Personnalisation des perturbations morphomécaniques cellulaires grâce aux nanoparticules d'oxyde métallique

Contexte

L'utilisation massive de nanoparticules manufacturées (ENP) dans les produits commerciaux sensibilise à leur toxicité potentielle pour l'homme et l'environnement [1]. De nombreuses études in vitro et in vivo ont été menées jusqu'à présent dans le but de faire la lumière sur les mécanismes moléculaires de la toxicité [2, 3]. Cependant, la compréhension des interactions entre les nanoparticules (NP) et les organismes vivants est assez difficile en raison du manque de procédures opératoires standardisées, ce qui a entraîné les données de la littérature controversée actuellement disponibles [4, 5]. Il est établi que les effets indésirables des NP dépendent strictement de leurs propriétés physico-chimiques et de la cellule ou de l'organisme spécifique testé [6]. Pour cette raison, la caractérisation des NP est fondamentale pour obtenir des données fiables [7]. Les NP d'oxydes métalliques sont largement répandues dans les produits commerciaux [8]. Parmi ceux-ci, le SiO₂ amorphe NPs et TiO₂ cristallin Les NP sont utilisées dans un large éventail de domaines industriels comme additifs pour les médicaments et les cosmétiques et dans les produits de santé, les toners pour imprimantes, les peintures, les emballages alimentaires et les additifs alimentaires [9, 10]. Par conséquent, il est probable que ces NP puissent accéder aux organismes vivants par différentes voies (ingestion, inhalation et pénétration cutanée) [11]. Les exemples sont, mais sans s'y limiter, les produits alimentaires à base de TiO₂ NPs (étiqueté E171 dans l'étiquette commerciale) et SiO₂ NPs (E551, E554, E556 dans l'étiquette commerciale), qui ont connu une croissance énorme [12,13,14]. Les études en cours sur SiO₂ NPs et TiO₂ Les NP suggèrent qu'elles interfèrent activement avec les mécanismes cellulaires cruciaux. Par exemple, il a été prouvé qu'ils stimulent la libération de cytokines (provoquant ainsi l'inflammation) [15,16,17] pour endommager les microvillosités intestinales [18, 19], induisent la production de ROS [20], inhibent la synthèse d'ATP [21] et induisent génotoxicité [22,23,24,25,26]. Pourtant, très peu d'études ont exploré si ces NP interagissent avec la mécanique cellulaire [27], un sujet nécessitant des investigations plus approfondies. Les adhérences cellulaires et les réarrangements du cytosquelette sont cruciaux pour maintenir effectivement l'homéostasie cellulaire [28]. Tout changement dans l'architecture du cytosquelette peut perturber la mécanique cellulaire et affecter l'élasticité cellulaire et la dynamique de migration [29]. Dans cette étude, nous avons soigneusement évalué les effets biomécaniques de 20 nm SiO₂ NPs et TiO₂ NPs sur les cellules Caco-2 et A549, qui sont les meilleurs modèles ressemblant aux tissus exposés aux NPs. Nous avons préliminairement exploré leurs mécanismes d'entrée, ainsi que évalué la viabilité cellulaire, les dommages membranaires et la production de ROS ainsi que l'activation de la superoxyde dismutase (SOD) et du malondialdéhyde (MDA). Ensuite, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation des changements d'élasticité cellulaire (module de Young) lors de l'incubation des NP par microscopie à force atomique (AFM). Nos résultats montrent que les NP peuvent induire une réorganisation significative de l'actine corticale, comme le confirment les modifications du module de Young. En particulier, une biocompatibilité majeure de SiO₂ NPs contre une toxicité chronique du TiO₂ NPs a été observée. Notre approche consistant à coupler les études de cytotoxicité avec les caractérisations biomécaniques représente une nouvelle méthode potentielle pour standardiser les protocoles d'évaluation de la toxicité des NP.

Méthodes

Synthèse de SiO amorphe₂ NP

La microémulsion ternaire E/H a été préparée à température ambiante en mélangeant de l'eau, un solvant organique (Cyclohexane, J.T. Baker), un tensioactif (Triton X-100, Sigma-Aldrich) selon les méthodes de Malvindi et al. [25]. Brièvement, 880 μL de Triton X-100, 3,75 mL de cyclohexane, 170 mL d'eau et 50 μL de TEOS (98 %, Sigma-Aldrich) ont été mélangés et agités pendant 30 min. Plus tard, 30 μL de NH₄ OH (28,0-30,0 %, Sigma-Aldrich) a été ajouté à la microémulsion. Après 24 h, la suspension a été séparée par centrifugation (4 500   tr/min) suivie de cinq lavages dans de l'éthanol (98 %, Sigma-Aldrich) et de l'eau milliQ. Les nanoparticules ont ensuite été dispersées dans de l'eau.

Synthèse de TiO₂ NP

TiO₂ Les NP ont été préparées selon la méthode sol-gel décrite par Leena et al. [30] avec quelques modifications. Brièvement, de l'isopropoxyde de titane (IV) (TTIP; 99,9 % Sigma-Aldrich) a été déposé goutte à goutte dans une solution d'éthanol et d'eau milliQ (5:1:1) sous agitation dans des conditions acides (pH 3). Les NP ont été incubées pendant 5 h à 30 °C d'abord, puis à 430 °C pendant 3 h pour obtenir une nano poudre blanche.

Caractérisation TEM

Les caractérisations par microscopie électronique à transmission (MET) ont été réalisées avec un microscope JEOL Jem 1011, fonctionnant à une tension d'accélération de 100 Kv (JEOL USA, Inc.). Les échantillons MET ont été préparés en laissant tomber une solution diluée de NP dans de l'eau sur des grilles de cuivre recouvertes de carbone (Formvar/Carbon 300 Mesh Cu).

Mesures DLS et -Potentiel

La taille hydrodynamique moyenne et le potentiel zêta de SiO₂ NPs et TiO₂ Les NP ont été déterminées par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et mesures de potentiel ζ effectuées sur un Zetasizer Nano-ZS équipé d'un laser HeNe de 4,0 mW fonctionnant à 633  nm et d'un détecteur à photodiode à avalanche (Modèle ZEN3600, Malvern Instruments Ltd., Malvern, ROYAUME-UNI). Les mesures ont été faites à 25°C en solutions aqueuses et en milieu de culture cellulaire (DMEM, high glucose, Sigma-Aldrich) additionné de FBS (Sigma-Aldrich) à 10% et 20% pH 7). Chaque échantillon a été analysé trois fois, en utilisant deux répétitions techniques indépendantes, pour obtenir les valeurs moyennes des mesures DLS et du potentiel .

Caractérisation XRD

Diffraction des rayons X sur poudre (XRD) pour l'analyse de la phase cristalline du TiO₂ Les NPs ont été réalisées sur un diffractomètre Rigaku en géométrie de réflexion Bragg-Brentano en utilisant un rayonnement Cu-Ka filtré. Les modèles XRD ont été enregistrés dans la plage de 2Q ¼ 20-80 par balayage pas à pas, en utilisant des incréments 2Q de 0,02 et un temps de comptage fixe de 2 s/pas.

Culture cellulaire

Caco-2 (ATCC® HTB-37™) et A549 (ATCC® CCL-185™) ont été maintenus dans du DMEM avec 50 µM de glutamine, complétés par 100 µU/mL de pénicilline et 100 µmg/mL de streptomycine. Le pourcentage de FBS était de 10 % pour A549 et de 20 % pour les cellules Caco-2. Les cellules ont été incubées en atmosphère contrôlée humidifiée avec un ratio air/CO₂ de 95 à 5% , à 37 °C.

Détermination de l'absorption intracellulaire de SiO₂ NPS et TiO₂ NP

10 ⁵ Les cellules Caco-2 et A549 ont été ensemencées dans 1 mL de milieu dans une plaque à six puits. Après 24 h d'incubation à 37 °C, le milieu a été remplacé par du milieu frais contenant le SiO₂ NPs et TiO₂ NPs, à des concentrations de 15 μg/ml et 45 μg/ml. Après 48 h, 72 h et 96 h d'incubation à 37 °C, le DMEM a été retiré et les cellules lavées quatre fois avec du PBS (pH 7,4) pour éliminer les NP qui pourraient être liées à la membrane cellulaire. Les cellules ont été trypsinisées et comptées à l'aide d'une chambre de comptage de cellules automatique. Trois cent soixante mille cellules ont été suspendues dans 200 μL de milliQ et traitées avec HCl/HNO₃ 3:1 (v /v ) et dilué à 5 mL :la solution résultante a été analysée pour évaluer la teneur en Si et Ti. L'analyse élémentaire a été réalisée par spectroscopie d'émission atomique à plasma à couplage inductif (ICP-AES) avec un spectromètre Varian Vista AX.

Test WST-8

Les cellules Caco-2 et A549 ont été ensemencées dans des microplaques 96 puits à une concentration de 5 × 10 ³ cellules/puits après 24h de stabilisation. Solutions mères NP (SiO₂ NPs et TiO₂ NPs) ont été ajoutés aux milieux cellulaires à 15µg/ml et 45µg/ml. Les cellules ont été incubées pendant 24h, 48h, 72h et 96h. Au point final, la viabilité cellulaire a été déterminée en utilisant un test WST-8 standard (Sigma-Aldrich). Les dosages ont été effectués en suivant la procédure précédemment décrite dans De Matteis et al. [31]. Les données ont été exprimées en moyenne  ± SD.

Dosage LDH

Les cellules Caco-2 et A549 ont été traitées avec SiO₂ NPs et TiO₂ NPs suivant la procédure indiquée pour le test WST-8. Le dosage de la lactate déshydrogénase (LDH) a été réalisé sur des microplaques en appliquant le réactif CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay (Promega), en suivant les instructions du fabricant. Le milieu de culture a été collecté et le niveau de LDH a été mesuré en lisant l'absorbance à 490  nm à l'aide d'un spectrophotomètre à microplaque Bio-Rad. Les données ont été exprimées en moyenne  ± SD.

Dosage DCF-DA

Les cellules Caco-2 et A549 ont été ensemencées dans des microplaques à 96 puits et traitées avec SiO₂ NPs et TiO₂ NPs à des concentrations finales de 15 μg/ml et 45 μg/ml. Après 24h, 48h, 72h et 96h d'interaction cellule-NP, le dosage DCF-DA (Sigma) a été réalisé sur des microplaques selon la procédure rapportée par De Matteis et al. [32] Les données ont été exprimées en moyenne  ± SD.

Dosage SOD

Les extraits cellulaires Caco-2 et A549 (incubés à 15µg/ml, 45µg/ml pendant 24µh, 48µh, 72µh et 96µh) ont été préparés selon le protocole décrit dans [33]. Le dosage a été réalisé sur des microplaques en appliquant un dosage SOD (Cayman Chemical Company, Michigan, OH, USA) qui mesure les trois types de SOD (Cu/ZnSOD, MnSOD et FeSOD). L'essai a utilisé un sel de tétrazolium pour la détection des radicaux superoxydes générés par la xanthine oxydase et l'hypoxanthine. Une unité de SOD est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour présenter une dismutation de 50 % du radical superoxyde. L'activité SOD a été mesurée en lisant l'absorbance à 440-460  nm à l'aide d'un spectrophotomètre à microplaque Bio-Rad.

Dosage MDA

Les extraits cellulaires Caco-2 et A549 (incubés avec 15µg/ml, 45µg/ml pendant 24µh, 48µh, 72µh et 96µh) ont été préparés selon les procédures décrites précédemment [33]. Le dosage a été réalisé sur des microplaques en appliquant le kit de dosage de la peroxydation lipidique (MDA) (Abcam) :le MDA de l'échantillon a réagi avec l'acide thiobarbiturique (TBA) pour générer un adduit MDA-TBA. Cette voie impliquait la mesure spectrophotométrique de la couleur rouge produite lors de la formation de l'adduit MDA-TBA, qui peut être quantifiée (en termes de nmol/mg de protéine) en lisant l'absorbance à 532 nm à l'aide d'un spectrophotomètre à microplaque Bio-Rad.

Analyse CLSM

Les cellules ont été ensemencées dans une plaque de 24 puits à une concentration de 10 ⁵ cellules/puits et successivement incubés avec SiO₂ NPs et TiO₂ NPs à des concentrations de 15 μg/ml et 45 μg/ml pendant 24 h, 48 h, 72 h et 96 h. Après traitement, pour chaque instant, le milieu contenant les nanoparticules a été retiré et les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS, fixé avec 0,25% de glutaraldéhyde (v /v en PBS, Sigma-Aldrich) pendant 20 min, et enfin perméabilisé avec 0,1% de Triton (v /v en PBS, Sigma-Aldrich) pendant 5 min Pour la coloration de l'actine, Phalloidin-ATTO 488 (Sigma-Aldrich) a été utilisé à une concentration de 1 μg/ml pendant 30 min. Les noyaux ont été marqués au moyen de DAPI (Sigma-Aldrich) à concentration de 1µg/ml pendant 7µmin. La microscopie confocale à balayage laser a été réalisée sur un microscope confocal Zeiss LSM700 (Zeiss) équipé d'un microscope inversé Axio Observer Z1 (Zeiss) en utilisant une lentille à immersion dans l'huile à ouverture numérique × 100, 1,46 pour l'imagerie. Les fichiers de données confocales ont été traités à l'aide du logiciel ZEN2010 (Zeiss), et des quantifications morphométriques (cohérence et densité intégrée de l'actine F) ont été réalisées sur 15 cellules, à l'aide du logiciel d'analyse ImageJ 1.47. Le plugin OrientationJ a été utilisé pour quantifier le paramètre de cohérence en choisissant une séquence spécifique de ROI dans les acquisitions confocales, basée sur la mesure des tenseurs de structure dans un voisinage local. Dans le même temps, le logiciel calculait la valeur d'orientation et de cohérence qui représentait le degré d'orientation des fibres d'actine :les fibres les plus désordonnées ont des valeurs proches de 0, tandis que celles parfaitement alignées présentent une valeur de cohérence d'environ 1 [34]. La densité intégrée a également été calculée par la somme des valeurs des pixels dans les ROI sur les acquisitions confocales afin de quantifier la quantité de fibres d'actine dans les cellules.

Analyse AFM

Les cellules Caco-2 et A549 ont été ensemencées dans des boîtes de Pétri en plastique (Corning) à une concentration de 10 ⁵ cellule/puits et cultivée jusqu'à 70-80% de confluence. Les cellules ont ensuite été traitées avec 45 μg/ml d'un TiO₂ NP_S et SiO₂ NPs dans DMEM pendant 72 h. Successivement, les NP ont été retirées et les cellules lavées avec du PBS. Les cellules ont été fixées en utilisant du glutaraldéhyde à 0,25% pendant 20 min, suivi d'un lavage avec du PBS. Les mesures ont été effectuées par un microscope à sonde à balayage avancé (Bioscope Catalyst, Bruker Inc., USA) monté sur un microscope optique inversé (Zeiss Observer Z1, Zeiss GERMANY). L'ensemble du système est placé sur une base qui agit comme un isolant vis-à-vis des vibrations mécaniques environnementales. Les expériences AFM ont été réalisées en mode force-volume en utilisant le Sharp Microlever de Bruker en forme de V (MSNL, pointe C) :un cantilever en nitrure de silicium à haute sensibilité avec une constante de ressort nominale de 0,01 N/m. Cette valeur a été estimée avec précision par la méthode de réglage thermique [35] avant d'effectuer des acquisitions AFM. Les paramètres utilisés étaient les suivants :zone de balayage 50 μm, taux de rampe 3 Hz, taux de balayage FV 0,03 Hz, seuil de déclenchement 100 nm, nombre d'échantillons 128, échantillon par ligne 64 et lignes 64. Le module de Young (E) a été déterminé sur 20 cellules, dont 25 courbes force-distance ont été extraites en correspondance de la zone nucléaire et 25 courbes dans la région cytoplasmique. L'ensemble de données d'approche (du point de contact à la valeur de force maximale) dérivé des courbes extraites a été équipé d'un modèle de Sneddon modifié :

où z et δc étaient les données de chargement expérimentales (hauteur et déviation en porte-à-faux, respectivement), α est le demi-angle de la pointe, k _c était la valeur constante élastique du porte-à-faux, et ν est le coefficient de Poisson (supposé être de 0,5 pour l'échantillon biologique). Dans l'algorithme d'ajustement, le point de contact a été traité comme une variable d'ajustement et les forces d'adhérence ont été prises en compte ont été acquises sur 20 cellules.

Analyse statistique

Les données ont été exprimées en valeur moyenne et écart type associé. Les différences entre les différentes valeurs moyennes ont été considérées comme statistiquement significatives lors de l'exécution du Student t tester avec un p valeur ˂ 0,05 (< 0,05*, < 0,01** et < 0,005***).

Résultats

Caractérisation de SiO₂ NPs et TiO₂ NP

SiO₂ NPs et TiO₂ Les NPs ont été synthétisées avec des voies de synthèse différentes et reproductibles afin d'obtenir des NPs ayant une distribution de taille étroite et contrôlée (voir section « Méthodes »). Ensuite, les NP ont été profondément caractérisées au moyen de TEM, DLS, potentiel et XRD, à la fois dans l'eau et dans les milieux de culture cellulaire (DMEM) avec différentes concentrations de source de protéines (FBS). Ceci est crucial, car les protéines média peuvent recouvrir la surface des NP, modifiant ainsi leurs propriétés physico-chimiques et, par conséquent, les effets biologiques [36]. Les analyses MET ont montré que SiO₂ Les NP sont de forme sphérique, avec un diamètre moyen de 20 ± 2 nm (Fig. 1a). TiO₂ Les NP ont une taille similaire (25 ± 5 nm), mais une morphologie différente (Fig. 1). Les mesures DLS effectuées dans l'eau à 96 h ont confirmé un rayon hydrodynamique de 21 ± 7 nm et 27 ± 12 nm pour SiO₂ NPs et TiO₂ NPs, respectivement (Fig. 1b et Fig. 1e). Comme prévu, ces données sont en bon accord avec les observations MET. Les analyses de potentiel ont également confirmé des valeurs de charge de surface dans l'eau de − 45 ± 3 mV pour SiO₂ NPs et de − 50 ± 3 mV pour TiO₂ NPs (Fig. 1c, f). Comme prévu, les propriétés physico-chimiques des NP ont changé lors de l'inoculation dans les milieux de culture cellulaire. Le DLS a confirmé une augmentation significative de la taille des NP, en particulier en présence de DMEM supplémenté avec 20 % de FBS (tableau 1). En particulier, SiO₂ Les NP ont montré une taille de 29 ± 9 nm, tandis que TiO₂ Les NP ont augmenté jusqu'à 41 ± 14 nm après 96 h. L'élargissement du pic DLS observé dans les mesures DMEM (avec ou sans FBS) est un signe d'agglomération des NPs, qui peut être favorisée par la force ionique du milieu (données non présentées). De plus, les mesures du potentiel ont démontré que la charge de surface des deux NP s'est déplacée vers des valeurs plus négatives. Ce grand phénomène dépendant du temps était dû à la formation de couronnes protéiques assez stables [37, 38] induite par la présence de protéines sériques dans les milieux de culture cellulaire qui étaient adsorbés à la surface des NP :la taille et la charge des NP changent en fonction de la concentration en FBS.

Caractérisations de SiO₂ NPs et TiO₂ NP dans l'eau. un –d Images TEM représentatives. b –e Diffusion dynamique de la lumière (DLS) et c –f mesures de potentiel . g Diagramme d'analyse par diffraction des rayons X (XRD) de TiO₂ NP

Le modèle XRD de TiO₂ NP_S , calciné à 430°C, a montré un mélange de phases cristallines anatase et rutile (Fig. 1g) . Les pics dominants à 2θ = 25,4° (101), 48,1° (200), 54,1° (211), 62,4° (204) et 68,8° (116) se distinguaient par la phase anatase correspondant bien aux données JCPDS standard ( carte n° :21-1272). La phase rutile était représentée avec des pics de diffraction à 27,5° (110), 36,2° (101) et 41,2° (111).

Captation des NP dans les cellules Caco-2 et A549

Afin de quantifier la quantité de SiO₂ NPs et TiO₂ NP_S absorbé par les cellules, nous avons effectué une analyse élémentaire ICP-AES sur une cellule lysée comme enquête préliminaire. Les cellules ont été traitées avec 15 µg/ml et 45 µg/ml de NP. Les données expérimentales ont confirmé la présence de SiO₂ NPs et TiO₂ NPs dans les deux lignées cellulaires, avec une efficacité d'internalisation dépendante du temps (Fig. 2a). TiO₂ Les NP ont montré une plus grande absorption par rapport à SiO₂ NPs. Cela était particulièrement évident dans le Caco-2, où la teneur en Ti a atteint des concentrations intracellulaires de 8,2 ± 0,4 μg et 9,7 ± 0,031 μg après 72 h et 96 h, respectivement. La quantité de Ti détectée dans l'A549 était plus faible, car nous avons trouvé 5 ± 0,599 μg après 72 h et 7,12 ± 0,11 μg après 96 h de temps d'incubation. SiO₂ Les NP étaient moins absorbées par les cellules que TiO₂ NPs, même si l'internalisation était plus prononcée dans Caco-2. Dans ce cas également, en fait, la quantité de SiO₂ internalisée Les NP dans les cellules Caco-2 étaient de 4,69 ± 0,031 μg après 72 h et de 5,78 ± 0,045 μg après 96 h d'incubation. Les valeurs ont diminué dans A549, où nous avons quantifié 2,58 ± 0,045 μg après 72 h et 4,7 ± 0,04 μg après 96 h.

TiO₂ NPs et SiO₂ Accumulation de NPs dans les lignées cellulaires Caco-2 et A549 exposées à 15 μg/ml et 45 μg/ml de TiO₂ NPs et SiO₂ NPs pour 24 h, 48 h, 72 h et 96 h. Les cellules ont ensuite été récoltées, les cellules vivantes ont été comptées et la teneur en Ti et Si a été mesurée dans 360 000 cellules (μg Ti et g Si). Données rapportées comme moyenne  ± SD à partir de trois expériences indépendantes ; signification statistique des cellules exposées par rapport aux cellules témoins pour p valeur < 0,05 (< 0,05*, < 0,01** et < 0,005***)

Effets des NP sur CaCo-2 et A549 :Viabilité des cellules, dommages membranaires et production de ROS

La viabilité des cellules Caco-2 et A549 a été évaluée avec le test WST-8. Le traitement au SiO₂ NPs et TiO₂ Les NP ont induit une légère réduction dose-dépendante de la viabilité dans les deux lignées cellulaires testées (Fig. 3). TiO₂ Les NP induisent une cytotoxicité accrue vis-à-vis du SiO₂ NPs, et la viabilité cellulaire des cellules CaCo-2 a été plus affectée que l'A549, lors du traitement avec TiO₂ NPs. En particulier, nous avons observé une réduction de viabilité d'environ 40% dans Caco-2 traité avec 45 μg/ml de TiO₂ NPs pendant 72 h. Cette réduction a encore diminué jusqu'à 50 % après 96  h, alors que, dans les lignées cellulaires A549, TiO₂ Les NP n'ont induit une réduction de 30% de la viabilité qu'après 96 h de traitement. La libération de LDH et la production de ROS ont été évaluées dans des cellules Caco-2 et A549 lors de l'exposition au TiO₂ NPs et SiO₂ NPs. Comme le montrent les figures 4a, b, les NP ont induit la poration de la membrane cellulaire (et la libération de LDH en fait) en accord étroit avec les résultats de viabilité. L'effet était plus évident dans Caco-2 par rapport à A549 en particulier sur TiO₂ Traitement NP, aux moments les plus élevés (72 et 96 h). Le pourcentage de libération de LDH a atteint une augmentation d'environ 160 % par rapport aux cellules non traitées (témoin), après 96 h d'exposition. La génération ROS a été largement étudiée car c'est l'un des effets majeurs induits par les NP [39]. Ce phénomène interfère dans la réponse de défense antioxydante biologique [40], même s'il est important de mentionner que le mécanisme d'action réel est encore à l'étude. Le stress oxydatif potentiel induit par les NP a été estimé par dosage DCFH-DA. Comme prévu, l'interaction entre les NP et les cellules a stimulé la génération de ROS, de manière dose-dépendante avec un fort effet dans Caco-2 sur TiO₂ Traitement NP (Fig. 4c, d). Le pourcentage de libération a atteint des valeurs de 165% par rapport aux cellules témoins, à la concentration la plus élevée testée.

Test de viabilité (WST-8) de Caco-2 (a ) et A549 (b ) cellules après 24 h, 48 h, 72 h et 96 h d'exposition à deux doses (15 μg/ml et 45 μg/ml) de TiO₂ NPs et SiO₂ NPs. La viabilité des cellules traitées par NP a été normalisée par rapport aux cellules témoins non traitées. En tant que contrôle positif (P), les cellules ont été incubées avec 5 % de DMSO (données non présentées). Les données rapportées comme moyenne  ± SD de trois expériences indépendantes sont considérées comme statistiquement significatives par rapport au contrôle (n = 8) pour p valeur < 0,05 (< 0,05*, < 0,01** et < 0,005***)

LDH (a –b ) et ROS (c –d ) sur des cellules Caco-2 et A549. Les cellules ont été incubées avec 15 μg/ml et 45 μg/ml de TiO₂ NPs et SiO₂ NPs pour 24 h, 48 h, 72 h et 96 h. Le pourcentage de fuite de LDH des cellules traitées aux nanoparticules est exprimé par rapport aux cellules témoins non traitées. Les contrôles positifs (P) consistaient en le traitement des cellules avec 0,9% de Triton X-100 montrant env. 500 % d'augmentation de la LDH (données non présentées). Les niveaux de ROS ont été enregistrés en exposant les cellules Caco-2 et A549 avec 15 μg/ml et 45 μg/ml de TiO₂ NPs et SiO₂ NPs pendant 24 h, 48 h, 72 h et 96 h incubées avec 100 M de DCFH-DA. La fluorescence cellulaire a été mesurée. En tant que contrôle positif (P), les cellules ont été incubées avec 500 M de H₂ O₂ montrant un ca. Augmentation de 300 % DCFH-DA (non affichée). Les données rapportées comme moyenne  ± SD de trois expériences indépendantes sont considérées comme statistiquement significatives par rapport au contrôle (n = 8) pour p valeur < 0,05 (< 0,05*, < 0,01** et < ,005***)

Effets induits par les NP sur l'activité des antioxydants et la peroxydation lipidique dans les cellules Caco-2 et A549

L'enzyme SOD est impliquée dans le système de défense antioxydant après l'induction du stress oxydatif. Cette enzyme catalyse la dismutation du superoxyde hautement réactif (O₂ ^•− ) anion en peroxydes H₂ O₂ [41]. Nous avons observé une réduction dose-dépendante de l'activité de l'enzyme SOD à la fois dans Caco-2 et A549 après incubation avec SiO₂ NPs et TiO₂ NPs (15 μg/ml, 45 μg/ml) à différents moments (de 24 à 96 h) (Fig. 5a, b). En accord étroit avec les évaluations de la cytotoxicité, l'effet était plus évident dans le Caco-2 sur TiO₂ exposition NP. Par exemple, les niveaux d'activité SOD ont été réduits de 4,1 ± 0,2 U/ml dans le contrôle à 1,03 ± 0,325 U/ml dans les cellules Caco-2 exposées à 45 μg/ml de TiO₂ NPs, après 96 h. L'exposition à la même concentration de SiO₂ Les NP ont réduit l'activité SOD à 1,45 ± 0,12 U/ml. Le test basé sur le MDA a été utilisé pour vérifier la peroxydation lipidique potentielle induite par les ROS, qui est à son tour un autre moyen de vérifier le stress oxydatif cellulaire. [42] Les niveaux cellulaires de MDA ont augmenté après exposition aux deux types de NP pour Caco-2 et A549 (Fig. 5c, d). Comme prévu, les niveaux accrus de MDA étaient proportionnels à la concentration et au temps d'exposition.

un –d Dosages SOD et MDA sur cellules Caco-2 et A549. Les cellules ont été incubées avec 15 μg/ml et 45 μg/ml de TiO₂ NPs et SiO₂ NPs pour 24 h, 48 h, 72 h, 96 h. Le test SOD a utilisé un sel de tétrazolium pour la détection des radicaux superoxyde générés par la xanthine oxydase et l'hypoxanthine. La courbe standard a été utilisée comme témoin positif (données non présentées). Les niveaux de MDA ont été détectés par la quantification de l'adduit MDA-TBA (DO =532 nm). Les données rapportées comme moyenne  ± SD de trois expériences indépendantes sont considérées comme statistiquement significatives par rapport au contrôle (n = 8) pour p valeur < 0,05 (< 0,05*, < 0,01** et < 0,005***)

Effets morphomécaniques induits par les NP

Analyses en microscopie confocale de Caco-2 et A549 incubés avec 15 μg/ml et 45 μg/ml de SiO₂ NPs et TiO₂ Les NP pour 24 h, 48 h, 72 h et 96 h sont rapportées dans les Fig. 6 and 7. Les cellules témoins Caco-2 présentaient une morphologie similaire aux entérocytes intestinaux avec des jonctions serrées et une bordure en brosse du côté apical [43]. Lors du traitement avec les NP, les jonctions serrées des cellules se sont effondrées et le motif des cellules a été isolé, avec une forme allongée. Ces effets étaient plus évidents lorsque les cellules étaient traitées avec TiO₂ NPs à 45 g/ml pendant 72 h de temps d'incubation, montrant des altérations pertinentes des modèles d'actine, ainsi que des changements dans la morphologie cellulaire. Les cellules A549 non traitées présentaient une forme de galet et des adhérences cellule-cellule fonctionnelles [44], tandis que le traitement avec les NP diminuait les contacts cellule-cellule et modifiait la morphologie cellulaire vers des formes plus allongées. La figure 8 montre une figure confocale agrandie, qui permet de détecter les changements dans la distribution de l'actine. L'organisation altérée du réseau d'actine après exposition aux NP (72 h de 45 μg/ml de SiO₂ NPs et TiO₂ NPs) a été analysé quantitativement par densité de fluorescence et cohérence à l'aide du logiciel ImageJ (Fig. 9). Nous avons spécifiquement opté pour ces deux paramètres car la densité intégrée nous a permis de quantifier la quantité d'actine, tandis que la cohérence nous a donné des informations sur le degré d'orientation des fibres par rapport à l'environnement [45]. Les cellules Caco-2 non traitées avaient une valeur de densité de 129,4 ± 16, et cela n'a pas été affecté par les traitements NP ; les valeurs étaient de 127,7 ± 20 et 128,5 ± 18 après exposition au SiO₂ NPs et TiO₂ NPs, respectivement, Fig. 9a). De même, la densité du réseau coloré à l'actine est restée la même dans A549 avant et après le traitement (68,4 ± 14, 67,9 ± 15 et 67,7 ± 18 pour le contrôle négatif, SiO₂ NPs et TiO₂ NPs, respectivement, Fig. 9b). Bien que les traitements NP n'aient pas induit de modification de la quantité d'actine, les analyses de cohérence ont suggéré une réorganisation spatiale différente de l'actine. Dans Caco-2, les valeurs de cohérence des cellules traitées pour SiO₂ NP (0,16 ± 0,04) et pour TiO₂ NP (0.09 ± 0.02) treatment decreased with respect to that of the control (0.26 ± 0.03) (Fig. 9c). Even the A549 cells underwent a decrease of coherency after interacting with SiO₂ NPs and TiO₂ NPs (0.2 ± 0.07 and 0.158 ± 0.04) compared to the control cells (0.4 ± 0.03) (Fig. 9d). Hence, NPs induced a significant reorganization of actin network, which showed an actin isotropic orientation, but they did not change the overall quantity of actin expressed. In addition to cytoskeletal rearrangements, we also analyzed the area described by the nucleus/cytoplasm ratio. Values of N/C ratio were calculated as the ratio between nuclear area and the whole cellular area (measured performed on 15 cells). We observed opposite values following the treatment with 45 μg/ml of NPs for 72 h with significant statistical validity. In particular, the ratio was (0.40 ± 1.7) in untreated Caco-2 cells, and this increased up to 0.554 ± 0.09 and 0.62 ± 0.12 after SiO₂ NP and TiO₂ NP exposure (Fig. 9e). The trend was different in A549. The nuclear/cytoplasm ratio dropped down upon exposure to NPs from values of 0.550 ± 0.04 for control cells to 0.334 ± 0.06 for SiO₂ NPs and 0.225 ± 0.09 for TiO₂ NPs. After the morphological investigations, we analyzed the elastic properties of cells after exposing them to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h by AFM, in force–volume mode. We measured the different elasticity expressed by Young’s modulus values in the nuclear and cytoplasmic region. Caco-2 cells displayed Young’s modulus value of 105 ± 25 kPa for nuclear region and 47 ± 21 kPa for the cytoplasm. After SiO₂ NP treatment, we observed a reduction of value to 42 ± 8 kPa for the nucleus and 19.59 ± 2 kPa for the cytoplasm. The effects were more evident after treatment with TiO₂ NPs:the Young modulus for the nucleus was 27 ± 4 kPa and 18 ± 4 kPa for the cytoplasm (Fig. 10a). We found an opposite outcome concerning the elastic properties of A549 cells. In this case, Young’s modulus was 129 ± 24 kPa for the nuclear region and 147 ± 26 kPa for the cytoplasmic area. After SiO₂ NP treatment, the values of elasticity increased to 152 ± 23 kPa for nucleus and 152 ± 25 kPa for cytoplasm. When cells were doped with TiO₂ NPs, Young’s modulus values drastically increased to 372 ± 60 kPa for nucleus region and 549 ± 40 kPa for cytoplasmic region (Fig. 10b).

Effects of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network of Caco-2 cells. Caco2 were treated with 15 μg/ml and 45 μg/ml of NPs for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h; cells were fixed and then stained with Phalloidin–ATTO 488 and DAPI. The 2D images of cortical actin were acquired by a Zeiss LSM700 (Zeiss) confocal microscope equipped with an Axio Observer Z1 (Zeiss) inverted microscope using a × 100, 1.46 numerical aperture oil immersion lens. All data were processed by ZEN software (Zeiss)

Effect of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network on A549 cells. A549 were treated with 15 μg/ml and 45 μg/ml of NPs for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h; successively they were fixed and stained with Phalloidin–ATTO 488 and DAPI. The 2D images of cortical actin were acquired by a Zeiss LSM700 (Zeiss) confocal microscope equipped with an Axio Observer Z1 (Zeiss) inverted microscope using a × 100, 1.46 numerical aperture oil immersion lens. All data were processed by ZEN software (Zeiss)

Local enlargement of confocal acquisitions acquired in Figs. 6 and 7 showed (more in details) the effect of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network of Caco-2 and A549 cells after the exposure of 45 μg/ml of NPs for 72 h and 96 h

Integrated density (a , b ) and coherency (c , d ) for Caco-2 and A549 cells treated with 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs after 72 h. The integrated density and coherency values were expressed as a mean value and relative SD, calculated from confocal acquisitions by ImageJ (calculation on 15 cells). The mean values and their standard deviations were reported in the histograms. Results were statistically significant for p < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, and < 0.005***). e Analyses of nucleus/cytoplasm ratio on Caco-2 and A549 after exposure to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h. The ratio was calculated on 15 cells by ImageJ. The mean values and the SD were reported in the histogram. Results were statistically significant for p  < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, and < 0.005***)

Young’s modulus values expressed in kPa, calculated from the nuclear region and the cytoskeletal area of Caco-2 (a ) and A549 (b ) cell lines after a treatment to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h

Discussion

The spread of different kind of ENPs in several fields raises awareness about the importance to assess their potential toxicity in living organisms and the environments as well, taking into account their potential application in biomedical field [46,47,48]. In vitro and in vivo investigations are crucial to enrich the scientific knowledge and to release reliable clinical and epidemiological data [49]. The toxicity tests performed on different cells are considered the golden standard to assess the safety of NPs. However, few studies have investigated the interactions between NPs and cells from a biomechanical point of view. Cell mechanic is an important factor that influences many cellular pathways, including apoptosis, differentiation, migration, cancer metastasis, and wound healing [50]. In our work, we have addressed this point and related cell viability with the changes in mechanical properties of cells treated with different NPs. Firstly, we synthetized amorphous SiO₂ NPs and crystalline TiO₂ NPs with a size of c.a. 20 nm. NPs were stable in water and DMEM up to 96 h, even upon incubation with 10% and 20% of FBS. This was found to induce an increase in NPs size due to the formation of protein corona, in perfect agreement with the literature data. [51]. Since the entry route of NPs often occurs through inhalation and ingestion, we opted to investigate the potential effects on Caco-2 and A549 cells, which are representative models for the intestinal tract and airways mimicking oral and inhalation uptake [52]. As primary investigation, we quantified the cellular internalization of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs by elemental analysis. The most effective uptake was observed in Caco-2 cells, especially upon treatment with TiO₂ NPs in a time-dependent manner. It has been reported that amorphous SiO₂ NPs, with a small size range of 15–20 nm, can bind the plasma membrane and then passively pass across the lipid bilayer to get access into the cells [53]. As demonstrated in A549 [54] and Caco-2 [55], in fact, small SiO₂ NPs can translocate in the cytoplasm with no apparent membrane encapsulation. The anatase crystalline form of TiO₂ NPs is the more chemically reactive [56] showing a faster absorption with respect to rutile, as previously reported [32]. However, the uptake mechanisms of Caco2 are still unclear, despite that some hypothesis have been formulated, some of these include metal ion release upon NPs degradation in the intestinal barrier lumen or/and direct uptake by endocytosis. [57]. In A549 cells, TiO₂ NPs were localized in cytoplasm and close the nucleus region [58]. We used WST-8 assay to assess the influence of different concentrations of SiO₂ NPs and TiO2NPs on cell viability. We have observed a general decrease of viability, especially in Caco-2, with TiO₂ NPs displaying the strongest toxicity. After assessing the viability, we monitored the extracellular release of the cytoplasmic enzyme LDH. We confirmed that the NPs induced an extensive membrane damage, which relates also to the increase of intracellular ROS levels, resulting in oxidative stress. In this context SOD, which acts as strong antioxidant against ROS [59], was significantly reduced most probably because of the unbalance of the redox repair systems. In addition, the oxidative stress increased the lipid peroxidation [60], as demonstrated by MDA measurements after NPs incubation. This is particularly evident in Caco-2 cells after TiO₂ NP exposure. It is worth mentioning that this effect can decrease membrane fluidity, which can further explain the observed higher entry levels of the TiO₂ NPs [61]. This was in significant accordance with the intracellular oxidative stress levels measured by SOD inhibition, as well as with the reactive oxygen species generation. After these assessments, we investigated the modulation of the cell cytoskeleton, as an increase of intracellular ROS could affect the F-actin organization [62]. The cytoskeleton is characterized by a set of filaments (actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments) organized in a network that affects the mechanical properties of cells, as well as their behavior [29]. In particular, actin filaments are crucial for cell mechanics, and any alterations may induce aberrations in cell morphology under sub-toxic conditions [63]. It has been demonstrated that actin was one of the most commonly bound protein by SiO₂ NPs and TiO₂ NPs in cellular extracts. This definitely suggests that the actin functions, as well as cell motility and organelles trafficking, can be strongly affected by the presence of these NPs [64, 65]. As a further proof, several in vivo studies have revealed the potential of NPs to induce alterations in the expression of genes related to the cytoskeleton [63]. In order to understand how NPs modulate the cytoskeleton, we performed qualitative and quantitative confocal analyses on Caco-2 and A549 cells, after SiO₂ NP and TIO₂ NP treatment. We focused on actin stress fibers and cortical actin because they allowed to maintain the physiological mechanical architecture of cells. As reported in Figs. 4 and 5, the treatment with NPs induced a significant reorganization of actin. This was more evident after 72 h of treatment with 45 μg/ml of NPs, and especially with the use of TiO₂ NPs. The adverse effects were stronger in intestinal cells, where we have observed the formation of protrusions and philopodia at the plasma membrane level, together with the disruption of tight junctions. Fluorescence coherency and fluorescence density have been used as quantitative parameters to assess alterations of actin distribution in the cytoskeleton. While coherency gives information about the organization of actin, density quantifies the levels of fluorescent actin. Caco-2 and A549 exposed to NPs showed a reduction of coherency compared to untreated cells, especially upon incubation with TiO₂ NPs. This was in good agreement with the qualitative confocal imaging analyses. The fluorescence density of actin was not altered by NP treatment in both the cell lines, even if untreated Caco-2 cells showed higher values with respect to untreated A549. These data could suggest a potential difference in the amount of actin, which is dependent on>the specific cell type. We also evaluated the nucleus-to-cytoplasm ratio as the relative area of the nucleus over the whole cell. We confirmed a reduction of values in A549 and an increase of the ratio in Caco-2 with respect to the control cells. This indicates changes in cell morphology after NP treatment:Caco-2 underwent an increase of nucleus area, whereas A549 became larger through cytoplasm extension. As a final point, we explored any potential change in cell elasticity upon NP treatment. Cell elasticity is commonly expressed by Young’s modulus (E), which is a ratio between the stress and the applied strain (with unit in Pascal) [66, 67]. Changes in cell elasticity due to cytoskeleton reorganization is often associated to disease progression [68], hence (E) can be a refined indicator of potential pathological states [67]. The deformability of cells was measured through indentation experiments by AFM [69]. Many studies showed the detrimental effects of NPs on the F-actin that induced an enhancement of cell elasticity. However, a clear relation between change in cell stiffness, actin rearrangement and cell viability has not been clearly established yet. Here, we have covered such topic and found that Caco-2 and A549 cells significantly change their (E) upon NP treatment, even though in two different ways. Caco-2 cells are softer as confirmed by the decreased Young’s modulus, which has been found to be a function of both the NPs type and the cell regions analyzed. In particular, TiO₂ NPs induced a general enhancement of elasticity, and this effect is more evident in the nuclear regions rather than the cytoplasmic one. On the other side, A549 displayed a remarkable increase of Young’s modulus after TiO₂ NP exposure in cytoplasm region, compared to control cells (594 ± 40 kPa versus 146 ± 26 kPa, respectively). These data indicated that TiO₂ NPs induce dose-dependent changes in force–deformation profiles in both cell lines, whereas SiO₂ NPs showed little effects. The decrease of Young’s Modulus, and consequently an increase of elasticity after NPs exposure, can potentially impact cell homeostasis and physiological pathways. The reorganization F-actin, together with a reduction of coherency, showed a strong modulation of mechanical cell properties. NPs have been demonstrated to make the nuclear region of Caco-2 cells softer than untreated cells. The increase of elasticity (corresponding to a reduction of Young’s modulus) is a critical factor in tumor progression, because it is an indicator of disruption of cell junctions, which promotes in turn cell migration and metastatization [70]. Therefore, the treatment with NPs on Caco-2 (and TiO₂ NP_S in particular) can potentially promote migration due to change of elastic properties and deformability of cells. Also, the larger and softer nucleus area can be associated to cancer progression [71].

Conclusion

In this paper, we careful assessed the adverse effects of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs on two different cell lines (Caco-2 and A549), mimicking the typical tissue that are exposed to NPs (ingestion and inhalation). SiO₂ NPs presented a low cytotoxicity in comparison with TiO₂ NPS. We demonstrated how the cellular exposure to high doses of NPs induced morphostructural changes in term of actin reorganization, coherency, density and nucleus/cytoplasm ratio, which were more evident upon TiO₂ NP treatment. Cell membrane deformability measurements showed different behavior in the two cells. In Caco-2, the cell elasticity increased after NP treatment, whereas A549 displayed an increase of stiffness. These results demonstrated that NPs induce modifications of cytoskeleton structures and, as consequence, a different Young’s Modulus values. Hence, the phenotype of cancer cells can turn into a more invasive profile, characterized by enhanced migration. On the other side, the increased stiffness observed in A549 might not promote the mobility of this specific cell indeed. We are sure that the analysis of cell mechanics upon NP exposure, combined with standard toxicological assays, will represent a golden standard to accurately assess the safety of NPs and to predict any potential possible diseases triggered by NPs.

Abréviations

A549:

Human adenocarcinoma alveolar basal epithelial cells

AFM :

Microscopie à force atomique

ATP:

Adenosine triphosphate

Caco-2:

Human epithelial colorectal adenocarcinoma

CLSM:

Confocal Laser Scanning Microscopy

DAPI :

4′,6′-Diamidino-2-phenylindole

DCF-DA:

2′,7′-Dichlorofluorescein diacetate

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMEM :

Milieu Eagle modifié de Dulbecco

ENPs:

Engineered nanoparticles

FBS:

Fetal bovine serum

HCl/HNO3:

Hydrochloric/nitric acid

ICP-AES:

Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy

LDH:

Lactate dehydrogenase

MDA:

Malondialdehyde

NH4OH:

Ammonium hydroxide

NP :

Nanoparticules

PBS :

Phosphate Buffered Saline

ROIs:

Regions of interest

ROS :

Reactive Oxygen Species

SiO2NPs:

Silicon dioxide nanoparticles

SOD:

Superoxide dismutase

TBA:

Thiobarbituric acid

TEM :

Microscopie électronique à transmission

TEOS :

Tetraethyl orthosilicate

TiO2NPS:

Titanium dioxide nanoparticles

TTIP:

Titanium (IV) isopropoxide

XRD :

Diffraction des rayons X