Nanoparticule de silice décorée de membranes cellulaires cancéreuses chargées de miR495 et de doxorubicine pour surmonter la résistance aux médicaments pour une thérapie efficace contre le cancer du poumon

Introduction

Des études récentes offrent de plus en plus de preuves des corrélations positives entre la multirésistance aux médicaments (MDR) et l'échec de la chimiothérapie [1, 2]. L'un des mécanismes les plus largement reconnus pour la MDR est le transporteur de la cassette de liaison à l'ATP (ABC), parmi lesquels la glycoprotéine P (P-gp) est le plus étudié [1, 3]. Il a été découvert que la P-gp pouvait efficacement pomper les produits chimiothérapeutiques intracellulaires hors des cellules, entraînant une réduction de l'accumulation de médicament intracellulaire, suivie d'une efficacité réduite [4, 5]. L'inhibition de la P-gp a montré des effets bénéfiques pour surmonter la MDR, qui pourrait être une cible potentielle pour lutter contre la MDR.

Les microARN (miARN) sont un type naturel d'ARN non codant. Cependant, les miARN jouent un rôle important dans la régulation de la transfection cellulaire et de l'expression des protéines [6]. En conséquence, il a été rapporté que l'expression de la P-gp est affectée par divers miARN qui dépendent des types de tumeurs [7]. Une étude précédente a révélé que miR495 pouvait réguler efficacement à la baisse l'expression de la P-gp dans les cellules cancéreuses ovariennes et gastriques MDR [8]. Ici, dans cette étude, miR495 a été utilisé pour explorer davantage son rôle dans la régulation de la P-gp dans les cellules cancéreuses du poumon MDR.

En raison des avantages incomparables, tels que des effets secondaires considérablement réduits ainsi qu'une biodisponibilité accrue, les systèmes d'administration de médicaments (DDS) se sont développés au cours des dernières décennies et ont été reconnus comme l'alternative aux médicaments gratuits dans l'administration de médicaments, en particulier dans le traitement du cancer [9,10 ,11,12]. En conséquence, le développement de DDS multifonctionnel capable de vaincre les barrières extracellulaires et intracellulaires complexes de la thérapie anticancéreuse tout en étant adapté au chargement de divers types de médicaments devient l'objectif de la recherche [13,14,15,16]. Les nanoparticules de silice (SLI), en tant que l'un des candidats les plus largement adoptés, ont des vertus polyvalentes telles qu'une préparation facile, une capacité de charge médicamenteuse élevée et une bonne biocompatibilité et sont des nanosupports préférables. Naturellement, le SLI a été utilisé par de nombreux DDS comme nanosupport pour obtenir une efficacité satisfaisante [17, 18].

Cependant, des études précliniques ont révélé que l'administration ciblée de DDS est également vitale pour une thérapie anticancéreuse réussie. Pour obtenir un meilleur effet de ciblage, l'approche la plus couramment adoptée consiste à modifier les ligands de ciblage à la surface du DDS, qui peuvent se lier aux récepteurs correspondants à la surface des cellules cancéreuses [16, 19, 20]. Des petites molécules (poids moléculaire inférieur à 1000 Da) aux anticorps monoclonaux (poids moléculaire supérieur à 10 kDa), il a été rapporté que ces ligands de ciblage étaient appliqués avec succès au DDS [21,22,23]. Cependant, en raison de la nature ectogène de certains ligands ou d'autres raisons, des effets indésirables tels qu'une immunoréaction et une cytotoxicité se sont produits. Ces dernières années, les membranes plasmiques cellulaires sont devenues un autre matériau prometteur non seulement pour modifier la surface des nanoparticules mais aussi pour servir de composant de ciblage biocompatible. Sur la base de l'interaction entre la membrane cellulaire cancéreuse homologue (CCM) et les cellules cancéreuses, il a été démontré que la CCM augmente considérablement la capacité de localisation tumorale du DDS [24, 25].

Afin de combiner la propriété tumorale du CCM et de la P-gp ciblant miR495 dans un DDS pour la thérapie cocktail du cancer du poumon (sélectionné comme cancer modèle dans notre étude), l'amine chargée positivement SLI a d'abord été fabriquée et préchargée avec de la doxorubicine (DOX ). L'amine chargée de DOX SLI a ensuite été chargée de miR495 pour former le noyau de co-livraison (SLI/R-D). Enfin, le SLI/R-D a été décoré avec du CCM chargé négativement (acquis à partir de cellules A549/DOX) pour préparer un DDS de co-administration et de ciblage tumoral (CCM/SLI/R-D). On s'attendait à ce que le CCM puisse spécifiquement guider le CCM/SLI/R-D vers la cellule A549/DOX homogène pour améliorer son effet de ciblage tumoral et augmenter l'absorption intracellulaire. Pendant ce temps, le miR495 publié peut surmonter le MDR de A549/DOX et obtenir un effet anticancéreux synergique avec DOX.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Méthyl thiazolyl tétrazolium (MTT), N Le -(2-aminoéthyl)-3-aminopropyltriméthoxysilane (AEAPS), l'orthosilicate de tétraéthyle (TEOS), la doxorubicine (DOX) et le Triton X-100 ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Le miR495 a été fourni par Cell Biolabs Inc. (San Diego, CA, USA). D'autres produits chimiques et réactifs ont été obtenus auprès d'Aladdin Co., Ltd (Shanghai, Chine) et de pureté analytique.

Culture cellulaire et modèle animal

Les lignées cellulaires A549 (carcinome pulmonaire humain), A549/DOX (lignée cellulaire résistante à la DOX) et NIH3T3 (fibroblaste embryonnaire de souris) ont été cultivées dans du DMEM additionné de 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal (FBS), de pénicilline (100 U/mL), et de la streptomycine (100 U/mL) dans un incubateur à température constante de 37 °C contenant 5% de CO₂ . L'A549/DOX (lignée cellulaire résistante à la DOX) a été établie en incubant des cellules A549 avec une concentration progressivement augmentée de DOX comme indiqué [26]. Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées selon un protocole standard comme indiqué précédemment [27]. Des souris nudes Balb/c mâles (∼  20  g) ont été obtenues auprès de l'Institute of Model Animal, Université de Wuhan (Wuhan, Chine), et ont été élevées avec des protocoles standard. Le modèle de xénogreffe tumorale A549/DOX a été établi sur la base d'un article précédent [28]. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité d'éthique institutionnel du troisième hôpital affilié de l'université Sun Yet-sen.

Modèle de sphéroïde tumoral multicellulaire

Le sphéroïde tumoral multicellulaire (MCTS) a été établi sur la base d'un rapport précédent [29]. En bref, une plaque à 96 puits (Corning, USA) a été recouverte d'une solution d'agarose autoclavée pour créer un tampon de gel. Ensuite, des cellules mixtes A549/DOX et NIH3T3 (1:1) ont été ensemencées dans la plaque et incubées pour former le MCTS. La formation de MCTS a été surveillée au microscope optique (CX 23, Olympus, Japon).

Préparation des CCM/SLI/R-D

La fabrication de l'amine SLI a été réalisée dans une microémulsion eau-dans-huile basée sur le rapport précédent [30]. En bref, une microémulsion eau-dans-huile contenant du DOX a été fabriquée à température ambiante. Ensuite, AEAPS, TEOS et NH₄ OH ont été successivement ajoutés pour déclencher la réaction. Après avoir réagi pendant 24 h, l'amine chargée en DOX SLI a été précipitée en utilisant une quantité excessive d'éthanol et récupérée par centrifugation (3000 rpm, 10  min).

Le miR495 a été dissous dans du tampon HEPES et ajouté goutte à goutte dans la solution aqueuse d'amine chargée de DOX SLI à divers rapports poids/poids (p/p) avec vortex pour obtenir des complexes binaires SLI/R-D [31].

L'isolement du CCM à partir des cellules A549/DOX a été réalisé sur la base du rapport précédent [32]. En résumé, les cellules A549/DOX ont été collectées et concentrées par centrifugation. Ensuite, les cellules ont été dispersées dans un tampon d'extraction et centrifugées encore (10 000g , 10 min), suivie d'une seconde ultracentrifugation (100 000g , 60 min) pour finalement obtenir le CCM. Toutes les procédures ont été réalisées à 4°C. La concentration en protéines du CCM a été quantifiée à l'aide d'un kit BCA (Beyotime, Shanghai, Chine).

Le revêtement de CCM sur SLI/R-D a utilisé un protocole similaire à celui de la liaison miR495. En résumé, différents volumes de solution de CCM ont été ajoutés à SLI/R-D (1 mg/mL) sous vortex. Enfin, le mélange a été traité par sonication de type probe (100 W, 5 min) puis centrifugé (10 000g , 10 min) pour obtenir le CCM/SLI/R-D.

Caractérisation

La distribution de taille et le potentiel zêta de CCM/SLI/R-D ont été évalués par un Zetasizer (ZS90, Malvern, Royaume-Uni). De plus, le microscope électronique à transmission (TEM, JEM1230, JEOL, Japon) a été appliqué pour observer la morphologie des nanoporteurs.

La capacité de liaison de SLI à miR495 a été étudiée par essai de retard de gel avec miR495 nu comme témoin. Le SLI/RD formulé à divers rapports p/p (0,2–25, SLI à miR495) a été chargé sur du gel d'agarose à 2 % contenant du Goldview (Solarbio Science &Technology Co., Ltd., Pékin) et soumis à une électrophorèse dans 0,5 × Tris-Borate -Tampon EDTA (90 V, 60 min). La visualisation de miR495 a été réalisée à l'aide de l'analyseur Gel-Pro (Genegenius, Syngene, Royaume-Uni).

Le tampon de lyse (Beyotime, Shanghai) a été utilisé pour extraire la protéine totale du CCM, après quoi le kit BCA a été utilisé pour la quantification de la concentration. Ensuite, les échantillons ont été transférés sur une membrane de poly(fluorure de vinylidène) (PVDF). Enfin, la membrane a été colorée avec les premiers anticorps correspondants (Abcam, USA) et les seconds anticorps (Abcam, USA). Le densitomètre (E-Gel Imager, Thermo-Fisher, USA) a été utilisé pour la visualisation.

Le contenu de chargement de médicament (DLC) de CCM/SLI/R-D a été déterminé en faisant émerger les nanocarriers préparés dans du méthanol pendant 48 h. Les échantillons ont été centrifugés (10 000 rpm, 30 min), et les surnageants ont été collectés pour la détermination de la DOX par chromatographie liquide haute performance (HPLC) [33]. La charge miR495 a été déterminée par absorbance UV à 260 nm (UV5Nano, METTLER TOLEDO, Suisse).

Les changements de taille des particules de CCM/SLI/R-D dans le PBS et le plasma de souris ont été enregistrés à chaque instant dans les 48 h. Le profil de libération de DOX de CCM/SLI/R-D a été étudié selon le rapport précédent [34].

Transfection intracellulaire

Les cellules A549/DOX ont été ensemencées dans des plaques 6 puits pendant 24 h puis cultivées avec CCM/SLI/miR495 (concentrations miR495, 1–25  ng/mL) pendant 48 h. Ensuite, les cellules ont été détachées, récoltées et soumises à une analyse western blot de l'expression de la P-gp.

La concentration intracellulaire du médicament a été déterminée selon le rapport précédent [23]. En bref, après avoir été traitées avec CCM/SLI/miR495 pendant différents intervalles de temps, les cellules A549/DOX ont été incubées avec DOX. À des intervalles de temps prédéterminés (4 et 8 h), les cellules ont été détachées, collectées et dispersées dans 5 mL de solution d'extraction DOX (éthanol 0,6 M HCl, 1:1, v/v), suivies d'une ultrasonication à 400  W dans un bain de glace pour 40 fois. Le mélange a été laissé à 4°C pendant 24 h et centrifugé à 12 000 rpm (4 °C) pendant 10 min. Le surnageant a été collecté et soumis à une mesure de la teneur en DOX comme décrit ci-dessus.

Viabilité de la cellule

L'effet de cytotoxicité des nanosupports sans médicament (10-200  μg/mL) et CCM/SLI/RD (concentration DOX, 2-50  μM ; la concentration miR495, 10-250 nM ; le rapport molaire entre DOX et miR495 a été fixé à 200) sur des cellules A549/DOX pendant 48 h a été déterminée par dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT). Les variations de niveau des protéines liées à l'apoptose ont également été déterminées à l'aide d'un test Western Blot.

Des MCTS d'un diamètre de 300 à 400 m ont été incubés avec le milieu contenant différentes formulations (concentration en DOX, 25 M) à 37 °C pendant 5 jours. Un microscope optique a été utilisé pour enregistrer les changements de diamètre du SCTM.

Ciblage In Vitro et In Vivo de CCM/SLI/R-D

L'ARNsi marqué au FAM a été adopté pour construire le DDS. Les cellules A549/DOX ont été ensemencées dans des plaques 6 puits pendant 24h. Ensuite, les cellules ont été incubées avec un excès de CCM pendant 2 h, et SLC/siRNA et CCM/SLC/siRNA ont été ajoutés. Aux intervalles de temps définis, les cellules ont été collectées et déterminées par cytomètre en flux (FCM, FC500MCL, Beckman Coulter) pour la quantification.

Le miR495 marqué au Cy5 a été adopté pour construire le DDS. Les souris porteuses d'une tumeur A549/DOX ont été administrées par voie intraveineuse. injecté avec SLI/miR495 et CCM/SLI/miR495, et la distribution de miR495 a été surveillée à des intervalles de temps prédéterminés à l'aide d'un système d'imagerie en temps réel (ZEWTON 7.0, Vilber, France). Après administration pendant 12 h, les tumeurs et les principaux organes ont été obtenus à partir des souris sacrifiées et imagés en utilisant le même système pour l'analyse analytique.

Test anticancéreux in vivo

Le test anticancéreux in vivo de CCM/SLI/R-D a été évalué en utilisant des souris porteuses de tumeurs A549/DOX. Dans le détail, les souris ont été réparties au hasard en 5 groupes (n = 6) :(1) solution saline (comme contrôle), (2) DOX libre, (3) CCM/SLI/DOX, (4) CCM/SLI/miR495 et (5) CCM/SLI/R-D. Ensuite, les souris ont reçu par voie intratumorale les formulations à la dose de 5 mg/kg de DOX et de 0,25  mg/kg de miR495 7 fois en 14 jours. Les volumes tumoraux et le poids corporel des souris de chaque groupe ont été déterminés tous les 2 jours.

Résultats et discussion

Préparation des CCM/SLI/R-D

Pour obtenir une bonne capacité de charge de médicament et une bonne biocompatibilité dans un DDS, l'hydrolyse synchrone du TEOS et de l'AEAPS dans la microémulsion eau-dans-huile a été utilisée pour la fabrication du SLI. La DOX a été pré-piégée dans la matrice de SLI pendant la fabrication. Comme le montre la figure 1a, le résultat de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) a démontré que l'amine chargée en DOX SLI avait un diamètre d'environ 100  nm. L'image MET a en outre révélé que les nanoparticules étaient de forme sphérique avec une distribution étroite, ce qui était conforme aux résultats obtenus par DLS.

un Changements de taille et de potentiel zêta de SLI/R-D à différents rapports w/w. b Le dosage de liaison au miARN des complexes binaires SLI/R-D à divers rapports w/w. Les données ont été présentées sous forme de moyenne  ± SD (n = 3)

L'amine chargée de DOX SLI avait un potentiel de surface de 26,83  mV, ce qui était bénéfique pour servir de support miR495. Selon un rapport précédent [31], l'assemblage de miR495 et de SLI pour former des complexes binaires était entraîné par une interaction électrostatique. Le w/w SLI à miR495 dans les complexes binaires exerce un impact significatif sur l'efficacité de la transfection finale. Comme le montre la figure 1a, en raison du fait que miR495 est une macromolécule chargée négativement, à faible rapport poids/poids de SLI à miR495, les complexes binaires ont montré une charge de surface négative avec une taille de particule significativement augmentée, ce qui pourrait être dû à l'adhésion des nanoparticules voisines. Cependant, avec l'augmentation du rapport poids/poids, la charge de surface des complexes binaires est progressivement devenue positive avec une granulométrie stable observée aux alentours de 100 nm. Il a été montré que lorsque le rapport poids/poids atteignait 20, la taille des particules et le potentiel de surface des complexes binaires restaient stables sans changement significatif avec l'augmentation du rapport poids/poids.

Les capacités de liaison et de protection des nanocarriers à miR495 sont vitales pour la livraison de gènes. La capacité de liaison miR495 de SLI a été évaluée par un test de retard de gel. Comme le montre la figure 1b, le miR495 nu n'a montré aucun retard tandis que l'ajout de SLI a considérablement modifié le comportement du miR495. Il a été observé que le SLI montrait une capacité croissante de liaison au miR495 avec l'augmentation du rapport poids/poids, ce qui a permis d'obtenir un retard complet du miR495 au rapport poids/poids de 5.

Pour résumer, il a été déduit que les complexes binaires au rapport poids/poids de 20 avec une taille de particule appropriée et une charge de surface souhaitable, ainsi qu'une propriété efficace de liaison et de protection du miR495, étaient la formulation optimale qui a été sélectionnée comme modèle pour effectuer les expériences suivantes.

Ensuite, nous avons exploré le rapport optimal de la protéine CCM aux complexes binaires en mélangeant le CCM avec des complexes binaires à différents rapports de masse (SLI à la protéine CCM, w/w). Le rapport optimal a été déterminé par la taille des particules résultantes et la charge de surface dans différentes conditions. Comme le montre la figure 2a, l'ajout de CCM (charge négative) a entraîné une fluctuation significative de la taille du produit mais une diminution continue de la charge de surface. Les résultats ont indiqué que le CCM était ancré avec succès à la surface des complexes binaires. Plus important encore, il a été observé que la taille des particules et la charge de surface de CCM/SLI/R-D ont atteint un plateau au rapport de masse de 7,5 et que le CCM supplémentaire a montré un impact insignifiant sur les charges de surface et seulement une légère augmentation de la taille. Pour être précis, le diamètre de la nanoparticule a atteint 121,28 ± 3,36 nm et le potentiel zêta est passé à − 28,04 ± 2,64 mV, ce qui était similaire à la charge de surface du CCM libre (− 27,95 ± 3,06 mV), suggérant que la décoration du CCM atteint la saturation dans cette condition. En conséquence, le CCM/SLI/R-D au rapport de masse de 7,5 a été sélectionné comme formulation modèle pour effectuer les expériences suivantes.

un Changements de taille et de potentiel zêta de CCM SLC/R-D à différents rapports w/w. L'image insérée était une analyse de boulon western des trois protéines représentatives dans CCM et CCM/SLI/R-D. b La distribution de taille et TEM de CCM/SLI/R-D. Les données ont été présentées sous forme de moyenne  ± SD (n = 3). Barres d'échelle 100 nm

Caractérisation de CCM/SLI/R-D

Des rapports antérieurs ont montré que les protéines du CCM sont capables d'héberger les cellules tumorales homologues lorsqu'elles sont adoptées pour modifier les nanoparticules [35, 36]. Par conséquent, trois protéines membranaires (Na-K ATPase, AT1R et CXCR4) ont été sélectionnées et leurs niveaux d'expression dans CCM ont été comparés avec CCM/SLI/R-D. Comme le montre l'image insérée de la figure 2a, la quantité des trois protéines dans CCM a montré une intensité similaire à celle de CCM/SLI/RD, ce qui a démontré que les protéines intégrées dans CCM ont été héritées de CCM/SLI/RD après revêtement et le perdu ou la dégradation était négligeable au cours de ce processus. Ce résultat a également fourni des preuves solides pour confirmer la construction réussie de CCM/SLI/R-D, ce qui a été bénéfique pour l'augmentation du homing tumoral de CCM/SLI/R-D.

La distribution de taille et la morphologie de CCM/SLI/R-D ont également été étudiées en utilisant DLS et TEM. Comme le montre la figure 2b, le DLS a révélé que le CCM/SLI/RD était étroitement distribué à environ 120  nm tandis que le TEM a montré que le CCM/SLI/RD était caractérisé comme une structure de coque de noyau sphérique et qu'une bicouche lipidique pouvait être clairement observée sur la surface couche.

Le DLC de DOX dans CM/SLI/R-D (déterminé par HPLC) pourrait atteindre 17,96 %, et la charge miR495 (déterminée par spectrophotomètre UV) pourrait atteindre 1,64 %.

Des études antérieures ont conclu à plusieurs exigences préliminaires pour l'administration sûre de molécules médicamenteuses. Tout d'abord, le DDS adopté doit être maintenu stable sans variations de taille dramatiques dans des environnements physiologiques, car la taille des particules a une importance critique pour le devenir in vivo du système [10, 37]. En conséquence, la stabilité dépendante du temps de CCM/SLI/R-D a été étudiée. Afin de déterminer la stabilité colloïdale du CCM/SLI/R-D dans des environnements physiologiques, les changements de taille du DDS dans le PBS (pH 7,4) et le plasma de souris ont été enregistrés jusqu'à 48 h. Comme le montre la figure 3a, CM/SLN/Ce6 a pu maintenir efficacement sa taille pendant toute la plage de test sans variations significatives. Par conséquent, il a été conclu que CCM/SLI/R-D était capable de maintenir un état physiologique stable. Comme le montre la figure 3b, le CCM/SLI/RD pourrait préserver la stabilité à l'état extracellulaire (32,76 % des médicaments étant libérés après 120 h d'incubation), indiquant que pendant le processus de livraison, le CCM/SLI/RD pourrait encapsuler en toute sécurité le molécule de médicament chargée sans induire d'effets indésirables potentiels. Plus important encore, en pénétrant dans les cellules et en étant soumis à l'environnement acide des cellules cancéreuses, les médicaments ont été facilement libérés (75,93 %), ce qui pourrait être attribué à la concentration élevée d'hydrogène qui affaiblit la combinaison médicament-véhicule [6, 38].

un Stabilité colloïdale du LCC/R-A dans du PBS (pH   7,4) et du plasma de souris à 37 °C jusqu'à 48 h. b Profils de libération de médicament de DOX à partir du LCC/R-A dans des milieux de libération dans des conditions extracellulaires et intracellulaires de pH (7,4 et 5,5). Les données ont été présentées sous forme de moyenne  ± SD (n = 3)

Transfection intracellulaire

Afin de révéler la relation entre la transfection de miR495 et l'expression de P-gp, les cellules A549/DOX ont été transfectées avec différentes concentrations de miR495. Par la suite, le niveau d'expression de la P-gp dans ces cellules a été déterminé à l'aide d'un test Western blot. Comme le montre la figure 4a, l'expression de la P-gp a montré une relation négative avec la concentration de miR495, suggérant que le CCM/SLI pourrait être appliqué comme un outil utile pour la livraison de miR495, ce qui est bénéfique pour CCM/SLI/RD pour inverser le MDR dans les cellules A549/DOX. Comme preuve de concept, l'effet de la transfection miR495 sur la variation de l'accumulation intracellulaire de DOX a été étudié plus avant. Après avoir été traitées avec CCM/SLC/siRNA pendant 48 ou 72  h (Fig. 4b), les cellules A549/DOX ont été traitées avec DOX pendant des intervalles de temps variés. Comme le montre la figure 5d, avec un prétraitement CCM/SLC/siRNA pendant 48 h, la fluorescence cellulaire de la DOX dans les cellules A549/DOX a été multipliée par 1,49 (4 h post-incubation) et 1,47 fois (8 h post-incubation) , respectivement. Avec un prétraitement CCM/SLC/siRNA pendant 72 h, la fluorescence DOX intracellulaire dans les cellules A549/DOX a augmenté de 1,63 fois (4 h post-incubation) et 1,85 fois (8  h post-incubation). En conséquence, il a été conclu que le CCM/SLC/siRNA pouvait surmonter le MDR dans A549/DOX en augmentant l'accumulation intracellulaire de DOX par rapport aux cellules non traitées.

un La relation entre la concentration de miR495 et l'expression des protéines P-gp dans les cellules A549/DOX après avoir été traitées avec CCM/SLI/miR495 pendant 48h. b L'accumulation intracellulaire de DOX dans les cellules A549/DOX après avoir été traitées avec LCC/miR495 pendant différents intervalles de temps. Les données ont été présentées sous forme de moyenne  ± SD (n = 3)

Viabilité des cellules A549/DOX traitées avec un support sans médicament (a ) ou un médicament contenant (b ) différentes formulations à différentes concentrations de nanoparticules/médicaments pendant 48 h. c Dosages Western blot de l'expression des protéines caspase-3, cytochrome C et bcl-2 après différents traitements. Les données ont été présentées sous forme de moyenne  ± SD (n = 3). ^** P < 0,01

Dosage anticancéreux in vitro

La cytotoxicité du support sans médicament (CCM/SLI) a été étudiée pour révéler davantage la biocompatibilité du DDS. Comme le montre la figure 5a, après incubation avec CCM/SLI pendant 48 h à la concentration la plus élevée de 200  μg/mL, l'A549/DOX a encore montré plus de 90 % de viabilité, ce qui suggère que CCM/SLI était biocompatible avec des substances toxiques insignifiantes. aux cellules.

Ensuite, le test anticancéreux in vitro a été évalué. Comme le montre la figure 5b, les effets anticancéreux de toutes les formulations étaient positivement liés aux concentrations de médicament. Dans le détail, la viabilité des cellules A549/DOX était encore de 72,6 % à la concentration de DOX la plus élevée (50 µM). Le CCM/SLI/DOX et le CCM/SLI/miR495 dans les mêmes conditions ont atteint une viabilité cellulaire similaire dont respectivement 59,4 % et 63,3 %, ce qui était supérieur à celui de la DOX. Cependant, il a été noté que la viabilité cellulaire pour le traitement CCM/SLI/R-D était significativement réduite à 38,5%. De plus, l'indice CI dans CCM/SLI/R-D a été déterminé à 0,84, suggérant un fort effet synergique de miR495 et DOX sur la destruction des cellules A549/DOX.

Afin de vérifier à nouveau la conclusion, les protéines de régulation de l'apoptose couramment adoptées (caspase-3, bcl-2 et cytochrome-3) ont été évaluées dans différentes formulations. Comme le montre la figure 5c, la quantité de caspase-3 clivée était la plus élevée dans les cellules traitées par CCM/SLI/RD et le niveau de bcl-2 (suppresseur d'apoptose) était le plus faible parmi tous les groupes de test, ce qui confirme davantage l'anticancéreux préférable efficacité du CCM/SLI/RD. De plus, le CCM/SLI/R-D a montré une expression très élevée du cytochrome-3, ce qui suggère que l'apoptose dans ce groupe était liée à des dommages aux mitochondries.

Le MCTS a été adopté pour imiter une tumeur solide et pour évaluer l'effet anticancéreux de différentes formulations. Comme le montre la figure 6a, le volume MCTS dans le groupe DOX libre augmente de manière persistante pendant toute la période d'expérimentation, suggérant que le MDR dans A549/DOX pourrait diminuer de manière significative la cytotoxicité de la DOX. Les systèmes d'administration unique (SLI/DOX et SLI/miR495) ont montré un certain effet de suppression avec une croissance légèrement réduite. Plus important encore, la combinaison de miR495 et de DOX dans CCM/SLI/R-D a montré une efficacité très élevée avec une croissance de volume négative observée à la fin du test. L'image optique de la figure 6b est également parvenue à des conclusions similaires.

Le volume change (a ) et les images optiques correspondantes (b ) du SCTM après différents traitements. Les données ont été présentées sous forme de moyenne  ± SD (n = 3). ^** P < 0,01

Ciblage In Vitro et In Vivo

Pour révéler les raisons possibles de l'effet antitumoral discriminant de diverses formulations, l'absorption cellulaire a été évaluée pour déterminer si la modification du CCM pouvait augmenter positivement la capacité d'internalisation des nanoparticules dans les cellules A549/DOX, car de nombreuses études ont démontré que la modification de surface du CCM peut améliorer la tumeur. -capacité de ciblage des nanoporteurs [39, 40]. Comme le montre la figure 7a, l'intensité de fluorescence intracellulaire a augmenté dans le groupe CCM/SLI/miR49 et SLI/miR495 en fonction du temps, suggérant la relation positive entre le temps et l'absorption cellulaire dans les deux nanoparticules. En outre, il a été noté que des signaux de fluorescence plus élevés ont été observés dans le groupe CCM/SLI/miR495, ce qui était 1,58 fois celui du groupe SLI/miR495 au moment de 6h. Pour vérifier si l'absorption de CCM/SLI/miR495 se faisait via l'endocytose médiée par le CCM, les cellules ont été incubées avec un excès de CCM avant l'ajout de nanocarriers. Il a été observé que l'intensité de fluorescence dans le groupe CCM/SLI/miR495 a continué à diminuer, tandis que l'intensité de fluorescence dans le groupe SLI/miR495 est restée presque au même niveau. Ces résultats ont démontré que le CCM/SLI/miR495 était absorbé par les cellules par endocytose liée au CCM.

un Analyse quantitative de l'absorption intracellulaire dépendante du temps de différentes formulations dans des cellules A549/DOX (prétraitées avec/sans CCM). b Intensité de fluorescence moyenne des tumeurs disséquées et des principaux organes de souris traitées avec SLI/R-A et CCM/SLI/R-A à 48 h post-injection. Les données ont été exprimées en moyenne  ± SD (n = 3). ^** P < 0,01

Le CCM de A549/DOX devait améliorer la capacité de ciblage tumoral de CCM/SLI/R-D sur les cellules isogènes A549/DOX pour augmenter l'accumulation de nanocarriers dans la tumeur. Pour vérifier notre concept, la distribution de SLI/R-D et CCM/SLI/R-D a été surveillée par un système d'imagerie en temps réel. Comme le montre la figure 7b, comme prévu, CCM/SLI/R-D a montré plus d'accumulation dans la tumeur que SLI/R-D. De plus, il a été conclu que le SLI/R-D était distribué dans presque tous les organes (à l'exception du cœur) avec une concentration dans le foie et la rate, ce qui pourrait être dû à leur faible capacité de localisation tumorale. Au contraire, la modification du CCM pourrait réduire considérablement la capture du foie pour faciliter le ralliement amélioré de la cargaison chargée vers le tissu tumoral.

Efficacité antitumorale in vivo

L'efficacité antitumorale in vivo de CCM/SLI/R-D a été réalisée. Après traitement avec DOX ou SLI/DOX, la croissance tumorale des souris a été ralentie. Cependant, CCM/SLI/R-D a eu la meilleure efficacité antitumorale et a entraîné un volume tumoral manifestement réduit de 303 ± 25 mm ³ . De plus, le résultat de la variation du poids corporel des souris dans différents groupes a également montré des résultats intéressants (Fig. 8). Il a montré qu'il n'y avait pas de baisse évidente du poids corporel chez les souris traitées avec CCM/SLI/R-D, suggérant que la capacité de ciblage tumoral de CCM/SLI/R-D pourrait améliorer l'efficacité antitumorale avec des effets indésirables réduits. En revanche, la distribution non ciblée de la DOX libre a provoqué une toxicité systématique chez les souris, ce qui s'est traduit par une diminution progressive du poids corporel en fonction du temps. En résumé, le CCM/SLI/R-D était un DDS tumor-homing supérieur pour le traitement des tumeurs pulmonaires.

The tumor volume (a ) and body weight (b ) of tumor tissue analysis of A549/DOX tumor-bearing Balb/c nude mice after intratumoral administration of different formulations. Data were expressed as mean ± SD (n = 6). ^** P < 0,01

Conclusion

In summary, we successfully constructed a CCM-coated SLI nanoparticle as a DDS to co-delivery miR495 and DOX (CCM/SLI/R-D). The characterization demonstrated that CCM/SLI/R-D showed well distribution with a diameter of 120 nm, which showed high stability as well as pH-responsive drug release. Cellular experiments revealed that CCM/SLI/R-D could realize preferable miR495 delivery which achieved the significant downregulation of P-gp, which finally overcome the MDR in A549/DOX by increasing the intracellular DOX accumulation compared to untreated cells. The CCM/SLI/R-D showed promising tumor-homing capability. Most importantly, the synergetic effect of miR495 and DOX achieved much more potent anticancer effect to mono-delivery DDS or free DOX both in vitro and in vivo.

Disponibilité des données et des matériaux

The data and the analysis in the current work are available from the corresponding authors on reasonable request.

Abréviations

AEAPS:

N -(2-Aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane

CCM:

Cancer cell membrane

DDS:

Drug delivery systems

DLC:

Drug loading content

DOX:

Doxorubicin

HPLC :

Chromatographie liquide haute performance

MCTS:

Multicellular tumor spheroid

MDR:

Multidrug resistance

miRNA:

MicroRNAs

MTT:

Methyl thiazolyl tetrazolium

P-gp:

P-glycoprotein

SLI:

Silica

TEOS :

Orthosilicate de tétraéthyle