Liposomes pégylés chargés de bufaline :efficacité antitumorale, toxicité aiguë et distribution tissulaire

Introduction

Bufaline (BF ; 3β,14-dihydroxy-5β,20(22)-bufadienolide, 5β,20(22)-bufadienolide-3β, 14-diol), extraite de Venenum Bufonis , a des activités anti-inflammatoires, cardiotoniques, antivirales, acésodynes et antitumorales [1, 2]. Notre groupe a également révélé que le BF a des effets thérapeutiques sur l'hépatome, le mélanome, le carcinome colique, le gliome et le carcinome épithélial de l'ovaire, ce qui pourrait être attribué à son inhibition de la prolifération cellulaire et à l'induction de l'apoptose cellulaire [3,4,5,6,7] .

Lan et al. [8] ont précédemment établi un modèle de xénogreffe de gliome chez la souris nude, auquel BF a été administré quotidiennement par voie intrapéritonéale (i.p. ) injection. Dans le groupe traité par BF, presque aucun noyau binucléaire et aucune mitose n'ont été observés ; de plus, les nucléoles étaient plus petits et la morphologie cellulaire était plus régulière que dans le groupe témoin. Bien que le BF ait de nombreux effets pharmacologiques potentiels et que les résultats obtenus à ce jour soient prometteurs, le BF en tant qu'agent unique est encore loin d'une application clinique. De plus, le traitement par BF est associé à des effets indésirables et secondaires indésirables tels qu'une immunoréaction, des lésions des tissus normaux et une toxicité élevée [9].

Plusieurs systèmes d'administration de médicaments, tels que les émulsions lipidiques, les nanoparticules et les liposomes, ont été utilisés pour favoriser la solubilité, l'activité pharmacologique et la biodisponibilité du BF [10, 11]. De plus, les auto-assemblages polymères fonctionnels actifs de l'émission induite par l'agrégation (AIE) ont montré un grand potentiel pour diverses applications biomédicales, notamment l'imagerie biologique et l'administration intracellulaire de médicaments [12, 13]. Parmi ces systèmes d'administration de médicaments, les préparations liposomales présentent plusieurs avantages pour une utilisation en tant que systèmes d'administration intraveineuse (i.v.). Les préparations liposomales peuvent non seulement améliorer la solubilité dans l'eau et réduire les effets secondaires des agents chargés [14], mais également transporter les agents à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) afin de traiter la tumeur cérébrale de manière plus efficace et efficiente [15] . La BHE est composée de cellules endothéliales capillaires cérébrales et des jonctions serrées entre elles, de cellules en forme d'étoile, de cellules gliales et de la membrane basale, qui permettent uniquement aux médicaments hautement liposolubles de passer et de se disperser dans le tissu cérébral [16]. Néanmoins, les préparations de liposomes présentent certaines lacunes. L'absorption par les protéines plasmatiques et la reconnaissance par le système phagocytaire mononucléaire provoquent une élimination rapide du médicament chargé du sang. Cependant, la modification de surface des liposomes avec du PEG pourrait résoudre ces problèmes [17].

Dans des recherches antérieures, nous avons préparé des liposomes PEGylés chargés de bufaline (BF/PEG-LP) et caractérisé les mêmes, y compris sa cytotoxicité et ses profils pharmacocinétiques, dans le but de surmonter les défis susmentionnés, d'augmenter l'efficacité de l'administration du médicament et de diminuer la toxicité. Pour étendre cette recherche, nous avons évalué les propriétés physiques et chimiques, l'efficacité antitumorale, la toxicité aiguë et les profils de distribution tissulaire du BF/PEG-LP.

Matériaux et méthodes

Produits chimiques et réactifs

Le BF et la cinobufagine (CBG) ont été achetés auprès de BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (BaoJi, Chine ; pureté à 98 %, identifiée par HPLC) et dissous dans du DMSO pour le stockage à - 20 °C en tant que solutions mères. Le CBG a été utilisé comme étalon interne (IS). La doxorubicine (DOX) a été achetée auprès de Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. (Pékin, Chine ; pureté de 98 %, identifiée par HPLC) et dissoute dans du DMSO pour être stockée à - 20 °C en tant que solutions mères. Les BF/PEG-LP ont été préparés dans notre laboratoire (taille des particules, 155,0 ± 8,46 nm ; potentiel zêta, – 18,5 ± 4,49 mV ; efficacité de piégeage, 76,31 % ± 4,23 %, détecté par HPLC) [6]. L'acide formique de qualité HPLC a été acheté auprès de Tedia Company Inc. (Fairfield, OH, USA). Le kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8) a été acheté auprès de Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japon). L'acétate d'éthyle de qualité HPLC a été acheté auprès du Tianjin Kermel Chemical Reagents Development Center (Tianjin, Chine). L'acétonitrile de qualité HPLC a été acheté auprès de Merck (Darmstadt, Allemagne). Tous les autres réactifs étaient de qualité analytique.

Animaux

Rats mâles Sprague-Dawley, pesant environ 230 à 250  g ; Souris Kunming, pesant entre 18 et 22 µg ; et des souris Balb/c nudes âgées de 6 semaines ont été fournies par le Experimental Animal Research Center, Fourth Military Medical University (Xi'an, Chine). Les animaux ont été maintenus séparément dans un système de cages ventilées individuellement (IVC) et nourris avec de la nourriture et de l'eau de laboratoire standard ad libitum pendant 5 jours. Tous les animaux ont été à jeun (sauf pour l'eau) pendant la nuit avant les expériences. Les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été examinées et approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de la quatrième université de médecine militaire (approbation 2017-0603-R).

Préparation des échantillons standards

Les courbes d'étalonnage ont été préparées en ajoutant 100 L d'homogénat de tissu avec 20 L de chacune des solutions de travail pour produire des échantillons contenant 20, 50, 200, 500 et 2000  ng/mL de BF. Les échantillons d'homogénat standard enrichis ont été préparés à l'avance et évalués avec chaque lot analytique d'échantillons inconnus.

Sécurité des liposomes

Test d'hémolyse des globules rouges

Huit millilitres de sang ont été prélevés sur des rats puis héparinés et dilués avec 10 mL de solution saline normale à 0,9 %. Les échantillons de sang total ont ensuite été mélangés avec 100 μL de solution BF ou 1 mL de suspension BF/PEG-LP. Après 40 min d'immersion dans un bain-marie maintenu à 37 °C, les échantillons ont été centrifugés à 750g pendant 5 min pour éliminer les globules rouges et leurs fragments. Le surnageant a été précipité dans 2 mL de solution éthanol/acide chlorhydrique (39:1 ; éthanol à 99 % (v/v ):37% d'acide chlorhydrique (p/v )). Le surnageant a été centrifugé à 750g pendant 5 min, après quoi l'absorbance a été mesurée à 398 nm par un spectrophotomètre UV. Un contrôle positif constitué d'eau distillée et un contrôle négatif constitué de solution saline à 0,9% ont été préparés et mesurés de la même manière.

Le taux d'hémolyse (HR%) de la suspension de nanoparticules a été calculé comme suit :

où A _échantillon est l'absorbance de l'échantillon, A _négatif est l'absorbance du contrôle négatif, et A _positif est l'absorbance du contrôle positif.

Cytotoxicité des liposomes blancs

La CCK-8 a été utilisée pour détecter la cytotoxicité de liposomes blancs dans des cellules HepG2 de carcinome hépatocellulaire humain et des cellules HCT116 de cancer du côlon humain. Cellules HepG2 en suspension et cellules HCT116 (1 × 10 ⁴ cellules/puits) ont été ensemencées en plaque 96 puits et cultivées par milieu de culture RPMI-1640 jusqu'à la phase logarithmique. Différentes concentrations de liposomes blancs ont été ajoutées au milieu de culture. Six puits répliqués ont été préparés pour chaque concentration. Après 24 h d'incubation, le milieu a été jeté et 100 pl de solution de travail CCK-8 (milieu de culture CCK-8:RPMI-1640, 10:100) ont été ajoutés. Après 2 h d'incubation, l'absorbance a été détectée et quantifiée à 450 nm par un lecteur de microplaques (Bio-Rad 680, Hercules, CA, USA).

Effet du pH environnemental sur la stabilité des liposomes

BF/PEG-LP ont été préparés par hydratation avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à pH 7,4 et pH 5,0, respectivement. Les liposomes ont été stockés à 4°C dans des conditions d'obscurité. L'absorbance des échantillons à 296 nm a été mesurée à 0, 5, 15, 30, 60 et 120 min.

Expérience in vitro

La prolifération cellulaire a été évaluée par le test de prolifération CCK-8. Les cellules HepG2, HCT116, A549 et U251 ont été ensemencées individuellement à une densité de 1 × 10 ⁴ cellules/puits en plaques 96 puits à 37 °C avec 5% (v/v ) CO₂ . Après 24h, différentes concentrations de BF/PEG-LP ont été ajoutées aux puits. Après encore 24 h d'incubation, le milieu cellulaire a été jeté et 100 L de solution de travail CCK-8 ont été ajoutés. Après 2 h d'incubation, l'absorbance a été détectée et quantifiée à 450 nm par un lecteur de microplaques (Bio-Rad 680). Le pourcentage de cellules viables et IC₅₀ les valeurs ont été estimées à partir d'une courbe dose-réponse. Les valeurs de chaque échantillon et contrôle ont été déterminées par la moyenne de six puits répliqués.

Expérience de xénogreffe tumorale

Cellules U251 (1 × 10 ⁷ ) dans 0,15 mL de PBS ont été inoculés par voie sous-cutanée à des souris nude et laissés pousser pendant 7 jours pour atteindre une taille de tumeur de plus de 50 mm ³ . Ensuite, les souris ont été réparties au hasard en deux groupes de six souris chacun. Dans le groupe de traitement, 0,5, 1,0 ou 2,0 mg/kg/jour de BF ou BF/PEG-LP était i.p. injecté pendant 21 jours consécutifs. Du PBS contenant 0,1 % de DMSO a été injecté dans le groupe témoin véhicule, tandis que 2  mg/kg de cisplatine (DPP) ont été injectés dans le groupe témoin positif.

Le poids corporel des souris a été mesuré tous les 2 jours. Toutes les souris traitées avec BF et BF/PEG-LP ont été observées attentivement pour leurs conditions de peau et de cheveux, le volume de la consommation de nourriture et d'eau, les caractéristiques fécales et les changements de comportement. A la fin des expériences, les souris ont été sacrifiées, et les xénogreffes tumorales ont été prélevées et pesées. Les tumeurs transplantées ont ensuite été fixées dans une solution de paraformaldéhyde à 4% et incluses dans de la paraffine. Des sections de cinq microns d'épaisseur ont été préparées et colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E). La croissance et la nécrose des cellules tumorales et l'infiltration des tissus environnants ont été observées en microscopie optique.

Évaluation pharmacologique

Comportement général et activités indépendantes

Cinquante souris Kunming ont été réparties au hasard en cinq groupes (n = 10 par groupe) qui étaient i.p. administré ce qui suit à une dose unique :solution saline au volume administré au groupe témoin, 20 mg/kg de pentobarbital sodique comme groupe témoin positif, et 1,0, 1,5 et 2,0  mg/kg comme faible, moyen et élevé -dose groupes BF/PEG-LP. Le comportement général, la posture, la démarche, la salivation, la myofibrillation, le nystagmus et les sécrétions des souris ont ensuite été observés. Après 1hh d'administration, les souris ont été placées dans une boite open-field. Le nombre de souris se déplaçant dans la boîte a été compté pendant 10 min après que les souris aient été autorisées à s'adapter pendant 1 min.

Tests d'exercice coordonnés

Les souris ont été réparties au hasard en cinq groupes (n = 10 par groupe, moitié mâle et moitié femelle) qui étaient i.p. administré les éléments suivants :solution saline au volume administré au groupe témoin à blanc, 2,5 mg/kg de chlorhydrate de chlorpromazine comme groupe témoin positif ; et 1,0, 1,5 et 2,0 mg/kg de BF/PEG-LP en tant que groupes BF/PEG-LP à dose faible, moyenne et élevée, respectivement.

Une tige métallique lisse (diamètre 1,27 cm, longueur 80 cm) a été placée perpendiculairement au sol et fixée en bas pour se maintenir debout. Après 1 semaine de traitement, le test d'escalade a été réalisé pendant 30, 60 et 120 minutes, respectivement. Les souris ont été placées sur le dessus de la tige de métal et ont pu ramper naturellement. La coordination des souris lorsqu'elles descendaient de la tige métallique a été observée et notée. Les critères de notation étaient les suivants :0 point, descente pas à pas; 1 point, descente glissante; 2 points, impossibilité de descendre; et 3 points, aucun réflexe observé.

Toxicité aiguë

La concentration létale médiane (LD₅₀ ) de BF et BF/PEG-LP a été calculé pour évaluer la toxicité aiguë. Au total, 110 souris Kunming (moitié mâle et moitié femelle) ont été réparties au hasard en 11 groupes (n = 10). Cinq groupes ont reçu un seul i.v. dose de BF à 1,0, 0,37, 0,14, 0,05 ou 0,02 mg/kg, et cinq groupes ont reçu une seule i.v. dose de BF/PEG-LP à 4,0, 2,83, 2,0, 1,41 ou 1,0 mg/kg. Le volume d'injection était de 0,2 µmL. BF a d'abord été dissous dans une solution saline normale avec 1% de DMSO; BF et BF/PEG-LP ont ensuite été dilués avec une solution saline normale pour obtenir la concentration souhaitée. Le groupe témoin a reçu une solution saline normale contenant 1 % de DMSO. Après traitement, le comportement général des souris a été observé pendant 14 jours et le taux de mortalité a été enregistré. Les changements pathologiques chez les souris après i.v. l'administration ont été observées par microscopie optique (NIKON Eclipse ci, Tokyo, Japon).

Étude de distribution tissulaire utilisant HPLC

Les rats Sprague-Dawley ont été répartis au hasard dans deux sections (quatre groupes dans chaque section, n = 6 par groupe). Ces deux sections étaient i.p. administré respectivement 0,5 mg/kg de BF et BF/PEG-LP. Des échantillons des principaux tissus, y compris le cœur, le foie, la rate, les poumons, les reins et le cerveau, ont été prélevés 5, 15, 45 et 90 min après l'administration. Les échantillons de tissus ont été rapidement rincés avec une solution saline (0,9%), en éliminant le sang et le contenu comme il convient. Après le nettoyage, un papier filtre a été utilisé pour éponger les échantillons. Les échantillons ont été pesés puis homogénéisés dans une solution saline à 0,9 % (échantillon de tissu à solution saline, 1:2, w/w ). Les homogénats obtenus ont été conservés à - 80 °C jusqu'à l'analyse.

Les composés cibles ont été extraits et l'interférence des protéines endogènes a été éliminée par une méthode de préparation liquide-liquide [18]. Nous avons constaté que l'acétate d'éthyle améliorait la récupération d'extraction et minimisait les interférences endogènes, entraînant une sensibilité et une sélectivité accrues de la détection de BF. Par conséquent, l'acétate d'éthyle a été utilisé comme solvant optimal pour la préparation des échantillons. Vingt microlitres de la solution de travail IS ont été ajoutés à une aliquote de 100 L d'homogénat de tissu. Ensuite, les échantillons ont été mélangés au vortex pendant 30 s et extraits avec 2,5  mL d'acétate d'éthyle pendant 2 min. Après centrifugation à 3500µg pendant 10µmin, la couche organique supérieure a été transférée dans un autre tube et évaporée à 45°C sous un léger courant d'azote. Le résidu a été reconstitué dans 100 μL de phase mobile (acétonitrile :solution d'acide formique/eau à 0,1 %, 65 :35, v/v ) par vortex pendant 5 min et centrifugation à 12000 g pendant 10 min. Ensuite, une aliquote de 10 L du surnageant a été injectée dans le système HPLC (Waters 2995/2996, Waters Corporation, Milford, MA, USA). Les conditions chromatographiques optimisées pour la détection de BF et IS ont été présentées précédemment [6].

Analyse statistique

Tous les résultats ont été exprimés en moyenne  ± SD (n = 3), et les différences entre les formulations ont été comparées par une analyse de variance à un facteur (ANOVA), en utilisant le logiciel GraphPad Prism 5. P < 0,05 indique une signification dans tous les cas.

Résultats et discussion

Propriétés physiques et chimiques du BF/PEG-LP

La microscopie électronique à transmission (MET) a révélé que le BF/PEG-LP avait une forme sphérique uniforme, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 :figure S1A. La structure de BF/PEG-LP a été identifiée par FT-IR. Comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S1B, les pics caractéristiques à 3495  cm ⁻¹ et 3436 cm ⁻¹ représentait la vibration d'étirement N-H de la liaison amide, tandis que le pic à 1079 cm ⁻¹ représente la vibration d'étirement C–O–C de la liaison éther dans BF/PEG-LP. Pour évaluer la sécurité des formulations in vitro, le taux d'hémolyse des liposomes blancs, BF et BF/PEG-LP a été déterminé par un test d'hémolyse des globules rouges, et la viabilité cellulaire des cellules HepG2 et HCT116 traitées avec des liposomes blancs a été mesurée par CCK -8 dosage. Le groupe BF présentait une hémolyse évidente ; cependant, le taux d'hémolyse du groupe BF/PEG-LP était significativement plus faible à la même concentration (P < 0,01). Lorsque la concentration de BF/PEG-LP a été augmentée à 200 μg/mL, le taux d'hémolyse était évidemment plus élevé que celui des liposomes à blanc (P < 0,01, figure 1a). Les résultats du test CCK-8 ont montré que les liposomes blancs étaient non toxiques sur les cellules HepG2 et HCT116 (Fig. 1b).

Propriétés physiques et chimiques du BF/PEG-LP. un Taux d'hémolyse des globules rouges des liposomes blancs, BF et BF/PEG-LP. Les données sont présentées sous la forme \( \overline{x} \)± s (n = 3). **P < 0,01 contre. groupe BF/PEG-LP à la même concentration. b Cytotoxicité des liposomes blancs dans les cellules HepG2 et HCT116. Les données sont présentées sous la forme \( \overline{x} \) ± s (n = 6). c Stabilité du BF/PEG-LP dans différentes conditions de pH. Les données sont présentées sous la forme \( \overline{x} \) ± s (n = 6). **P < 0,01 contre. groupe pH 7,4 au même moment. Abréviations :BF, bufaline; BF/PEG-LP, liposomes pégylés chargés de bufaline

L'effet du pH environnemental sur la stabilité du BF/PEG-LP a été évalué par spectrophotométrie UV. La figure 1c montre que l'absorbance de l'échantillon du groupe pH 5,0 a augmenté avec le temps de stockage, indiquant que le BF/PEG-LP était plus stable dans le PBS à pH 7,4 (P < 0,01).

Apoptose des cellules tumorales in vitro

L'apoptose dans les cellules HepG2, HCT116, A549 et U251 induite par BF/PEG-LP a été déterminée par dosage CCK-8. L'IC₅₀ les valeurs de BF/PEG-LP pour toutes les cellules testées sont présentées dans le tableau 1. BF/PEG-LP a significativement diminué la viabilité de tous les types de cellules d'une manière dose-dépendante (Fig. 2). L'effet inhibiteur du BF/PEG-LP était similaire à celui de la DOX (contrôle positif, 50 μg/mL) à des concentrations dépassant 40 ng/mL. De plus, sur la base de l'IC₅₀ valeurs, la sensibilité des cellules au BF/PEG-LP a été classée comme suit :HCT116 > HepG2 > U251 > A549.

Cytotoxicité du BF/PEG-LP dans HepG2 (a ), HCT116 (b ), A549 (c ), et U251 (d ) cellules. Les données sont présentées sous la forme\( \overline{x} \) ± s (n = 6). *P < 0,05, **P < 0,01 contre. groupe témoin pour chaque lignée cellulaire. Abréviations :BF/PEG-LP, liposomes pégylés chargés de bufaline ; DOX, doxorubicine

Évaluation pharmacologique générale

Après administration de BF/PEG-LP, le comportement général des souris était différent de celui du groupe témoin. En particulier, les souris du groupe BF/PEG-LP à forte dose présentaient des tremblements et de la salivation. Après administration, les souris sont restées dans la boîte à champ ouvert pendant 10 min, et le nombre de grilles actives a été enregistré. Dans le groupe témoin positif (pentobarbital), le nombre de grilles actives n'était que de 342 ± 35, ce qui était significativement inférieur à celui du groupe témoin (725 ± 127, P < 0,05). Comme le montre la figure 3a, le nombre de grilles actives dans le groupe BF/PEG-LP à dose moyenne et élevée était significativement différent de celui du groupe témoin. Le test d'escalade sur tige a montré que le BF/PEG-LP avait un certain effet favorisant sur le mouvement coordonné des souris après une semaine d'administration par rapport à celui du groupe témoin (P < 0,01), tandis que la chlorpromazine a eu un effet promoteur significatif sur le groupe témoin positif (P < 0.05), comme le montre la figure 3b.

Effet pharmacologique du BF/PEG-LP sur l'activité locomotrice (a ) et exercice coordonné (b ) Chez la souris. Les données sont présentées sous la forme \( \overline{x} \) ± s (n = 10). *P < 0,05, * ^* P < 0,01 contre. groupe témoin à chaque instant ; ^# P < 0,05 par rapport au groupe BF/PEG-LP à faible dose. Abréviations :BF/PEG-LP, liposomes pégylés chargés de bufaline

Expérience de xénogreffe tumorale

Avec une administration prolongée, les souris des groupes témoins positifs, BF et BF/PEG-LP ont présenté un retard mental, une réduction de la prise alimentaire, une réaction lente et un pelage terne. La mort des souris est survenue dans les groupes BF et BF/PEG-LP. Le taux antitumoral du groupe témoin positif était de 36,5%; celui du groupe BF à dose élevée était de 27,6 %; et celle des groupes BF/PEG-LP à dose faible, moyenne et élevée était de 11,4 %, 28,9 % et 38,7 %, respectivement. À l'exception du groupe BF à faible dose, il y avait une différence significative entre les taux d'antitumoraux des groupes traités par le médicament et le groupe témoin négatif (P < 0,05), comme le montre la figure 4a. Comparé à celui du groupe BF à faible dose, le taux d'inhibition tumorale du groupe BF/PEG-LP à forte dose était significativement plus élevé (P < 0,01), comme illustré à la Fig. 4b.

Effet inhibiteur de BF et BF/PEG-LP sur la croissance de xénogreffes de gliome chez la souris nude. Comparaison du poids tumoral (a ) et le taux d'inhibition tumorale (b ) dans chaque groupe. Les données sont présentées sous la forme \( \overline{x} \) ± s (n = 10). *P < 0,05, **P < 0,01 vs. groupe de contrôle; ^# P < 0,05, ^## P < 0,01 contre. groupe BF/PEG-LP à forte dose. c Coloration H&E des tissus tumoraux de souris porteuses de tumeurs. Abréviations :BF, bufaline; BF/PEG-LP, liposomes pégylés chargés de bufaline ; DPP, cisplatine; H&E, hématoxyline et éosine

Les xénogreffes chez les souris porteuses de tumeurs étaient de forme nodulaire. La coloration H&E a montré que dans le groupe témoin, les noyaux des cellules tumorales étaient gros, le cytoplasme était petit et la croissance des cellules était vigoureuse; dans le groupe BF/PEG-LP à forte dose, une grande surface de tissu tumoral nécrotique a été observée, et le degré de nécrose était dose-dépendant, comme le montre la figure 4c.

Toxicité aiguë

La toxicité aiguë d'une seule i.v. dose des formulations chez les souris Kunming a été déterminée. Le LD₅₀ les valeurs de BF et BF/PEG-LP étaient respectivement de 0,156 et 3,03  mg/kg. Par rapport à celle du BF, la toxicité aiguë du BF/PEG-LP était significativement plus faible (P < 0,01) ; cet effet a été attribué à la formulation liposomale, qui contrôlait la libération de BF dans le sang.

Les changements pathologiques chez les souris après i.v. l'administration ont été observées par microscopie optique (Fig. 5). Des changements pathologiques ont été observés dans plusieurs organes, tels que le cœur, le foie et les reins. La dissolution des fibres cardiaques du myocarde et la fracture avec saignement étaient évidentes. Une nécrose a été observée dans les hépatocytes et les endothéliocytes pulmonaires.

Modifications pathologiques observées chez les souris mortes après administration intraveineuse de 1,0 mg/kg BF et 4,0 mg/kg BF/PEG-LP. Les coupes de tissus ont été colorées avec H&E et observées par microscopie optique. Notes :Microscope optique :NIKON Eclipse ci; Système d'imagerie :NIKON Digital Sight DS-FI2 (Tokyo, Japon); Grossissement :×200. Abréviations :BF, bufaline; BF/PEG-LP, liposomes pégylés chargés de bufaline ; H&E, hématoxyline et éosine

Étude sur la distribution des tissus

La comparaison des chromatogrammes de l'homogénat de tissu blanc et de l'homogénat enrichi, qui indiquaient qu'il n'y avait pas d'interférence significative aux temps de rétention de BF et CBG (IS), a été utilisée pour tester la sélectivité de la méthode, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 1 :Graphique S2. Les courbes d'étalonnage ont été construites à partir des rapports d'aire de pic de BF à IS (Y) par rapport aux concentrations d'homogénat tissulaire allant de 20 à 2000 ng/mL, avec un coefficient de corrélation R ² > 0,9977 (tableau 2). Les expériences de précision, d'exactitude et de récupération de BF dans des échantillons biologiques ont été présentées dans le fichier supplémentaire 1 :tableau S1, tandis que les résultats des expériences de stabilité ont été présentés dans le fichier supplémentaire 1 :tableau S2.

Les données brutes des expériences de distribution tissulaire sont présentées dans le fichier supplémentaire 1 :tableau S3. Après i.v. injection de BF/PEG-LP, sa distribution tissulaire est influencée par plusieurs variables, telles que la composition, la taille des particules et le potentiel zêta [19]. La concentration de BF dans divers tissus, y compris le cœur, le foie, la rate, les poumons, les reins et le cerveau, a été quantifiée à 5, 15, 45 et 90 min, comme le montre la figure 6. À 45 min après iv. administration, la concentration de BF dans les deux groupes était très faible dans certains tissus, tels que le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins, indiquant que la distribution et l'élimination de BF se sont produites rapidement. La concentration de BF dans le cerveau, mais pas dans d'autres tissus, pouvait toujours être détectée à 90 min après i.v. l'administration dans les deux groupes, indiquant que la distribution et l'élimination du BF étaient relativement plus lentes dans le cerveau que dans d'autres tissus.

Distribution tissulaire de BF dans les organes de rat. Un Formules moléculaires de la bufaline (a ) et cinoufagine (b , EST). B Profils de distribution tissulaire de BF chez le rat après une dose intraveineuse unique de BF/PEG-LP ou BF à 0,5 mg/kg. Les données sont présentées sous la forme \( \overline{x} \) ± s (n = 6). Abréviations :BF, bufaline; BF/PEG-LP, liposomes pégylés chargés de bufaline ; SI, norme interne

Pendant ce temps, un BF 1,20 fois plus élevé (333 ± 92,5 ng/g à 5 min) a été détecté dans les tissus cérébraux du groupe BF/PEG-LP par rapport à celui du groupe BF. De plus, une concentration plus élevée de BF a été trouvée dans les tissus du foie, de la rate et du cerveau dans le groupe BF/PEG-LP. Une accumulation significative de BF a été détectée dans le foie, avec des concentrations de 187 ± 31.0 ng/g dans le groupe BF/PEG-LP et 163 ± 35.0 ng/g dans le groupe BF (P < 0,01). Un phénomène similaire, qui est principalement causé par une augmentation spectaculaire du BF dans le sang avant le métabolisme et l'excrétion, a été observé dans des études précédentes [20, 21].

D'après les résultats des expériences de distribution tissulaire, le BF lui-même pourrait traverser la BHE, probablement en raison de sa liposolubilité élevée, de son faible poids moléculaire (386,52  g/mol) et de sa structure chimique, qui est similaire à celle du cholestérol, avec lequel il partage la même structure nucléaire mère. Cependant, l'application clinique du BF est limitée en raison de sa solubilité élevée dans les lipides et de sa faible solubilité dans l'eau. La biodisponibilité du BF est faible s'il n'est pas administré sous une forme alternative. Dans une étude précédente [6], nous avons montré que la formulation BF/PEG-LP pouvait améliorer la solubilité dans l'eau, prolonger la durée de la circulation sanguine, prolonger la demi-vie et élargir le champ d'application du BF, y compris pour l'i.v. chimiothérapie. Dans la présente étude, l'administration de BF/PEG-LP a entraîné une augmentation de la concentration de BF dans le cerveau, qui s'est maintenue pendant une plus longue durée (90 min). De plus, il y avait une différence significative dans la concentration de BF entre les groupes BF et BF/PEG-LP à 45 min (167,59 ± 54,52 vs. 71,52 ± 48,35 ng/g, P < 0,01).

Dans une étude précédente, il a été démontré que la BF exerce un effet de type digitalique sur le cœur, augmentant la fréquence cardiaque et la puissance de contraction du myocarde chez le rat [22]. Par conséquent, la cardiotoxicité du BF à fortes doses peut être causée par son accumulation dans le cœur. L'expérience de biodistribution dans cette étude a montré que l'accumulation de BF dans le cœur était plus faible dans le groupe BF/PEG-LP que dans le groupe BF (95,0 ± 18,5 vs . 134 ± 17.8 ng/g à 5 min, P < 0,01 ; 15,32 ± 5,56 vs. 63,79 ± 28,21 ng/g à 15 min, P < 0,01). Whether cardiac toxicity can be attenuated with a lower dose of BF requires further verification. Nevertheless, the antitumor effect of BF was sufficiently strong in this study (the IC₅₀ values for glioma cells were nanomolar). For in vivo application, it is critical to decrease the toxicity (especially heart toxicity) and increase the water solubility of BF, which was our focus in this study.

In general, PEGylated liposomes are considered to have no or low immunogenicity. However, according to recent studies, when PEGylated liposomes were repeatedly injected into the same animal, an immune response was triggered [23]. In fact, a second injection of PEGylated liposomes resulted in reduced blood circulation time and increased hepatic and splenic accumulation, which is known as the accelerated blood clearance (ABC) phenomenon. Such immunogenicity of PEGylated liposomes presents major challenges in the research of liposomal formulations and their clinical application. However, liposomal formulations that do not display the ABC phenomenon have been reported, such as a long-circulating DOX-loaded liposomal formulation (Doxil, Sequus pharmaceuticals, Inc., San Francisco, CA, USA), which has been commercialized. DOX was released from the liposomes and entered the spleen, damaging spleen cells and thereby reducing the production of anti-PEG IgM, which could selectively bind with PEG on the surface of the liposomes administered at the second injection. Whether BF/PEG-LP exhibits the ABC phenomenon remains unknown and requires further study. If so, mitigating the ABC phenomenon will require in-depth investigation.

Conclusion

In the present study, we evaluated hemolysis induced by BF/PEG-LP and the cytotoxicity of blank liposomes to verify the safety thereof. Moreover, the effect of environmental pH on the release of BF from liposomes was investigated to assess the stability of BF/PEG-LP. BF encapsulation in a liposomal suspension might affect its antitumor activity in vitro and in vivo and general behavior, acute toxicity, and tissue distribution in vivo. Nonetheless, we believe that the development of the liposomal formulation described in this study has laid a foundation for the future clinical application of BF. Intensive investigation of the relevance of the ABC phenomenon to BF/PEG-LP is warranted in the future.

Disponibilité des données et des matériaux

All data generated or analyzed during this study are included in this published article and its supplementary information files.

Abréviations

ABC:

Accelerated blood clearance

AIE:

The aggregation-induced emission

BBB :

Barrière hémato-encéphalique

BF:

Bufalin

BF/PEG-LP:

Bufalin-loaded PEGylated liposomes

CBG:

Cinobufagin

CCK-8 :

Kit de comptage cellulaire-8

IC₅₀ :

Half-maximal inhibitory concentration

i.p.:

Intraperitoneally

IS:

Internal standard

i.v. :

Intravenously

LD₅₀ :

Concentration létale médiane

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

RBC:

Red blood cell