Nanofeuilles de disulfure de titane à double fonction ciblées sur les mitochondries et chargées de resvératrol pour la chimiothérapie tumorale déclenchée par photothermie

Introduction

Le cancer reste une maladie mortelle et représente des taux de mortalité élevés dans le monde [1]. La chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l'hormonothérapie restent les principales méthodes thérapeutiques utilisées en pratique clinique [2, 3]. Parmi ces méthodes, la chimiothérapie est une option de traitement largement acceptée par les cliniciens et les patients en raison de son efficacité relativement élevée [4, 5]. La chimiothérapie est associée à certains problèmes graves, par exemple, la résistance aux médicaments, la récidive tumorale et la non-spécificité [5,6,7]. Par conséquent, le développement de nouveaux agents chimiothérapeutiques et de stratégies pour surmonter ces obstacles est d'une grande urgence [8]. Ces dernières années, le chargement d'un médicament anticancéreux sur un support fonctionnalisé qui peut simultanément obtenir une administration ciblée et une libération contrôlée du médicament est devenu une approche populaire pour maximiser l'effet thérapeutique et diminuer les effets secondaires [9,10,11] . Une grande zone spécifique qui peut fournir un meilleur rapport de charge de médicament est essentielle pour un excellent transporteur de médicament [12].

De plus, afin d'améliorer la spécificité du médicament, le support est généralement modifié avec une molécule de ciblage cellulaire, telle que l'acide folique et le glutathion ciblant les récepteurs de surface cellulaire [13,14,15,16,17]. Étant donné que de nombreux médicaments chimiothérapeutiques agissent sur des organites subcellulaires spécifiques, la conception d'un système d'administration spécifique aux organites pourrait remarquablement augmenter l'effet thérapeutique et réduire les effets indésirables [18,19,20]. Par conséquent, la sélection de l'emplacement ciblé à l'intérieur des cellules tumorales est vitale pour le système d'administration du médicament. Les mitochondries ne sont pas seulement une « usine énergétique » de cellules, mais aussi une cible clé des médicaments chimiothérapeutiques qui ciblent les mitochondries pour initier la voie intrinsèque de l'apoptose [21,22,23]. Par conséquent, le développement d'un système d'administration de médicaments anticancéreux ciblant les mitochondries pourrait être vital pour une chimiothérapie anticancéreuse plus efficace. Jusqu'à présent, divers types de systèmes d'administration de médicaments ont été conçus, tels que la silice mésoporeuse, les matériaux à base de carbone et les protéines [17, 24, 25, 26]. Bien que ces supports aient été signalés comme étant efficaces pour l'administration de médicaments et le traitement des tumeurs, davantage de nouveaux systèmes d'administration de médicaments hautement efficaces sont toujours très souhaités.

Dans cette étude, nous avons construit une nanoplateforme d'administration de médicaments ciblant les mitochondries et déclenchée par NIR basée sur du bisulfure de titane bidimensionnel (TiS₂ ) nanofeuillets pour une chimiothérapie tumorale contrôlée et ciblée. TiS₂ est un membre des dichalcogénures de métaux de transition, qui ont une grande surface spécifique [27,28,29]. Après exfoliation par ultrasons assistés par protéines, la surface de TiS₂ nanosheets est modifiable par d'autres molécules fonctionnelles via des interactions covalentes ou non covalentes. De plus, la molécule spécifique aux mitochondries tumorales IR780 (IR-780 iodure) a été choisie pour modifier le TiS₂ nanofeuillets. L'IR780 confère aux nanofeuillets la capacité de ciblage des mitochondries, qui se fait à la fois par le transport actif médié par le polypeptide de transport d'anions organiques et par la fonction de cation lipophile [30, 31]. Il a été rapporté que l'IR780, en tant que cation lipophile, présentait une plus grande accumulation dans les mitochondries des cellules tumorales en raison de l'amplitude élevée du potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules tumorales que les cellules normales [32, 33]. De plus, l'IR780 est également un agent photothermique sensible au proche infrarouge. La nanoplateforme telle que préparée, appelée IR780-TiS₂ , a été confirmé comme étant biocompatible et pouvait charger efficacement le resvératrol (RV) anti-cancéreux (IR780-TiS₂ /RV) [24]. L'IR780-TiS₂ /RV possédait une capacité de ciblage des mitochondries et un effet photothermique. Le NIR a été appliqué comme stimulus externe pour déclencher la libération locale de médicament lors de l'irradiation NIR. Des expériences in vitro et in vivo ont montré que IR780-TiS₂ /RV a un effet chimiothérapeutique très efficace. Une étude plus approfondie du mécanisme a révélé que la mort cellulaire induite par IR780-TiS₂ /RV était via la voie de l'apoptose intrinsèque médiée par les mitochondries. Ce système d'administration de médicaments ciblant les mitochondries (Schéma 1) pourrait être un agent chimiothérapeutique potentiel dans une future application clinique.

Le schéma de préparation de l'IR780-TiS₂ /RV, qui a été utilisé comme système d'administration de médicaments déclenché par NIR pour la chimiothérapie tumorale médiée par la voie intrinsèque de l'apoptose

Matériaux et méthodes

Matériaux

Sigma-Aldrich a fourni l'iodure IR-780 (IR780), TiS₂ poudre, isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (St. Louis, MO, USA). L'albumine de sérum bovin (BSA 98,0 %) a été achetée auprès de BioSharp Co., Ltd. (Corée). Le Cell Counting Kit-8 (CCK-8) a été obtenu auprès de Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd. (Kumamoto, Japon). Les réactifs de culture cellulaire comprenant le milieu DMEM et le sérum bovin fœtal (FBS) ont été fournis par Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Les produits chimiques ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (Shanghai, Chine).

Synthèse de l'IR780-TiS₂ /RV

La première étape a été la préparation de TiS₂ soluble dans l'eau nanofeuillets selon le rapport précédent [34]. Dans le détail, 5 mg en vrac de TiS₂ a été mélangé avec 5 mL d'eau et agité pendant 20 min. Le TiS₂ une suspension d'eau a ensuite été ajoutée dans 5 mg de BSA et a été traitée sous un bain de glace dissocié par ultrasons en utilisant une sonication de pointe de 500  W et 20 kHz (Sonics, VCX130, USA) pendant 6 h. Ensuite, le mélange préparé a été centrifugé à 12 000 rpm pendant 10 min, résultant en TiS₂ nanofeuillets dans le surnageant.

Deuxièmement, TiS₂ les nanofeuillets ont été conjugués à l'IR780. La triéthylamine (TEA) a été appliquée en tant qu'agent fixant les acides. Cinq milligrammes d'IR780 ont été dissous dans 2 mL de DMSO et agités à 60°C pendant 8 h avec l'ajout de TEA. La suspension du mélange a été dialysée dans de l'eau distillée pendant 2 jours, puis centrifugée à 9 000 rpm pendant 8 min pour éliminer le produit agrégé. Le surnageant a été collecté, résultant en IR780-TiS₂ .

Enfin, RV a été chargé sur IR780-TiS₂ . IR780-TiS₂ (1 pg/ml) a été mélangé avec du RV (2 pg/ml, dissous dans du DMSO), qui a été légèrement agité pendant une nuit à température ambiante. Ensuite, le DMSO et le RV libre ont été éliminés par dialyse dans de l'eau distillée pendant la nuit pour donner IR780-TiS₂ /RV. Sur la base de la littérature, le rapport de charge RV détecté par un spectrophotomètre UV-vis (UV-2550, Shimadzu, Japon) et calculé selon l'équation suivante :

où A _un (mg), A _b (mg) et A _c (mg) représentent le VR initial non lié et l'IR780-TiS₂ , respectivement.

Le spectromètre de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) Bruker TENSOR 27 (Bruker Optics Ltd., Coventry, Royaume-Uni) a été utilisé pour détecter la structure chimique du TiS₂ , IR780-TiS₂ , et R780-TiS₂ /RV. Une analyse Brunauer-Emmett-Teller (BET) a été effectuée pour déterminer la surface spécifique des échantillons, calculée à partir de N₂ résultat d'adsorption via un analyseur de surface (Quantachrome ChemBET-3000) basé sur l'équation BET.

Lignée cellulaire et culture cellulaire

Les cellules de cancer du côlon de souris CT26 ont été obtenues auprès de la Chinese Academy of Sciences Cell Bank of Type Culture Collection (Shanghai, Chine). Les cellules ont été cultivées dans des milieux DMEM complets (10% FBS + 90% DMEM) dans un incubateur humidifié avec 5% CO₂ à 37°C.

Localisation in vitro de l'IR780-TiS₂ /RV

FITC a été utilisé pour étiqueter IR780-TiS₂ /RV ou TiS₂ /RV. En bref, FITC a été dissous dans une solution d'éthanol (2,0 mg/mL) et mélangé avec IR780-TiS₂ /RV ou TiS₂ /RV solution aqueuse (1,0  mg/mL) sous une agitation de 4 h dans un environnement sombre à température ambiante. Le mélange a été dialysé dans de l'eau distillée pendant une nuit pour éliminer le FITC et l'éthanol redondants, ce qui a donné un IR780-TiS₂ marqué FITC. /RV ou TiS₂ /Solution VR. Pour confirmer la co-localisation mitochondriale des nanoparticules in vitro, les cellules traitées avec l'IR780-TiS₂ marqué FITC /RV ou TiS₂ /RV pendant 5 h et coloré par le colorant MitoTracker spécifique aux mitochondries. Ensuite, l'internalisation cellulaire de l'IR780-TiS₂ /RV ou TiS₂ /RV a été observé en utilisant un CLSM (Ix81-FV1000, Olympus, Co.). En bref, les cellules CT26 ont été incubées avec TiS₂ marqué FITC /RV et IR780-TiS₂ /RV (avec la même concentration de FITC) pendant 5 h. Ensuite, les cellules ont été traitées avec des solutions MitoTracker Red FM (100 nM) à 37 °C pendant 30 min. Après trois lavages au PBS, les cellules ont été observées par un CLSM. Le logiciel ImageJ a été utilisé pour analyser l'intensité de fluorescence des cellules.

Étude in vitro sur la chimiothérapie tumorale et l'apoptose déclenchée par NIR

4 × 10 ³ cellules/puits Les cellules CT26 dans des plaques de culture à 96 puits ont été traitées avec du RV libre, IR780-TiS₂ , IR780-TiS₂ /RV et TiS₂ /RV avec différentes concentrations de RV pendant 5 h, puis ont été irradiés avec ou sans NIR pendant 3 min (808 nm, 0,3 W/cm ² ). Après une incubation supplémentaire de 24 heures, la viabilité des cellules traitées a été analysée par dosage CCK-8. Les cellules traitées ont également été colorées par Rhodamine123 (Sigma) et analysées par FCM (FC 500 MCL; Beckman Coulter, USA). La détection de l'apoptose cellulaire a également été réalisée par analyse FCM en utilisant le kit de détection d'apoptose Annexin V-FITC/PI (Bender MedSystems, Vienne, Autriche) comme décrit précédemment.

Western Blot

Les cellules CT26 ont été traitées avec du PBS (contrôle), RV, TiS₂ /RV, IR780-TiS₂ /RV et IR780-TiS₂ /RV + NIR (équivalent VR, 30 μg/mL; équivalent IR780, 0.5 μg/mL) pour une incubation de 5h. Après une nouvelle incubation de 24 heures, les cellules ont été collectées respectivement par Western blot, qui était basé sur le protocole rapporté précédemment [23]. Brièvement, les cellules ont été lysées et inhibées par une protéase et du Triton X-100. Une électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium et de polyacrylamide a été utilisée pour récupérer et séparer les protéines qui ont ensuite été transférées sur une membrane PVDF et bloquées en utilisant du lait écrémé à 5 %. Ensuite, les anticorps primaires dilués ont été incubés à 4 °C pendant 12 h, y compris le cytochrome c (1/1000, Boster, Wuhan, Chine), la caspase-3 clivée (1/1000, CST), la caspase-9 clivée (1/ 1000, CST) et d'actine (1/1000, Mouse, Boster, Wuhan, China) puis incubées avec un anticorps secondaire. Enfin, le réactif ECL a été utilisé pour détecter les protéines.

Modèle animal

Pour établir le modèle de tumeur sous-cutanée CT26, 1 × 10 ⁷ Des cellules CT26 (100 μL, dans du PBS) ont été injectées par voie sous-cutanée dans le dos de souris nude Balb/c. Volume tumoral = longueur × largeur ² /2. Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux Directives pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health et approuvées par le Comité d'éthique animale de l'hôpital central de Zhumadian (Henan, Chine).

Biodistribution In Vivo

Biodistribution de l'IR780-TiS₂ /RV chez les souris nudes porteuses de tumeurs a été détectée 24h après l'injection intraveineuse de la queue avec IR780-TiS₂ /RV (150 μL, 6 mg/kg). Les principaux organes, notamment le cœur, le foie, la rate, les poumons, les reins et les tumeurs, ont été pesés et digérés par une solution d'eau régale. La teneur en élément Ti dans ces tissus a été quantifiée par ICP-OES.

Chimiothérapie tumorale in vivo déclenchée par NIR

Les souris porteuses de tumeur CT26 ont été séparées au hasard en six groupes (n = 6), y compris solution saline, solution saline +NIR, RV, IR780-TiS₂ /RV, TiS₂ /RV et IR780-TiS₂ /RV + NIR (équivalent VR, 1 mg/kg ; équivalent IR780, 0,5 mg/kg). La condition d'irradiation NIR est de 808 nm, 0,3 W/cm ² , et 3 min. Pendant 30 jours de traitement, les volumes tumoraux et le poids des souris ont été enregistrés tous les 3 jours. Après le traitement, les organes, y compris le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins de divers groupes, ont été fixés et colorés par H&E.

Analyse statistique

Les résultats ont été présentés sous la forme de la moyenne  ± déviation standard. t de l'étudiant test a été utilisé pour examiner les différences significatives entre les deux groupes. P < 0,05 a été considéré comme significatif et P < 0,01 a été considéré comme très significatif.

Résultats et discussion

Préparation et caractérisation de l'IR780-TiS₂ /RV

Pour préparer IR780-TiS₂ /RV, tout d'abord, TiS₂ biocompatible Les nanofeuillets ont été préparés par une méthode d'exfoliation assistée par ultrasons et par une méthode d'exfoliation assistée par ultrasons, comme indiqué précédemment [34, 35]. Ensuite, IR780-TiS₂ a été synthétisé dans une réaction de substitution entre un atome de chlore d'IR780 et des groupes aminés de BSA absorbés sur le TiS₂ nanofeuillets à l'aide d'un agent fixant les acides TEA. Enfin, l'IR780-TiS₂ la nanoplateforme a chargé le médicament anticancéreux RV par absorption physique. Le schéma de principe de l'IR780-TiS₂ /RV est présenté dans le schéma 1. Fichier supplémentaire 1 :la figure S1 montre l'image MET du TiS₂ exfolié à l'aide de protéines. , qui était une structure de nanofeuillet affichée. Le modèle XRD du TiS₂ des nanofeuillets ont également été détectés, ce qui a indiqué une bonne cristallinité du TiS₂ préparé nanofeuillets, cohérents avec les observations de TEM (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2). Après fonctionnalisation, l'IR780-TiS₂ /RV nanocomposite avait une morphologie semblable à un flocon avec un espacement de réseau de 0,25 nm comme le montre la microscopie électronique à transmission (Figs. 1a, b) et un diamètre moyen d'environ 123,6  nm et un potentiel zêta de − 37,2 mV tel que détecté par Nanosizer (Malvern Instruments) (Fig. 1c, d). Après un stockage de 2 semaines dans de l'eau, du FBS ou du sérum physiologique, la taille moyenne de l'IR780-TiS₂ /RV est resté constant à environ 123 nm (Fig. 1e) indiquant la stabilité de l'IR780-TiS₂ /RV, probablement dû à l'adhérence de BSA sur la surface du TiS₂ nanofeuillets. La figure 1f montre les spectres d'absorbance de l'IR780 libre, du RV libre, du TiS₂ nanofeuilles et IR780-TiS₂ /RV. Le spectre d'absorption de l'IR780-TiS₂ /RV a montré les pics d'IR780 libre et de RV libre, indiquant que l'IR780 et le RV ont été conjugués avec succès avec le TiS₂ nanofeuillets. Le rapport de chargement RV de IR780-TiS₂ était d'environ 112% (W /W ), qui a été obtenu grâce à des interactions non covalentes (par exemple, π –π empilement et interactions hydrophobes). De plus, selon le résultat BET, les surfaces ont été calculées à 15,2 m ² /g et 122,1 m ² /g pour le TiS en masse₂ et TiS₂ nanofeuillets, respectivement. Le TiS₂ exfolié les nanofeuillets présentent une surface BET beaucoup plus élevée que celle du TiS₂ en vrac , qui fournissent une grande zone active pour le chargement du médicament. La charge était probablement élevée en raison de la grande surface spécifique et de l'adhérence de la BSA à l'IR780-TiS₂ nanofeuillets [23]. Pour confirmer davantage que RV et IR780 ont été chargés dans TiS₂ nanofeuillets, les spectres FTIR de TiS₂ nanofeuillets, IR780-TiS₂ , et IR780-TiS₂ /RV ont été mesurés. Dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S6, tous les pics caractéristiques de TiS₂ des nanofeuillets sont apparus dans les spectres FTIR de l'IR780-TiS₂ /RV. De plus, trois nouveaux pics sont apparus (~ 3191 cm ⁻¹ , ~ 1510 cm ⁻¹ , 1230 cm ⁻¹ ) dans le spectre de l'IR780-TiS₂ /RV, indiquant que l'existence de RV et IR780 [36, 37].

un L'image TEM de l'IR780-TiS₂ /RV. b L'image MET haute résolution de l'IR780-TiS₂ /RV. c La distribution des tailles et d distribution potentielle zêta de l'IR780-TiS₂ /RV. e Le changement hydrodynamique de la taille des particules de l'IR780-TiS₂ /RV dans l'eau, le FBS et le sérum physiologique pendant 2 semaines. f Les spectres d'absorption de RV, IR780, TiS₂ nanofeuilles et IR780-TiS₂ /RV

Après une irradiation NIR basse puissance de 3 min (808 nm, 0,3 W/cm ² ), l'IR780-TiS₂ /La température de la solution RV a augmenté proportionnellement à la concentration d'IR780-TiS₂ /RV (0, 5, 10 μg/ml), et le 10 μg/ml IR780-TiS₂ La solution /RV a atteint la température la plus élevée de 47,6°C (Fig. 2a). De plus, IR780-TiS₂ /RV avait conservé son effet photothermique initial même après cinq cycles d'irradiation NIR, tandis que l'IR780 libre montrait un effet photothermique diminué (Fig. 2b). Ces résultats indiquent l'IR780-TiS₂ /RV nanocomposite a une grande photostabilité.

un L'effet photothermique de l'IR780-TiS₂ /RV sous irradiation NIR (808 nm, 0.3 W/cm ² ) pendant 3 minutes. b Changement de température de l'IR780 et du R780-TiS₂ /RV après cinq cycles d'irradiations NIR (808 nm, 0,3 W/cm ² , 3 min). c Le schéma de la libération du VR déclenchée par photothermie. d Cinétique de libération du RV de l'IR780-TiS₂ /RV en tampon PBS (pH = 7,4 et 6,5) avec ou sans irradiation NIR (808 nm, 0,3 W/cm ² ). **P < 0,01, comparé au groupe pH = 7,4 et pH = 6,5

Ensuite, le taux de libération du RV a été mesuré dans diverses conditions de pH et d'irradiation NIR (Fig. 2c, d). Après 24 h, le taux de libération du RV était de 8,56 % dans des conditions physiologiques (pH 7,4), mais il a été significativement augmenté à 16,2 % à pH 6,5, indiquant qu'il peut être amélioré par des conditions faiblement acides. De plus, le taux de libération du RV a de nouveau augmenté de manière significative à 44,8% à pH 6,5 et une irradiation NIR de 3 minutes (808  nm, 0,3 W/cm ² ). Ces résultats démontrent que l'irradiation NIR peut être un stimulus externe contrôlable pour déclencher la libération de RV de IR780-TiS₂ /RV. Cet effet est probablement dû à la chaleur générée par l'IR780-TiS₂ sous irradiation NIR affaiblissant les interactions d'adsorption non covalentes entre RV et l'IR780-TiS₂ superficiel [35]. De plus, en milieu acide, le H+ pourrait modifier la charge de surface du TiS₂ qui modifient l'équilibre hydrophile/hydrophobe des nanoparticules [38, 39].

Localisation in vitro de l'IR780-TiS₂ /RV

Pour étudier l'absorption cellulaire et la distribution intracellulaire d'IR780-TiS2/RV, l'IR780-TiS₂ Les nanoparticules /RV ont été marquées au FITC et un CLSM a été utilisé pour visualiser la fluorescence intracellulaire. Après 5h d'incubation, TiS₂ /RV et IR780-TiS₂ /RV a montré une intensité de fluorescence similaire dans le cytoplasme (Fig. 3a, b), indiquant que les deux nanocomposites pouvaient pénétrer dans les cellules, probablement par endocytose. Cependant, l'IR780-TiS₂ Le nanocomposite /RV présentait une plus grande intensité de fluorescence jaune et verte lorsque le signal FITC était fusionné avec le marquage MitoTracker (Fig. 3a, c). Ces résultats indiquent que IR780-TiS₂ /RV peut cibler les mitochondries avec une grande efficacité. De plus, la distribution de IR780-TiS₂ /RV dans le cytoplasme a été confirmé par MET, qui a montré des nanoparticules retenues dans certaines mitochondries (Fig. 3d). Ensemble, ces résultats confirment fermement que IR780-TiS₂ /RV atteint un bon ciblage mitochondrial, ce qui favorise davantage l'accumulation de médicament mitochondrial, provoquant une toxicité cellulaire immédiate. Le ciblage des mitochondries était probablement médié à la fois par le transport actif médié par le polypeptide de transport d'anions organiques et par la fonction de cation lipophile, qui a fait que les nanoparticules s'accumulaient fortement dans les mitochondries des cellules tumorales [30,31,32,33].

un Les images de fluorescence des cellules CT26 incubées avec TiS₂ marqué FITC /RV ou IR780-TiS₂ /RV pendant 5 h. La fluorescence verte est le signal FITC et la fluorescence rouge est le signal MitoTracker. b L'analyse de l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) correspondante du TiS₂ marqué FITC /RV ou IR780-TiS₂ /RV dans les cellules de la figure 3a. c Le coefficient de co-localisation correspondant du TiS₂ marqué FITC /RV ou IR780-TiS₂ /RV et mitochondries dans les cellules de la Fig. 3a. M signifie mitochondries. **P < 0,01, comparé à TiS₂ /Groupe RV seul

Chimiothérapie tumorale in vitro déclenchée par NIR

Tout d'abord, l'effet photothermique a été évalué in vitro. Après 5 h d'incubation, IR780-TiS₂ /RV a montré une augmentation de température d'environ 17 °C, tandis que TiS₂ /RV a affiché une augmentation de température d'environ 10°C (Fig. 4a). L'effet photothermique a été attribué à l'IR780 et au TiS₂ nanofeuillets. Démonstration de la biocompatibilité en tant que nanoplateforme pour le chargement de médicaments, IR780-TiS₂ n'a présenté aucune cytotoxicité prononcée en dessous de la concentration de 300  μg/ml (Fig. 4b). De plus, le RV avec ou sans irradiation NIR avait un effet de destruction cellulaire dépendant de la concentration similaire (Fig. 4c). À la même concentration de RV, RV a obtenu le meilleur effet de destruction cellulaire lorsqu'il est chargé par IR780-TiS₂ et irradié par NIR par rapport à toutes les autres conditions, c'est-à-dire RV libre, IR780-TiS₂ libre , et RV chargé par TiS₂ (Fig. 4d). Fait intéressant, l'IR780-TiS₂ non chargé plate-forme n'a montré aucun effet anticancéreux remarquable lorsqu'elle est exposée à une irradiation NIR par rapport à celle sans irradiation NIR (Fig. 4d), indiquant que la chaleur générée par IR780-TiS₂ sur le stimulus d'irradiation NIR a été principalement utilisé pour déclencher la libération de médicament qui a ensuite tué les cellules. Ces résultats suggèrent que IR780-TiS₂ /RV peut libérer le RV dans les mitochondries lorsqu'il est déclenché par une irradiation NIR et, ainsi, augmenter remarquablement la concentration locale de RV dans les mitochondries et obtenir un effet inhibiteur de tumeur plus important.

un Les courbes de changement de température de PBS (contrôle), TiS₂ /RV ou IR780-TiS₂ /Cellules traitées par RV sous une irradiation NIR de 3 min (808 nm, 0,3 W/cm ² ). b Cytotoxicité in vitro contre les cellules CT26 traitées avec différentes concentrations d'IR780-TiS₂ . c Viabilité cellulaire des cellules traitées avec RV avec ou sans irradiation NIR (808 nm, 0,3 W/cm ² ) pendant 3 min. d Viabilité cellulaire des cellules traitées avec IR780-TiS₂ , VR, TiS₂ /RV ou IR780-TiS₂ /RV avec ou sans irradiation NIR (808 nm, 0,3 W/cm ² ) pendant 3 min. **P < 0,01, comparé à IR780-TiS₂ /RV sans groupe NIR seul

Le mécanisme de mort cellulaire

Illustrer le mécanisme sous-jacent de la chimiothérapie déclenchée par NIR d'IR780-TiS₂ /RV, nous avons analysé le type de mort cellulaire, le potentiel membranaire mitochondrial (Ψm) et les niveaux d'expression de protéines clés liées à l'apoptose. Tout d'abord, le FCM a été utilisé pour détecter le type de mort cellulaire en utilisant la coloration à l'Annexine V-FITC/PI (Fig. 5a). À la même concentration RV, RV libre, TiS₂ /RV, IR780-TiS₂ /RV et IR780-TiS₂ /RV + NIR pourraient tous induire l'apoptose, principalement en raison de la présence de RV. En effet, il a été rapporté que le RV a la capacité d'induire l'apoptose. Parmi ces traitements, IR780-TiS₂ /RV + NIR a montré le taux d'apoptose le plus élevé de 90,8 %. Les voies de signalisation de l'apoptose ont ensuite été étudiées. Une diminution de m a été rapportée comme l'événement clé de la voie apoptotique mitochondriale (intrinsèque) [40]. À la même concentration RV, IR780-TiS₂ /RV + NIR a diminué m d'environ 85%, ce qui était plus significatif qu'une diminution de Ψm induite par IR780-TiS₂ , TiS₂ /RV avec ou sans NIR, et RV gratuit (Fig. 5b). Cette expérience indique que IR780-TiS₂ /RV + NIR a induit la mort cellulaire qui a été médiée par la voie apoptotique mitochondriale (intrinsèque) [41]. Ensuite, l'expression de protéines critiques pour l'apoptose, en particulier le cytochrome c (cyto c), la caspase 9 et la caspase 3, a été détectée via un test Western blot. Les cellules traitées avec IR780-TiS₂ /RV + NIR a exprimé plus de cytosolique cyto c que ceux traités avec RV, IR780-TiS₂ /RV ou IR780-TiS₂ /RV (Fig. 5c). La translocation du cyto c est l'initiateur le plus important de la cascade des caspases [42,43,44]. Par conséquent, l'expression de la caspase clivée 9 et de la caspase clivée 3 a été considérablement augmentée dans l'IR780-TiS₂ Cellules traitées par /RV + NIR. Ensemble, ces données suggèrent clairement que l'apoptose était médiée par la voie mitochondriale (intrinsèque).

un Apoptose cellulaire des cellules CT26 traitées avec PBS (contrôle), RV, TiS₂ /RV, IR780-TiS₂ /RV et IR780-TiS₂ /RV + NIR par FCM. b Le changement du potentiel membranaire mitochondrial des cellules CT26 traitées avec du PBS (contrôle), RV, TiS₂ /RV, IR780-TiS₂ /RV et IR780-TiS₂ /RV avec ou sans irradiation NIR par FCM. c Expression de protéines liées à l'apoptose dans des cellules CT26 traitées avec du PBS (contrôle), RV, TiS₂ /RV, IR780-TiS₂ /RV et IR780-TiS₂ /RV + NIR. Le cytochrome c, la caspase-3 clivée et la caspase-9 clivée ont été testés par Western blot. **P < 0,01, comparé à IR780-TiS₂ /RV, TiS₂ /RV + NIR et IR780-TiS₂ groupes

In Vivo Chimiothérapie tumorale déclenchée par NIR

Pour évaluer l'efficacité de la chimiothérapie déclenchée par NIR in vivo, des souris porteuses de tumeur CT26 ont été traitées avec une solution saline, saline + NIR, RV, IR780-TiS₂ /RV, TiS₂ /RV + NIR et IR780-TiS₂ /RV + NIR. La taille de la tumeur dans l'IR780-TiS₂ Le groupe /RV + NIR a significativement diminué et la tumeur a presque disparu après 30 jours de traitement, tandis que dans les autres groupes, le volume de la tumeur a montré une tendance à la hausse (Fig. 6a). Au cours du traitement, il n'y avait pas eu de différence significative de poids corporel entre les groupes (Fig. 6b). Enfin, l'imagerie H&E n'a révélé aucune toxicité ou anomalie tissulaire notable dans tous les groupes testés (Fig. 6c). Ces résultats démontrent que l'IR780-TiS₂ /RV nanocomposite a une efficacité anti-tumorale déclenchée par NIR exceptionnelle et une faible toxicité systémique. De plus, la biodistribution de l'IR780-TiS₂ /RV a été évalué in vivo. Comme le montre le fichier supplémentaire 1 :Figure S4, les nanoparticules ont été principalement introduites dans le système hépatique et peut-être métabolisées par le système [45].

un Le profil de croissance des tumeurs CT26 xénogreffées après injection intraveineuse de sérum physiologique (témoin), RV, TiS₂ /RV et IR780-TiS₂ /RV avec ou sans irradiation NIR de 3 minutes (808 nm, 0,3 W/cm ² ). b Poids corporel de souris porteuses de tumeurs après divers traitements. c Images H&E des principaux organes de toutes les souris traitées après 30 jours de traitement. **P < 0,01, comparé à une solution saline, une solution saline + NIR, RV, TiS₂ /RV + NIR et IR780-TiS₂ /Groupes de camping-cars

Conclusion

En résumé, nous avons développé une nanoplateforme ciblant les mitochondries et chargées en RV basée sur TiS₂ nanosheets for a NIR-triggered drug release and enhanced tumor chemotherapy. The as-prepared IR780-TiS₂ /RV with flake-like morphology showed good stability and biocompatibility. Owing to the mitochondria-targeted ability of IR780, IR780-TiS₂ /RV could selectively accumulate in tumor cell mitochondria and where it could release RV when triggered by the NIR irradiation. The released RV facilitated the mitochondrial membrane potential decrease, cyto c release, and, subsequently, initiated a cascade of caspase reactions to promote tumor cell apoptosis through the mitochondrial signaling pathway. In vitro and in vivo results demonstrated that IR780-TiS₂ /RV exhibited an efficacious NIR-triggered tumor chemotherapy without a significant tissue toxicity. These results suggest that IR780-TiS₂ /RV could be a promising chemotherapeutic agent in clinical practice.

Disponibilité des données et des matériaux

The conclusions made in this manuscript are based on the data which are all presented and shown in this paper.

Abréviations

IR780:

IR-780 iodide

BET:

Brunauer-Emmett-Teller

BSA :

Sérum albumine bovine

BSA :

Sérum albumine bovine

CCK-8 :

Cell Counting Kit-8

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

cyto c:

Cytochrome c

DMEM :

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DMSO :

Dimethylsulfoxide

FBS :

Sérum fœtal bovin

FCM:

Flow cytometry

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

FTIR :

Fourier Transform Infrared Spectroscopy

NIR :

Proche infrarouge

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

RV:

Resveratrol

THÉ :

Triéthylamine

TiS₂ :

Titanium disulfide