Effets inhibiteurs améliorés de manière synergique de la co-administration de lovastatine et de doxorubicine à médiation par des nanoparticules de pullulan aux cellules de cancer du sein triple-négatives

Résumé

Le cancer du sein triple négatif (TNBC) est un sous-type de cancer du sein sujet à la résistance aux médicaments et difficile à traiter. Dans cette étude, nous avons greffé du pullulane hydrosoluble avec de la lovastatine (LV) pour développer un nouveau conjugué amphiphile, le pullulane encapsulé LV (PLV). Le conjugué PLV a été synthétisé avec trois rapports différents de pullulane à LV et caractérisé par l'infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). Le degré de substitution (DS) de LV en termes de rapport molaire était de 7,87 %, 3,58 % et 3,06 % pour PLV (1/2), PLV (1/3) et PLV (1/4), respectivement, par analyse RMN du proton. Nous avons sélectionné le conjugué PLV (1/2) pour préparer des nanoparticules de PLV chargées de doxorubicine (DXR) (PLV/DXR NP) en raison de ses propriétés supérieures. La taille moyenne et le potentiel zêta des NP PLV (1/2) étaient respectivement de 177,6 nm et - 11,66 mV, déterminés par diffusion dynamique de la lumière, et ceux des NPs PLV/DXR étaient respectivement de 225,6 nm et - 10,51 mV. Le profilage de libération de médicament in vitro a montré que les NP de PLV/DXR libéraient durablement du DXR dans les 72 h, ce qui était plus robuste à pH 5,4 (97,90 %) qu'à pH 7,4 (76,15 %). Dans l'étude de cytotoxicité, les NP PLV/DXR ont montré une plus grande inhibition de la prolifération des cellules TNBC MDA-MB-231 que les cellules non TNBC MDA-MB-453 (IC₅₀ 0,60 contre 11,05 µM). Les NP PLV/DXR chargées en FITC ont été préparées pour étudier l'absorption cellulaire :les deux lignées cellulaires ont montré une absorption des NP en fonction du temps, mais le nombre de NP entrant dans les cellules MDA-MB-231 était supérieur à celui entrant dans les cellules MDA-MB-453 . La co-administration par NP de LV et DXR à base de pullulane pourrait inhiber efficacement les cellules TNBC, ce qui pourrait aider à concevoir un puissant système d'administration de médicaments pour le traitement de la TNBC.

Introduction

Le cancer du sein triple négatif (TNBC) est un sous-type spécial de cancer du sein qui n'a pas de récepteur d'œstrogène (ER), de récepteur de progestérone (PR) et de récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2) et a un pronostic pire que les autres sous-types de cancer du sein [ 1,2,3]. Les thérapies ciblées disponibles dépendent principalement du ciblage de récepteurs spécifiques à la surface de la cellule tumorale. Parce que TNBC manque d'un marqueur de surface spécifique pour le ciblage actif pour le traitement, d'autres approches de ciblage méritent d'être explorées. Par exemple, le ciblage passif, qui implique un effet unique de perméabilité et de rétention améliorées (EPR) sur les tumeurs solides [4], permet à des particules d'une taille spécifique de cibler le site tumoral [5, 6]. Une nanoparticule (NP) est une sorte de vecteur de médicament qui peut profiter de l'effet EPR et s'enrichir en sites tumoraux solides [4].

Récemment, nous avons montré que la lovastatine (LV), l'une des statines lipophiles utilisées pour traiter l'hyperlipidémie [7], inhibe sélectivement le TNBC en ciblant les cellules souches cancéreuses [8, 9]. De plus, nous avons démontré que l'encapsulation de NP peut augmenter l'effet inhibiteur du LV sur le TNBC dans un modèle murin d'implantation de cellules cancéreuses du sein [8]. Nos études, ainsi que les résultats précédents [10, 11], suggèrent que les statines lipophiles, en particulier LV, peuvent être réutilisées comme médicaments anticancéreux pour le traitement TNBC. Cependant, si LV peut surmonter la chimio-résistance ou améliorer les effets thérapeutiques des médicaments chimiothérapeutiques dans TNBC reste inconnue.

La synergie entre le LV et différents types d'agents chimiothérapeutiques tels que la doxorubicine (DXR), le 5-fluorouracile [12], le cisplatine [13] et la 1-β-D-arabinofuranosylcytosine [14] a été rapportée dans différents types de cellules cancéreuses. Le DXR est un composé d'anthracycline avec des caractéristiques complexes de liaison à l'ADN et d'inhibition de la synthèse d'acide nucléique. De plus, le LV induit l'apoptose des cellules cancéreuses de l'ovaire en synergie avec la DXR [15]. De plus, le LV est un inhibiteur direct de la protéine d'efflux P-glycoprotéine [16], une pompe commandée par l'ATP qui peut facilement décharger le DXR dans le compartiment extracellulaire [17, 18]. Ainsi, LV peut augmenter l'effet thérapeutique d'autres agents thérapeutiques, et la combinaison de LV et de ces médicaments peut améliorer l'efficacité thérapeutique contre TNBC.

Les thérapies combinées actuelles sont pleines de défis. D'une part, la chimiothérapie combinée peut être sérieusement limitée par le métabolisme rapide, la faible solubilité dans l'eau et la faible biodisponibilité des médicaments chimiothérapeutiques [19, 20]. D'autre part, avec la pharmacocinétique variable, les propriétés de transport membranaire et la biodistribution non spécifique de différents médicaments, il est difficile d'atteindre des concentrations suffisantes et des ratios spécifiques de médicaments administrés dans des cellules individuelles [21,22,23]. Ces facteurs affectent l'efficacité thérapeutique et le niveau de synergie ou d'antagonisme de l'association. Co-encapsuler deux agents thérapeutiques dans un support de médicament à l'échelle nanométrique est un moyen efficace de surmonter ces défis car il permet aux médicaments chargés dans le support de maintenir un rapport correct pour les effets synergiques [24, 25].

Les nanosupports co-encapsulés comprennent principalement les liposomes, les micelles polymères et les micro- ou nano-sphères [26,27,28,29]. Les micelles polymères, en raison de leurs performances supérieures (par exemple, avec une double charge de médicament conjuguée chimiquement et physiquement encapsulée, une charge de médicament élevée et une biocompatibilité élevée), ont attiré beaucoup d'attention [26, 30]. Dans notre étude précédente, nous avons préparé une série de NP avec du pullulane, un polysaccharide hydrophile à haute biocompatibilité, et étudié les effets de divers facteurs sur leur comportement de libération de médicaments [31]. Dans cette étude actuelle, nous avons préparé une nouvelle micelle polymère PLV avec différents ratios d'alimentation de pullulane et de LV et caractérisé la distribution de la taille, du potentiel zêta et de la morphologie. Nous avons choisi le plus petit NP résultant pour le chargement avec DXR car il était plus susceptible d'être internalisé par les cellules sous le principe de l'utilisation de l'effet EPR. De plus, nous avons mesuré la quantité de chargement de médicament, l'efficacité d'encapsulation et la quantité de libération de médicament des NP PLV/DXR dans des milieux avec différentes valeurs de pH. Nous avons évalué l'absorption cellulaire des NP PLV/DXR chargées de FITC pour examiner l'entrée des NP dans les cellules tumorales et la synergie de DXR et LV en combinaison ainsi que la cytotoxicité des NP sur MDA-MB-231 (TNBC) et MDA-MB -453 cellules (non TNBC) (Schéma 1).

Matériaux et méthodes

Matériaux

Pullulan (200 kDa) était originaire de Hayashibara (Tokyo). Les chlorhydrates LV et DXR provenaient de J&K Scientific (Pékin). Le chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDCI) et la 4-diméthylaminopryidine (DMAP) provenaient de Aladdin Reagent (Shanghai). D'autres réactifs tels que des solvants provenaient de Sinopharm Chemical Reagent Co. (Pékin). Les lignées cellulaires du cancer du sein MDA-MB-231 (TNBC) et MDA-MB-453 (non-TNBC) ont été achetées auprès du Center for Cell Resource, Shanghai Institutes for Biological Sciences. Le réactif CellTiterBlue provenait de Promega (Madison, WI, USA). Le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (Cat#SH30022.01) provenait de HyClone (États-Unis) et le sérum bovin fœtal (FBS) (Cat#04-001-1ACS) provenait de Biological Industries (Israël).

Synthèse du pullulane greffé LV (PLV)

Tout d'abord, le monoester d'acide succinique LV (LV-SA) a été synthétisé par les étapes suivantes. En bref, 0,60 g d'anhydride succinique (SA, 6,0 mmol) et 2,0 g de LV (5,0 mmol) ont été dissous dans 20 mL de pyridine anhydre et agités pendant 48 h à 50 °C. La solution réactionnelle résultante a été lentement versée dans une solution de HCl glacial de 1500 ml de pH 3 sous agitation constante pour précipiter une grande quantité d'un précipité blanc, et le pH de la suspension a été ajusté à pH 3 avec HCl concentré, suivi d'une filtration sous vide . Le précipité a ensuite été lavé avec une solution d'HCl glacial pH-3, puis avec ddH₂ O à neutre pour donner un produit brut. Enfin, le produit brut a été recristallisé à partir d'un système de solvant acétone-eau pour obtenir du LV-SA pur et le rendement était de 72 %. Le PLV a été produit en conjuguant le groupe acide carboxylique de LV-SA avec l'hydroxyle de pullulane à des rapports molaires de LV-SA au pullulane de 1/2, 1/3 et 1/4. En bref, 0,5 g (1,03 mmol) de LV-SA préparé, 0,15 g de DMAP (1,23 mmol) et 0,24 g d'EDCI (1,23 mmol) ont été dissous dans 20 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) et agités à 50 °C pendant 4 h. Le pullulane (0,33 µg, 1/2; 0,50 µg, 1/3; 0,67 µg, 1/4) a été dissous dans du DMSO pour obtenir une solution à 2 % (p/v). Ensuite, la solution de pullulane a été ajoutée lentement à la solution réactionnelle pour la réaction à 50 °C pendant 48 h. Les mélanges réactionnels ont été placés dans des sacs de dialyse (MWCO = 8~12 kDa) et dialysés contre 25 % d'éthanol/eau et eau. Ensuite, les échantillons ont été lyophilisés [32]. Les conjugués PLV avec un rapport d'alimentation différent de LV au pullulane ont été caractérisés par analyse FTIR en utilisant un spectrophotomètre FTIR (pastilles KBr, Nicolet, TM Nexus 470-ESP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Les conjugués PLV ont également été confirmés par ¹ La spectroscopie RMN H (solvant DMSO-d6, BRUKER AVANCE-500, Bruker, Billerica, MA, États-Unis) et le degré de substitution (DS) pour LV pour chaque conjugué ont été calculés.

Préparation et caractérisation des NP

Une quantité de 50 mg de conjugué PLV a été dissoute dans 12,5 µmL de DMSO sous agitation douce à 37°C (pour gonfler complètement le conjugué) pour obtenir 4 µmg/mL de solution de conjugué. Une quantité de 5 mL de solution de conjugué a été diluée à 2 mg/mL avec du DMSO pour dialyse contre 1000 mL d'eau distillée pendant 8 h avec 10 fois d'échanges en utilisant un sac de dialyse (8~14 kDa). Ensuite, la solution a été soniquée à l'aide d'un sonificateur de type sonde (pulvérisateur à cellules à ultrasons GA92-IIDA, Suzhou Jiangdong Precision Instruments) à 100 W avec impulsion (impulsion sur 2,0 s, arrêt 2,0 s) pendant 2 min dans un bain d'eau glacée . Des NP de PLV auto-assemblées ont été obtenues et les échantillons ont été conservés à 4°C. Pour préparer les NPs PLV/DXR, 2 mg de DXR ont été dissous dans 5 mL de DMSO puis ajoutés goutte à goutte dans 5 mL de solution de conjugué, puis les NPs PLV/DXR ont été préparés par la même méthode. Dans une procédure typique de préparation des NP de PLV/DXR chargées de FITC, 1 mg de DXR a été dissous dans 2 mL de DMSO, puis ajouté goutte à goutte dans 2,5 mL de solution de conjugué. Ensuite, 1 mL de solution FITC (0,6 mg/mL) dans du DMSO a été ajouté goutte à goutte, et des NP PLV/DXR chargées de FITC ont été préparées par la même méthode.

Les NP de PLV, les NP de PLV/DXR et les NP de PLV/DXR chargées de FITC ont été filtrés à travers des membranes de 0,45 µm, puis la taille des particules, les potentiels zêta et les indices de polydispersité (PDI) ont été déterminés par diffusion dynamique de la lumière (DLS, Zetasizer 3000 HS, Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni). Les caractéristiques morphologiques des PLV NPs ont été observées par microscopie électronique à transmission (TEM ; Tecnai G2 20 S-Twin, FEI Hong Kong) à une tension d'accélération de 80 kV.

Détermination de la capacité de chargement et de l'efficacité de piégeage

Une solution de PLV/DXR NP (5 mL) a été soniquée pendant 5 min (impulsion à 2,0 s, arrêt 2,0 s) pour libérer le médicament des NP. L'absorbance DXR dans la solution a été mesurée à 480 nm en utilisant un spectrophotomètre UV-visible (Shimadzu UV-2550, Kyoto, Japon) pour calculer les concentrations de médicament. L'efficacité d'encapsulation DXR (EE) et la capacité de chargement (LC) ont été calculées comme suit :

$$ \mathrm{EE}\%=\frac{\mathrm{montant}\ \mathrm{of}\ \mathrm{drogue}\ \mathrm{in}\ \mathrm{NPs}}{\mathrm{montant}\ \mathrm{de}\ \mathrm{total}\ \mathrm{ajouté}\ \mathrm{drogue}}\times 100\% $$ $$ \mathrm{LC}\%=\frac{\mathrm{montant}\ \mathrm{de}\ \mathrm{drogue}\ \mathrm{in}\ \mathrm{NPs}}{\mathrm{NP}\ \mathrm{poids}}\times 100\% $$

Libération de médicament in vitro

Le profil de libération du DXR des NPs PLV/DXR a été mesuré dans une solution tampon phosphate 0,1 µM à 37°C par la méthode de dialyse décrite [33]. Typiquement, 6 mL de PLV/DXR NPs (égal à 139,4 mg DXR) ont été transférés dans une poche de dialyse (MWCO = 3500 Da) puis incubés à 37 °C dans 15 mL de PBS (pH 7,4 et 5,4). À des moments prédéterminés, 3 mL de solution tampon externe ont été retirés et remplacés par 3 mL de PBS frais (pH 7,4 ou 5,4). La quantité de DXR libérée a été mesurée par spectrophotométrie de fluorescence. Le pourcentage de libération du médicament (Q %) a été calculé comme suit :

$$ Q\%=\left({C}_n\times V+{V}_n\sum \limits_{t=0}^n{C}_i\right)/\left({W}_{\mathrm{ NP}}\times \mathrm{LC}\%\right) $$

où W est le poids NP, C _n est la concentration de l'échantillon à Tn , V est le volume total du support de libération, V _n est le volume de l'échantillon (2 mL), et C _i est la concentration de l'échantillon à T _i (i = 0, 0,5, 1,…n heures, les deux V ₀ et C ₀ sont égaux à zéro).

Culture cellulaire

Les lignées cellulaires humaines de cancer du sein MDA-MB-231 et MDA-MB-453 ont été cultivées dans un milieu complet DMEM contenant 10 % de FBS dans des conditions humides de 37 °C, 5 % de CO₂ , et normoxie (21 % O₂ ). Les cellules expérimentales étaient toutes dérivées de cellules en phase de croissance logarithmique.

Cytotoxicité in vitro

Cellules MDA-MB-231 et MDA-MB-453 ensemencées dans des plaques 96 puits (4× 10³ cellules/puits dans un volume de 100 L) ont été cultivés dans des conditions de culture de routine pendant 24 h. Ensuite, des NP de PLV/DXR avec diverses concentrations de médicament (le rapport massique de DXR et de LV était de 8,13) ont été ajoutées et incubées pendant 48 h. Enfin, 20 μL de réactif CellTiter Blue (Promega) utilisé pour mesurer la prolifération cellulaire ont été ajoutés et incubés pendant 1 à 4 h à 37 °C. L'absorbance à 530/590 nm a été mesurée en utilisant un lecteur automatique de microplaques. La viabilité cellulaire a été exprimée en pourcentage de l'absorbance par rapport à celle des groupes témoins sans traitement.

Analyse des effets synergiques in vitro

L'analyse des isoboles a été utilisée pour évaluer quantitativement la synergie et l'antagonisme produits par les médicaments appariés. Selon le principe d'équivalent de dose de Tallarida et le modèle additif de Loewe, une isobole est générée, qui est une ligne pour définir l'effet additif des médicaments appariés [34, 35]. En pratique, comme nous l'avons décrit précédemment [8], nous avons d'abord acquis les courbes dose-effet pour le DXR libre et le LV libre et après avoir transformé la dose et l'effet du médicament, nous avons utilisé la régression linéaire pour obtenir des équations de régression linéaire pour calculer les doses combinées de l'appariement. médicaments donnant un effet spécifié. Les données pour tracer l'isobole sont illustrées dans le tableau 1. Les points sur l'isobole définissent le DXR/LV à différents rapports pour produire un effet maximum de 50 %. Un IC₅₀ de la dose de médicament appariée située en dessous de l'isobole indique un effet synergique, alors qu'une CI₅₀ au-dessus de l'isobole indique un effet antagoniste.

Captation cellulaire in vitro

Les NPs PLV/DXR FITC ont été obtenues par dialyse. L'absorption cellulaire des NPs PLV/DXR FITC a été testée à l'aide d'un lecteur de microplaques à fluorescence. Les cellules MDA-MB-231 et MDA-MB-453 ont été ensemencées (2 × 10⁵ /puits) sur des boîtes de 2,5 cm et incubées à 37 °C pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été incubées avec des concentrations de PLV-DXR FITC NP à 37°C pendant 1, 2 et 4 h. Le milieu de culture a ensuite été retiré et lavé deux fois avec du PBS froid. Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 5 min et montées sur des lames en utilisant un milieu de montage contenant du DAPI. Ensuite, l'absorption cellulaire des NP a été visualisée par microscopie à fluorescence.

Analyse statistique

Les données sont exprimées en moyenne ± SD et ont été analysées par le t de Student test. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives à P < 0,05.

Résultats

Cytotoxicité in vitro et effet synergique du DXR et du LV

Pour évaluer l'effet inhibiteur du LV et du DXR contre la prolifération cellulaire TNBC et non TNBC, la viabilité cellulaire a été évaluée par le test au bleu d'Alamar. Nous avons d'abord déterminé l'effet inhibiteur de LV et DXR sur les deux lignées cellulaires TNBC par un test de drogue libre. Une série de rapports de concentration LV/DXR a été obtenue en fixant la concentration d'un médicament constante et en modifiant celle de l'autre médicament. Pour la lignée cellulaire MDA-MB-231, le LV et le DXR ont tous deux conféré une inhibition dépendante de la concentration, mais le LV a eu un effet inhibiteur significatif à des concentrations allant jusqu'à 3,0 μM (Fig. 1).

L'IC₅₀ les valeurs pour LV sous différents traitements DXR et pour DXR sous différents traitements LV sont présentées dans le tableau 2, et nous avons également tracé ces IC₅₀ (Fig. 2a) pour refléter visuellement l'effet combiné de DXR/LV. L'IC₅₀ pour le DXR libre seul était de 0,865 µM, et celui pour le LV libre seul était de 10,07 µM. Lorsque la concentration de DXR a augmenté de 0,125 à 0,625 μM (augmentation quintuple), l'IC₅₀ pour LV a diminué de 10,92 à 0,28 M (réduction de 39 fois), et lorsque la concentration de DXR a augmenté de 0,625 à 3,125 μM (augmentation de cinq fois), l'IC₅₀ valeur pour LV a diminué de 0,28 à 0,0004085 μM (réduction de 685 fois). De même, lorsque la concentration LV a augmenté de 1,0 à 3,0 μM (trois fois plus), l'IC₅₀ valeur pour DXR a diminué de 1,005 à 0,3033 μM (réduction de 3,3 fois) et lorsque la concentration LV a augmenté de 3,0 à 10 μM (augmentation de 3,3 fois), l'IC₅₀ la valeur pour DXR a diminué de 0,3033 à 0,007196 μM (réduction de 42 fois). Ainsi, pour le même taux d'inhibition de la prolifération cellulaire MDA-MD-231, DXR pourrait réduire considérablement la quantité de LV nécessaire, et LV pourrait également réduire considérablement la quantité de DXR nécessaire. Cette découverte est essentielle pour la chimiothérapie tumorale car le DXR est un médicament chimiothérapeutique très puissant avec des effets secondaires indésirables et doit être maintenu à faible concentration, et le LV a des effets secondaires indésirables minimes [36]. Pour les cellules MDA-MB-453, DXR a montré une inhibition dépendante de la concentration, mais LV n'a montré aucune inhibition significative aux concentrations examinées. De plus, le DXR a eu un effet inhibiteur significatif sur les cellules MDA-MB-453 à des concentrations allant jusqu'à 3,0 µM, ce qui était beaucoup moins efficace que pour les cellules MDA-MB-231 (Fig. 1). Nous avons récemment découvert que la LV inhibait sélectivement un panel de lignées cellulaires TNBC par rapport aux lignées cellulaires non TNBC [8] ; par conséquent, la combinaison de LV et DXR pourrait convenir au traitement des cellules TNBC mais pas des cellules non TNBC.

Pour mieux évaluer quantitativement la synergie de DXR et LV, nous avons utilisé la méthode isobole. Avec différents rapports DXR/LV pour obtenir un effet maximal de 50 % (tableau 1), nous avons tracé une isobole qui indiquait l'effet additif du rapport DXR/LV (Fig. 2b). L'IC₅₀ les doses de DXR/LV à 0,025/7,09, 0,3033/3,0 et 0,625/0,28 (μM/μM) étaient inférieures à l'isobole, ce qui suggère que DXR/LV à ces rapports produirait un effet synergique. Ainsi, cet effet synergique (1 + 1 > 2) permettrait en outre d'atteindre des doses de médicament pharmacologiquement statistiquement minimisées avec une efficacité médicamenteuse maximisée [37]. Ces trois rapports synergiques semblaient représenter ces résultats :(1) une faible dose de DXR (0,025 μM) pourrait mieux améliorer l'efficacité thérapeutique du VG car 0,025 μM de DXR pourrait produire une pente négative plus importante pour la courbe dose-effet du VG (Fig. . 2b); (2) avec une concentration élevée de DXR, l'ajout d'une petite quantité de LV pourrait grandement aider l'effet DXR contre les cellules MDA-MB-231 car l'IC₅₀ pour le DXR seul était de 0,865 μM, mais l'ajout de seulement 0,28 μM de LV a réduit l'IC₅₀ de DXR à 0,625 μM, c'est-à-dire que 0,28 μM de LV a complètement remplacé l'efficacité de 0,24 μM de DXR (Tableau 2) ; et (3) lorsque la dose de LV était environ 10 fois supérieure à celle de DXR, le rapport DXR/LV devrait avoir le meilleur effet synergique car le point (0,3033, 3,0) était le plus éloigné de l'isobole (Fig. 2b).

Synthèse et caractérisation structurelle de conjugués PLV

Les conjugués amphiphiles de PLV ont été synthétisés comme le montre le schéma 2. Le PLV a été obtenu par estérification de pullulane et de LV. Les structures des conjugués PLV ont été confirmées par FTIR et ¹ Spectres RMN H (Fig. 3). Selon l'analyse FTIR (Fig. 3a), des conjugués PLV ont été produits avec succès. Pour les spectres des conjugués PLV, en plus de maintenir les pics caractéristiques du pullulane (1644, 1642 et 1648 cm⁻¹ ), les pics améliorés à 1459 cm⁻¹ et 1360 cm⁻¹ a également montré les pics de vibration de flexion de –CH₃ et –CH₂ –, respectivement, pour LV. De plus, nous avons observé un décalage élevé du nombre d'ondes de -C=O étirant les pics d'absorption (liaison ester dans LV) à 1725 cm⁻¹ des conjugués PLV en raison de la nouvelle liaison ester générée, et ces pics ont été améliorés avec un rapport molaire accru de LV au pullulane (Fig. 3a).

Nous avons confirmé la synthèse réussie des conjugués PLV par ¹ Spectres RMN H (Fig. 3b). Le ¹ Les spectres H-RMN ont montré les pics caractéristiques du pullulane et de nouveaux pics attribués au CH₃ , CH₂ , et les protons CH de la fraction LV à 0,5 ~ 2,7 ppm (cadre rouge), ce qui indique la conjugaison réussie de LV au pullulane. Nous avons utilisé les pics caractéristiques du pullulane à 4,94~5,14 ppm (a) correspondant aux protons de liaison glycosidique -1,6 et -1,4 de C₁ pour définir les unités glucose dans le pullulane [38]. Les signaux à 4.12 ppm (b) correspondaient au proton du C₁₃ en LV. Ainsi, le DS des résidus LV pour 100 unités glucose de pullulane a été calculé par le rapport de C₁₃ protons (4,05~4,15 ppm) de LV en protons de sucre (4,94~5,14 ppm) avec l'équation suivante :DS = I _4.05~4.15 /Je _4.94~5.14 × 100%. Les données DS pour LV se trouvent dans le tableau 3.

Caractérisations des NP PLV

Le conjugué PLV synthétisé pourrait s'auto-assembler en micelles dans une solution aqueuse. La taille moyenne et l'indice de polydispersité (PDI) étaient de 177,2 nm et 0,138, respectivement, pour les NPs PLV (1/2); 189,7 nm et 0,160 pour les NP PLV (1/3) ; et 219,8 nm et 0,050 pour les NP PLV (1/4) (Tableau 3 ; Fig. 4a, b). De plus, le potentiel zêta des NP PLV (1/2), PLV (1/3) et PLV (1/4) était respectivement de − 11,66, − 10,51 et − 8,30 mV. La taille des NP du PLV diminuait avec l'augmentation du DS du LV, sans changement significatif du potentiel zêta. Le changement de taille est principalement attribué au renforcement de l'interaction hydrophobe entre les groupes LV, ce qui entraîne la formation de noyaux hydrophobes plus compacts [39]. Nous avons précédemment étudié les NP pullulanes avec différentes valeurs DS du cholestérol et avons constaté que, dans une certaine mesure, plus le DS hydrophobe du polymère amphiphile est grand, plus la taille des NP formées est petite [33]. Dans cette étude, parce que le DS du groupe hydrophobe LV était plus grand, la taille des NP était également plus petite. De plus, les images MET (Fig. 4c) ont montré que les NP étaient généralement de forme sphérique avec une bonne monodispersité. Les NP PLV (1/2), avec le DS le plus élevé conduisant à la charge LV la plus élevée et à la taille la plus petite, ont été sélectionnées pour les expériences suivantes.

Les NP PLV/DXR présentaient également une morphologie sphérique et une taille plus grande, 225,6 nm, que les NP PLV vides. L'efficacité d'encapsulation et la capacité de chargement des NP PLV/DXR étaient respectivement de 20,92 % et 1,93 %. L'interaction hydrophobe entre le noyau hydrophobe des NP et le groupe hydrophobe du médicament détermine la quantité de chargement de médicament dans les NP. Considérant que la solubilité dans l'eau du chlorhydrate de DXR utilisé dans cette expérience était légèrement plus grande, l'interaction hydrophobe entre le DXR et le noyau hydrophobe des NP était faible, ce qui a conduit à une moindre quantité de DXR réellement encapsulé dans les NP. Pour clarifier davantage l'absorption des NP par les cellules tumorales, le FITC a été chargé dans les NP PLV/DXR. Avec le chargement FITC, la taille moyenne des NP PLV/DXR chargées FITC était de 253,8 nm et le potentiel zêta moyen de − 15,09 mV (Fig. 4d, e).

Libération de médicament in vitro

Pour révéler le comportement de libération de DXR à partir de NP PLV/DXR, les profils de libération de DXR in vitro ont été évalués dans du PBS à pH 7,4 et 5,4, imitant les conditions dans les tissus physiologiques normaux et le microenvironnement intracellulaire, respectivement. Les NP PLV/DXR présentaient deux phases de libération de DXR :une libération rapide au cours des 8 premières heures et une libération prolongée par la suite (Fig. 5), ce qui est cohérent avec le profil de libération des NP typiques. De plus, avec une diminution du pH de 7,4 à 5,4, la libération cumulative de DXR a été accélérée de manière significative jusqu'à 76,15 % et 97,90 %, respectivement, à 72 h. Par conséquent, la libération de DXR à partir des NP de PLV/DXR était dans une certaine mesure sensible au pH, ce qui est particulièrement utile pour améliorer l'efficacité thérapeutique et réduire les effets secondaires in vivo [40].

Captation cellulaire des NP PLV/DXR chargées par FITC

Nous avons obtenu des images de microscopie à fluorescence des cellules MDA-MB-231 (Fig. 6a) et MDA-MB-453 (Fig. 6b) à 0,5, 1 et 4 h, respectivement, après exposition à des NP PLV/DXR chargées de FITC et ont trouvé une augmentation en fonction du temps de l'intensité de la fluorescence rouge et verte de 0,5 à 4 h après le traitement par NP (Fig. 6), ce qui indique une absorption cellulaire dépendante du temps des NP chargées de DXR et FITC, respectivement. De plus, la quantité de FITC entrant dans les cellules MDA-MB-231 était supérieure à celle entrant dans les cellules MDA-MB-453. Une quantification plus poussée de l'intensité de fluorescence a révélé une différence significative dans l'absorption de DXR entre les cellules MDA-MB-231 et MDA-MB-453 à 1 h h après le traitement par NP (Fig. 6c).

Cytotoxicité in vitro des NP PLV/DXR

Après avoir confirmé l'effet inhibiteur du DXR et du LV sur la viabilité des cellules MDA-MB-231 et MDA-MB-453 et démontré l'effet synergique du DXR et du LV, nous avons déterminé la cytotoxicité in vitro des NPs PLV/DXR sur ces deux cellules. lignes. Des cellules MDA-MB-231 et MDA-MB-453 ont été incubées avec des NPs PLV/DXR à une concentration équivalente à celle du DXR libre. La cytotoxicité des NP PLV/DXR augmentait avec l'augmentation de la concentration de DXR et était plus élevée pour les cellules MDA-MB-231 que pour les cellules MDA-MB-453 (Fig. 7a). Cette découverte est cohérente avec la tendance à la cytotoxicité des médicaments libres (Fig. 7b) et indique que le chargement de médicaments libres dans les NP n'a pas affecté le comportement inhibiteur des médicaments. Les NP PLV/DXR avaient un effet inhibiteur plus élevé sur la prolifération de MDA-MB-231 que les cellules MDA-MB-453, ce qui était cohérent avec l'effet inhibiteur préférentiel de LV sur TNBC. L'inhibition de la croissance des cellules MDA-MB-231 était plus importante avec les NP PLV/DXR qu'avec le DXR libre (IC₅₀ 0,6012 vs 0,865 μM), ce qui suggère que les NP pourraient faciliter l'absorption cellulaire et la rétention du médicament chargé à l'intérieur de la cellule, entraînant une cytotoxicité accrue par rapport au médicament libre.

Discussion

Dans cette étude, les NP de PLV/DXR préparées pour le profilage de libération de médicament in vitro ont libéré de manière durable le DXR dans les 72 h, ce qui était robuste à pH 5,4 (97,9 %). Les NP PLV/DXR inhibent plus fortement la prolifération des cellules TNBC MDA-MB-231 que les cellules non TNBC MDA-MB-453. Les deux lignées cellulaires ont montré une absorption des NP en fonction du temps, mais les cellules MDA-MB-231 ont absorbé plus de NP que les cellules MDA-MB-453. Ainsi, la co-administration par NP de LV et DXR à base de pullulane pourrait inhiber efficacement la prolifération des cellules cancéreuses du sein TNBC, ce qui pourrait suggérer un puissant système d'administration de médicaments pour le traitement de la TNBC.

Récemment, l'utilisation des LV dans la prévention et le traitement des TNBC a été reconnue et des études ont en outre montré que la LV inhibe préférentiellement la prolifération des cellules TNBC et induit l'apoptose [10, 41]. Cependant, sur le plan clinique, les LV se trouvent principalement dans des préparations orales, mais d'autres médicaments antitumoraux pour la chimiothérapie, y compris le DXR, sont principalement sous forme d'injection. Cette situation se traduit par une efficacité chimiothérapeutique indésirable pour l'association du LV et d'autres médicaments, pour des difficultés à atteindre le tissu tumoral à la dose et au moment attendus. La formulation du LV en injection est difficile à réaliser en raison de son insolubilité dans l'eau. Par conséquent, les nanosystèmes d'administration sont nécessaires pour que le LV soit utilisé pour une efficacité anti-tumorale et permettent également la co-encapsulation de plusieurs médicaments pour une chimiothérapie combinée plus facile.

Notre groupe a récemment préparé un nanocomposite à base de cérasome pour encapsuler le LV, ce qui a résolu dans une certaine mesure le problème de la solubilité dans l'eau du LV, mais l'efficacité de chargement du médicament n'était généralement pas élevée (5 ~ 6 %) [8]. Zhang et al. développé des nanocapsules conjuguées camptothécine-floxuridine pour charger le LV. Ces nanocapsules, composées de deux médicaments chimiothérapeutiques approuvés par la Food and Drug Administration des États-Unis, ont atteint une capacité de charge médicamenteuse ultra-élevée pour la camptothécine-floxuridine (68,3 %), mais l'efficacité de charge pour le LV était encore faible (2,8 %) [29]. Dans la présente étude, nous avons utilisé le LV pour la modification hydrophobe du pullulane afin d'obtenir des conjugués PLV amphiphiles, puis nous avons préparé des NP PLV/DXR, qui ont non seulement résolu le problème de la solubilité dans l'eau du LV, mais ont également donné une capacité de charge élevée en médicament (15,69 % pour LV et 1,93% pour DXR).

La stratégie consistant à encapsuler deux médicaments antitumoraux ou plus dans un nanosupport a été largement acceptée pour une administration efficace des médicaments [42]. Sui et al. ont utilisé des NP greffées par DXR-pullulan chargeant le sorafénib pour réaliser une chimiothérapie synergique contre le carcinome mammaire murin [30]. Notre étude a utilisé une méthodologie similaire pour les NP PLV/DXR, affichant une efficacité inhibitrice plus élevée pour les cellules MDA-MB-231 par rapport au DXR seul. Cependant, les NP PLV/DXR n'ont pas montré d'effets synergiques, ce qui pourrait être lié au retard de l'endocytose des NP et de la libération du LV, ce qui mérite une étude plus approfondie.

L'indice de combinaison a été largement utilisé pour quantifier les effets synergiques de deux médicaments [43,44,45]. La méthode d'analyse des isobologrammes utilisée dans l'évaluation quantitative des effets synergiques permet d'éviter efficacement les résultats faussement positifs [35]. Dans cette étude, nous avons examiné le rapport de synergie optimal à partir d'une gamme de rapports DXR/LV sur la base d'une analyse d'isobologramme.

Notre recherche fournit une justification pour la conception d'un système de co-administration plus efficace pour provoquer des effets inhibiteurs synergétiquement améliorés sur TNBC. Étant donné que notre travail est préliminaire et basé sur la prémisse que l'effet EPR est réalisable, d'autres études sur l'efficacité in vivo de ce nouveau système de co-administration sur le TNBC à l'aide de modèles de croissance de tumeurs mammaires orthotopiques et de modèles de xénogreffe dérivés de patients sont justifiées.

Conclusion

Dans cette étude, nous avons développé de nouvelles NP chargées de médicaments en greffant chimiquement le LV au pullulane et en encapsulant physiquement le DXR, qui présentait une excellente monodispersité, une capacité de charge élevée en médicament et un bon comportement de libération du médicament. Les NP PLV/DXR ont montré un comportement de libération durable sensible au pH du DXR. Les NP PLV/DXR ont intériorisé et inhibé plus efficacement la prolifération des cellules TNBC MDA-MB-231 que les cellules non TNBC MDA-MB-453. En outre, nous avons démontré l'effet synergique d'un mélange DXR/LV libre, qui fournit un régime de chimiothérapie combiné pour un futur traitement clinique potentiel du TNBC.

Disponibilité des données et des matériaux

Les conclusions tirées dans ce manuscrit sont basées sur les données qui sont toutes présentées et montrées dans cet article.

Abréviations

¹ RMN H :: Résonance magnétique nucléaire du proton
DLS :: Diffusion dynamique de la lumière
DMAP :: 4-Diméthylaminopryidine
DMEM :: Milieu Eagle modifié de Dulbecco
DMSO :: Diméthylsulfoxyde
DS :: Degrés de substitution
DXR :: Doxorubicine
EDCI :: Chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide
EE :: Efficacité d'encapsulation
EPR :: Perméabilité et rétention améliorées
RE :: Récepteur d'oestrogène
FBS :: Sérum fœtal bovin
FTIR :: Transformée de Fourier infrarouge
HER2 :: Récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain
LC :: Capacité de chargement
LV :: Lovastatine
LV-SA :: Monoester d'acide succinique de lovastatine
NP :: Nanoparticule
PDI :: Indices de polydispersité
PLV :: Lovastatine encapsulée dans du pullulane
NPs PLV/DXR :: Nanoparticules de PLV chargées en doxorubicine
RP :: Récepteur de la progestérone
SA :: Anhydride succinique
TNBC :: Cancer du sein triple négatif

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