incubées avec différents matériaux (Morin, Au-Apt, Morin-liposome et Apt-Au@MSL) à différentes concentrations (0, 5, 10, 15, 20 et 30 g/mL). La cellule traitée par PBS a été définie comme groupe vierge. b La courbe de prolifération cellulaire des cellules SGC-7901 a été détectée par le système RT-CES. Les différents composés ont été ajoutés à 10µh. Les concentrations de a , b , et c sont différents Apt-Au@MSL (10, 20 et 30 g/mL), respectivement. c Les images lumineuses des cellules aux différentes concentrations (0, 2,5, 5, 10, 20 et 30 g/mL)

Analyse de la mort cellulaire par apoptose

L'analyse quantitative de l'apoptose a été réalisée par cytométrie en flux en utilisant la coloration Annexine-FITC. Les cellules ont été colorées avec du PI et de l'Annexine V-FITC, puis analysées à l'aide d'un cytomètre en flux CytoFLEX (Beckman Coulter). L'annexine V a été utilisée pour détecter les cellules apoptotiques précoces liées à la phosphatidylsérine exposée, et le marquage PI a été utilisé pour colorer les cellules apoptotiques tardives. Le taux d'apoptose était de 1,57 % pour les groupes témoins. Les cellules traitées avec Morin ont montré un taux d'apoptose de 3,51 %. Apt-Au@MSL à différentes concentrations présentait une capacité d'induction plus élevée avec des taux d'apoptose de 7,44 %, 10,75 %, 15,53 % et 40,77 % (Fig. 5). L'apoptose renforcée a également confirmé l'activité anticancéreuse exceptionnelle induite par Apt-Au@MSL. Le taux d'apoptose des cellules SGC-7901 a augmenté avec l'augmentation de la concentration d'Apt-Au@MSL.

Analyse par cytométrie de flux basée sur la coloration à l'annexine V-FITC/PI de l'apoptose de SGC-7901 après traitement avec différentes méthodes. La concentration de a , b , c , et d est de 5, 10, 20 et 30  μg/mL, respectivement

Étude d'activité anticancéreuse par dosage de fluorescence

L'effet antitumoral sur les cellules SGC-7901 induit par Apt-Au@MSL a été évalué intuitivement par des tests de fluorescence LIVE/DEAD. Après incubation des cellules avec Morin, Morin-liposomes et Apt-Au@MSL à différentes concentrations, elles ont été co-colorées avec le kit LIVE/DEAD pendant 30 min dans des conditions d'obscurité. Sur la figure 6, les cellules du groupe vierge montrent que toutes les cellules de fluorescence vertes représentent des cellules vivantes. Les groupes témoins, comprenant Morin et Morin-liposomes, montrent le nombre de globules rouges fluorescents. Cependant, les cellules qui ont été traitées avec Apt-Au@MSL à différentes concentrations présentaient clairement un grand nombre de cellules apoptotiques. Avec une augmentation de la concentration, les cellules vivantes diminuaient progressivement. Le pourcentage de cellules mortes a augmenté de manière prédominante et la densité cellulaire a diminué. Le résultat a confirmé qu'Apt-Au@MSL peut efficacement favoriser l'apoptose tumorale.

Images microscopiques à fluorescence de SGC-7901 incubées avec différentes concentrations d'Apt-Au@MSL et une brève coloration subséquente. Le groupe blanc était PBS. Le Morin et le Morin-liposome ont été définis comme groupe témoin

Étude d'intégrité cellulaire

Pour confirmer l'influence de l'absorption et du transport de l'Apt-Au@MSL vers la cellule SGC-7901, nous avons effectué un test TEM. Le changement de morphologie cellulaire a été observé par MET. Des images MET ont été réalisées pour observer la structure interne des cellules et fournir une référence pour les mécanismes anticancéreux. Comme le montre la figure 7, les images vierges des cellules SGC-7901 sans traitement ont montré des changements significatifs dans la morphologie et l'apparence des parois cellulaires claires. Dans le groupe témoin (Morin et Morin-liposomes), la morphologie cellulaire a montré des dommages partiels et la région nucléaire s'est contractée. Cependant, des changements significatifs dans la paroi cellulaire et la structure interne ont également été observés après exposition à Apt-Au@MSL. Le cytoplasme a fui et la structure nucléaire est devenue floue. De nombreux fragments cellulaires se sont formés autour des cellules creuses. De plus, les parois cellulaires se sont désintégrées ou ont été détruites. Des profils entiers sont devenus flous, des cellules ont été endommagées et le cytoplasme a fui. Les flèches rouges représentaient la zone Au NP. As the concentration of the Apt-Au@MSL increased, more Au NP regions appeared in the nucleus. This occurrence suggested the release of Morin after Apt-Au@MSL entered the cell interior, hence the appearance of a large amount of Au NPs. These aforementioned results suggest that antitumor activity was associated with compromised cell integrity and nuclear structure.

TEM images of SGC-7901 cells treated with different concentration of Apt-Au-MSL (10, 20, and 30 μg/mL). The blank group was PBS. The Morin and Morin–liposome were set as control group. The red square is the enlarge area. The red arrow point to Au NPs

Molecular Mechanism Induced by Apt-Au@MSL

To explore the molecular mechanism of Apt-Au@MSL-induced apoptosis, we detected the expression levels of caspases and PARP. Activation of caspase-3, -8, and -9 was first detected with specific substrates. As shown in Fig. 8a, Apt-Au@MSL treatment induces dose-dependent activation of caspase-3, -8, and -9. Caspase-9 promotes mitochondria-mediated apoptosis more than does caspase-8, indicating that the mitochondria-mediated apoptosis signaling pathway is dominant. Western blot analysis further confirmed the existence of Apt-Au@MSL-induced apoptosis at the protein level. Figures 8b and c show that after cells are treated with Apt-Au@MSL, activation of caspases and cleavage of PARP shows time and dose dependence (Figs. 8b, c). In Fig. 8d, e, the Western blot analysis confirmed our results. In conclusion, Apt-Au@MSL inhibits the growth of SGC-7901 cells mainly by inducing apoptosis.

Apt-Au@MSL induced apoptosis in SGC-7901 cells. un SGC-7901 cells were treated with indicated concentrations of Apt-Au@MSL for 24 h. Then, the total protein was extracted and incubated with synthetic Apt-Au@MSL substrates for measuring caspase activities. Dose-dependent (b ) and time-dependent (c ) effects of Apt-Au@MSL on PARP and caspases expression. d , e Quantitative analysis of PARP, caspase-7, caspase-9, and caspase-3 expressions. Data are means ± SD, *P < 0,05, ***i>P  < 0.01

Apt-Au@MSL Inhibits Tumor Growth

In Vivo

The in vivo antitumor activities of Apt-Au@MSL were evaluated using an SGC-7901 tumor xenograft model. A comparison of the images of the tumors with those of the control group (Morin and Morin–liposomes) showed that mice treated with Apt-Au@MSL markedly reduced the weight and size of the tumor (Fig. 9a). The relative tumor volume curves and the mice weight curves indicate that the Apt-Au@MSL in vivo exhibits a higher anticancer efficiency (Fig. 9b) than those of the other treatment groups. No significant difference in average tumor volume was indicated between the control group (Morin and Morin–liposomes) and the blank group. The tumor volume of the Apt-Au@MSL group was only nearly a tenth of the blank group and nearly a sixth of the control group. The result indicated that raw Morin and Morin–liposomes at 40 mg/kg exerted no effect on the growth rate of tumors. However, Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth. The body weight of mice in the different groups (PBS, Morin, Morin–liposomes, and Au-Apt groups) showed no marked fluctuation (Fig. 9c) during the treatment period. This result suggested that the treatment was tolerated and caused no acute side effects. Notably, we found that the mice with Apt-Au@MSL treatment showed markedly prolonged survival (Fig. 9d). The surviving mice in this group behaved normally, showing no apparent sign of unhealthy condition. These results demonstrated that the administration of Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth in xenograft mouse models.

un In vivo applications of Apt-Au@MSL and photographs of the mice tumor taken 24 days. A dosage of 2 mg/kg was administrated intravenously for all mice (n = 6–8). b Tumor weight of mice in different groups after 24 days. c Tumor volume index for the different treatment groups. The tumor sizes were measured at the indicated time points. d Survival rate of the mice in different group after tumor inoculation. Data are means ± SD (n  = 6-8). The intravenous injection of PBS was set as blank group (100 μL); the treated by Morin and Morin–liposome were set as control group. In vivo therapeutic effects of Apt-Au@MSL in SGC-7901-bearing mice. Data are means ± SD, *P < 0,05, ***i>P  < 0.01

Histological Analysis of Anticancer Activity

H&E staining of tumor tissue and organ samples was conducted after fixation and treatment. Treatment efficacy with respect to tumor cell death was also evaluated by H&E staining of tumor tissue from different groups. In Fig. 10a, the mice treated with Au-Apt, Morin, and Morin–liposomes show the same extent of thermal damage as that of the mice in the blank group. No apparent apoptosis was observed in the blank group. The tumor tissue sections consisted of tightly packed tumor cells. However, Apt-Au@MSL treatment exhibited the most significant damage to the tumor tissue, with moderate cell apoptosis in the tumor. The result suggested anticancer activity in the mouse models treated with Apt-Au@MSL. To further investigate the ratio of apoptotic cells in tumors tissue in vivo, TUNEL assay was performed for the detection of apoptotic cells. As shown in Fig. 10b, the apoptotic cells in tumors can be stained with green fluorescence to indicate apoptosis. The merged images show fewer green fluorescent regions in the blank group and the control group (Morin and Au-Apt), indicating the presence of fewer apoptotic cells. The cells of the mice treated with Morin–liposomes appear partly apoptotic. Moreover, a large number of green fluorescent regions were observed in the group treated with Apt-Au@MSL, indicating a large amount of apoptotic cells. The results were consistent with that of H&E staining, confirming that Apt-Au@MSL can promote tumor apoptosis in vivo.

un H&E staining analysis of the tumors in mice. Histological analysis of the tumors in mice following different treatments as PBS, Morin, Morin–liposome, Au-Apt, and Apt-Au@MSL group. b Apoptotic cells were detected by a TUNEL assay (green) and co-stained by nuclear staining DAPI (blue)

In Vivo Toxicity Evaluation

The potential in vivo toxicity is often a significant concern for the clinical application of anticancer medicine. To verify the applicability of Apt-Au@MSL in vivo, the mice were evaluated under different treatments (Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL). Blood biochemical assays were also conducted to examine possible changes in the biochemistry of mice after treatment. As shown in Fig. 11a, the blood glucose index for blood function of the Apt-Au@MSL groups was similar to those of the blank and control groups. No difference in body weight was found in each group. A steady increase was observed, indicating that the drug exhibited no toxicity (Fig. 11b). H&E staining of organ sections (Fig. 11c) showed no sign of damage or inflammation in the group treated with Apt-Au@MSL, compared with the blank and control group. This finding indicated that PBS, Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL were negligible side effects in vivo. These results, as well those of H&E staining, further indicate safety in the use of Apt-Au@MSL for tumor treatment.

In vivo toxicity evaluation. un Blood glucose data detected in the mouse toxicity model. b Weight of mice in different groups after 24 days. c Images of H&E-stained major organs. Each value represents the mean ± SD (n = 3)

Conclusions

In conclusion, this study presents the synthesis of an antitumor nanomaterial, Apt-Au@MSL. Apt-Au@MSL exhibited excellent monodispersity and tumor-targeting properties. The polarity of Morin was modified, and the antitumor activity was enhanced. The pH of the solution was 5.0, and the release rate of Morin from Apt-Au@MSL was the maximum in the characterization experiments. Apt-Au@MSL showed that the morphology of hybrid vesicles was attributable to Au-Apt modification. The diameter of 150 nm was consistent with the size determined by DLS. We screened our model cancer cell by MTT assay and found that SGC-7901 cells could effectively suppress proliferation. The IC₅₀ of Apt-Au@MSL was 15.6 ± 1.5 μg/mL for the SGC-7901 cells. Fluorescent flow cytometric assays confirmed that Apt-Au@MSL could be used as an effective anticancer material and induced apoptosis in vitro. The Apt-Au@MSL found in the internal cell, as shown in the TEM images, suggested that Apt-Au@MSL could target the cancer cell. The administration of Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth in xenograft mouse models, as determined from tumor weight testing. H&E staining and TUNEL assay further confirmed that Apt-Au@MSL could promote tumor apoptosis in vivo. Both blood biochemistry testing and H&E staining suggested that these materials exhibit negligible acute toxicity and good biocompatibility in vivo.

Disponibilité des données et des matériaux

The authors declare that the materials, data, and associated protocols are promptly available to the readers without undue qualifications in material transfer agreements. All data generated and analyzed during this study are included in this article.

Abréviations

Apt:

Aptamers

Apt-Au:

Aptamers and Au nanoparticle

MSL:

Morin pH-sensitive liposome

AuNP :

Nanoparticules d'or

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

Apt-Au@MSL:

Aptamers and Au nanoparticle-modified Morin pH-sensitive liposome

PC :

L-α-Phosphatidylcholine

Chol:

Cholesterol

CHEMS:

Cholesteryl hemisuccinate

PVP :

Polyvinylpyrrolidone

IP :

Iodure de propidium

FT–IR:

Fourier-transform infrared spectroscopy

UV–Vis:

Ultraviolet–visible spectroscopy

TEM :

Microscopie électronique à transmission

SEM :

Microscopie électronique à balayage

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

PDI :

Indice de polydispersité

ATCC:

American Type Culture Collection

CLSM:

Microscopie confocale à balayage laser

TUNEL:

TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling

H&E staining:

Hematoxylin-eosin staining

RTCA:

Real-time unlabeled cell analysis