Décoration de nanovésicules avec peptide d'insertion à pH (bas) (pHLIP) pour une livraison ciblée

Introduction

Il y a environ un siècle, Paul Ehrlich a lancé l'idée de réaliser des « balles magiques » pour une administration spécifique et plus efficace de médicaments [1]. Les « balles magiques » devraient être capables de protéger le médicament délivré d'un environnement hostile, de réduire les effets secondaires en ciblant le médicament sur les tissus malades, d'améliorer la pharmacocinétique et la pharmacodynamique du médicament et de moduler la libération du médicament [2].

En 1965, Bangham a observé pour la première fois des vésicules à base de phospholipides [3] et, au cours des années suivantes, Gregory Gregoriadis a établi le concept selon lequel les liposomes pourraient encapsuler des médicaments puis être utilisés comme systèmes d'administration de médicaments. En particulier, ils sont composés de bicouches fermées de phospholipides (lamelles), où les chaînes lipidiques hydrophobes sont fermées entre deux couches de groupes de tête hydrophiles. La bicouche fermée entoure un noyau aqueux, permettant ainsi la localisation de médicaments respectivement lipophiles ou hydrophiles [4, 5].

La taille des liposomes est un paramètre critique pour influencer le devenir du porteur après administration, en termes d'absorption des protéines plasmatiques, de reconnaissance par le système réticulo-endothélial (RES), de mi-temps de circulation et de trafic cellulaire. Les transporteurs nanométriques peuvent favoriser l'internalisation des cellules et le ciblage des tumeurs, c'est pourquoi de nombreux chercheurs se sont concentrés sur la « nanonisation » [6,7,8,9].

Afin d'obtenir des nanosupports plus polyvalents et plus économiques, des tensioactifs synthétiques ont été utilisés pour obtenir des systèmes d'administration de médicaments de type liposome. Les tensioactifs non ioniques sont largement utilisés à cette fin, et sont capables de s'auto-assembler en vésicules unilamellaires ou multilamellaires (non -liposomes ioniques , niosomes ou vésicules de surfactant non ionique). Les tensioactifs esters de sorbitane (Spans®) sont des substances lipophiles largement utilisées dans la préparation des niosomes. Afin de prolonger le temps de circulation des vésicules et d'obtenir des nanovecteurs « furtifs », l'incorporation de polyéthylène glycol (PEG) est une approche de référence :grâce à cette conjugaison, on obtient des tensioactifs esters de sorbitan éthoxyéthylés (Tweens®). Le Span et le Tween sont tous deux caractérisés par une valeur d'équilibre hydrophile/lipophile (HLB) différente et le choix du tensioactif permet de préparer des niosomes avec les propriétés souhaitées [10]. De plus, l'ajout de cholestérol est utilisé pour améliorer la stabilité de la bicouche en étirant les queues de tensioactif, en affectant la température de transition du gel de tensioactif à la phase liquide et en conférant une rigidité à la bicouche lipophile [11, 12]. Le nanosupport « optimisé » est conçu pour améliorer la formulation et/ou renforcer le ciblage [10].

De nos jours, le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde. Les approches thérapeutiques actuelles présentent un certain nombre de limites, notamment l'administration non efficace de médicaments aux tumeurs et le manque de ciblage des tumeurs associé à des effets secondaires indésirables et dangereux, que les approches nanotechnologiques pourraient aider à surmonter [13].

Actuellement, diverses approches de ciblage sont en cours de développement. La plupart d'entre eux reposent sur le ciblage de biomarqueurs particuliers surexprimés à la surface des cellules cancéreuses. Cependant, du fait que les tumeurs humaines sont très hétérogènes, des approches plus générales de ciblage tumoral seront beaucoup plus avantageuses. L'acidité à la surface des cellules cancéreuses est une caractéristique des microenvironnements tumoraux, et elle ne dépend pas de la perfusion tumorale, elle peut donc servir de biomarqueur général pour cibler les cellules tumorales [14]. La technologie des peptides d'insertion à pH (bas) (pHLIP) se développe rapidement pour cibler les petites molécules d'imagerie et thérapeutiques, ainsi que les nanomatériaux vers les tumeurs. pHLIP détecte le pH à la surface des cellules cancéreuses et s'insère dans la membrane des cellules ciblées [15, 16]. Le mécanisme d'insertion de pHLIP est déclenché par la protonation de résidus chargés négativement du peptide à faible pH (pH <7,0). Cela conduit à une augmentation de l'hydrophobie du peptide, déplaçant ainsi l'équilibre vers la partition du peptide dans la bicouche [17]. Les nanocarriers décorés de pHLIP sont biocompatibles, peuvent cibler les tumeurs et démontrer une absorption cellulaire améliorée par les cellules cancéreuses. Parmi les nanoparticules enrobées de pHLIP étudiées figurent les nanomatériaux à base de lipides, de polymères et de métaux [18,19,20,21].

L'objectif du présent travail est de caractériser pleinement de nouveaux nanovecteurs vésiculaires décorés par pHLIP afin d'obtenir une compréhension fondamentale des caractéristiques des nanovecteurs et de faciliter la conception rationnelle de nanovecteurs sensibles à l'acidité.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Monolaurate de polyoxyéthylènesorbitan (Tween 20), monolaurate de sorbitan (Span 20), cholestérol (Chol), sel d'Hepes {N -(2-idroxyéthyl) pipérazine-N ′ -(acide 2-éthanesulfonique)}, du sérum humain, du Sephadex G-75, de la calcéine et du diphénylhexatriène (DPH) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich. 1,2-Dimyristoyl-sn -glycéro-3-phosphocholine (DMPC) et 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N Le sel de sodium du [4-(p-maléimidophényl)butyramide] (DSPE-maléimide) a été acheté auprès d'Avanti Polar Lipids et le pyrène a été obtenu auprès de Fluka. Le peptide pHLIP (ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT) a été synthétisé et purifié par CS Bio. Tous les autres produits et réactifs étaient de qualité analytique.

Synthèse de DSPE-pHLIP

pHLIP a été conjugué avec des lipides DSPE dans du méthanol par la conjugaison covalente de DSPE-maléimide avec le seul résidu cystéine à l'extrémité N-terminale de pHLIP, comme cela a été décrit précédemment [18, 21, 22]. Brièvement, 5 mg de peptide dissous dans 250 L de méthanol (soufflé avec de l'argon) et du DSPE-maléimide (à partir d'une solution mère à 9,9 mM) dissous dans du chloroforme ont été mélangés à un rapport molaire de 1:1. Le mélange réactionnel a été maintenu à température ambiante pendant environ 2 à 6 h jusqu'à ce que la conjugaison soit terminée. La progression de la réaction dans la conjugaison du DSPE-malémide avec le pHLIP a été suivie par la RP-HPLC en utilisant un gradient de 25 à 80 % d'acétonitrile dans de l'eau contenant 0,05 % de TFA en surveillant une diminution du pic correspondant au pHLIP non marqué dans le mélange réactionnel. La construction synthétisée a été caractérisée par spectrométrie de masse SELDI-TOF. La concentration du conjugué DSPE-pHLIP a été déterminée par absorbance en utilisant le coefficient d'extinction molaire pour pHLIP :ε ₂₈₀ = 13 940 M ⁻¹ cm ⁻¹ .

Préparation et purification des vésicules

La méthode d'évaporation en couche mince a été utilisée pour préparer des vésicules de surfactant non ionique (à partir de Tween 20 ou de Span 20) et de phospholipide (à partir de DMPC), avec et sans pHLIP. Dans chaque formulation de vésicules, le cholestérol a été ajouté dans différents rapports molaires (tableau 1) [23].

La composition de l'échantillon a été optimisée en choisissant des structures précédemment bien caractérisées [24, 25] auxquelles la même quantité de pHLIP a été ajoutée.

Les composants lipophiles ont d'abord été dissous dans CHCl₃ :CH₃ mélange OH (3:1); le solvant organique a ensuite été éliminé sous vide à différentes températures selon l'échantillon. Le film obtenu a été hydraté avec 5 mL de tampon Hepes (0,01 M pH 7,4) ou une solution de calcéine de sodium 10 ⁻² M. La suspension a été mélangée au vortex pendant environ 5 min, suivie d'une sonication (voir Fichier supplémentaire 1 :Tableau S1, informations complémentaires) à l'aide d'une microsonde fonctionnant à 20 kHz (VibraCell-VCX 400-Sonics, Taunton, MA, USA). La sonication LipoDMPC a été réalisée sous atmosphère inerte pour éviter l'oxydation.

La suspension de vésicules a ensuite été purifiée par chromatographie par perméation de gel en utilisant du Sephadex G-75 (colonne de verre de 50 x 1,2 cm) et du tampon Hepes comme éluant. Ensuite, la suspension de vésicules purifiée a été filtrée au moyen de filtres en cellulose avec le diamètre de pores approprié.

La même méthode de préparation a été utilisée pour préparer des niosomes et des liposomes enrobés de pHLIP.

Mesures de diffusion dynamique de la lumière

La taille moyenne et la distribution des tailles des vésicules ont été mesurées à T = 25 °C par diffusion dynamique de la lumière (DLS), à l'aide d'un Malvern NanoZetaSizer ZS90, équipé d'un laser HeNe 5 mW (longueur d'onde λ = 632,8 nm) et d'un corrélateur numérique. Les fonctions d'autocorrélation normalisées de l'intensité diffusée à 90° ont été analysées par l'algorithme de Contin pour obtenir la distribution du coefficient de diffusion des particules D , d'où la distribution du rayon hydrodynamique effectif R _H des vésicules via la relation de Stokes-Einstein R _H =K _B T /6πηD , où K _B T est l'énergie thermique et est la viscosité du solvant. La largeur de la distribution de taille des niosomes/liposomes est assez petite mais non négligeable. Les valeurs rapportées dans le tableau 2 correspondent au diamètre hydrodynamique moyen pondéré en intensité des particules [26].

ζ-Mesures de potentiel

Les mesures de mobilité électrophorétique ont été réalisées par la technique d'électrophorèse laser Doppler, en utilisant l'appareil Malvern NanoZetaSizer ZS90. La mobilité u a été converti en ζ -potentiel utilisant la relation de Smoluchowski ζ = uη/є, où η et є sont respectivement la viscosité et la permittivité de la phase solvant [27].

Diffusion des rayons X aux petits angles

Des expériences de diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) ont été menées à l'Installation européenne de rayonnement synchrotron (ESRF, Grenoble, France). L'utilisation de la ligne de lumière à haute brillance ID02 a permis d'effectuer des mesures sur des solutions diluées dans la région de transfert de quantité de mouvement 0,1 nm ⁻¹ ≤ q ≤ 6 nm ⁻¹ , q = (4π/λ)sin(θ/2), où est l'angle de diffusion et λ = 0,1 nm la longueur d'onde des rayons X. L'échelle de longueur étudiée correspondante est comprise entre 1 et 60 nm, adaptée pour accéder à la structure interne des vésicules niosomales et liposomales. Toutes les expériences ont été réalisées à T = 25 °C avec un temps d'irradiation court, 0,1 s, pour éviter les dommages dus aux rayonnements. Pour chaque échantillon, l'intensité diffusée à différents angles de diffusion a été capturée sur un détecteur 2D, puis regroupée angulairement, soustraite pour les contributions de fond et de solvant, et analysée pour obtenir des informations sur la forme et la structure interne des vésicules en solution.

Dans le cas des vésicules unilamellaires, la bicouche fermée a été modélisée avec trois coques concentriques correspondant aux groupes de tête externes, les chaînes hydrophobes et les groupes de tête internes. Une distribution de Schulz pour la taille des vésicules a été supposée.

Cryo-TEM

La solution de vésicules (gouttelette de 5 L) a été étalée sur une grille de microscopie électronique Lacey formar/carbone et conservée à l'état congelé-hydraté par une congélation rapide dans l'éthane liquide. Le processus de vitrification a été réalisé à l'aide du système FEI Vitrobot avec le réglage d'un seul blot de 3 s, un décalage de 1 et un temps de vidange et d'attente de 1 s. La microscopie électronique à transmission (MET) (JEOL 2100) avec une tension d'accélération de 200 kV à des grossissements compris entre × 10 000 et ×  150 000 a été utilisée pour imager les vésicules.

Études de stabilité

Des études de stabilité physique de niosomes et de liposomes, préparés avec et sans pHLIP, ont été réalisées à deux températures de stockage différentes (25 °C et 4 °C). L'objectif était d'évaluer si des changements significatifs de la taille et du potentiel de la dispersion des vésicules se produisent sur une période de 90 jours. Des échantillons de chaque lot ont été prélevés à des intervalles de temps définis (1, 30, 60 et 90 jours) et la taille des vésicules et le potentiel ont été déterminés comme décrit précédemment.

De même, la stabilité des vésicules a été étudiée également en présence de fluides biologiques, tels que le sérum humain. Les suspensions ont été mises en contact avec 45 % de sérum humain à 37°C. À des intervalles de temps définis (0, 30 min, 1 h, 2 h et 3 h), les variations de la taille des vésicules et du potentiel ont été déterminées comme décrit.

Caractérisation bicouche

La fluidité et la microviscosité-polarité des bicouches niosomales et liposomales ont été obtenues par des mesures de fluorescence de deux sondes fluorescentes, respectivement le diphénylhexatriène (DPH) et le pyrène, situées dans la région hydrophobe de la membrane bicouche. La DPH (2 mM) et le pyrène (4 mM), respectivement 220 L et 2,5 mg, ont été ajoutés au tensioactif ou au mélange phospholipide/cholestérol avant la préparation des vésicules [28]. Ensuite, les vésicules chargées de pyrène ont été purifiées comme décrit précédemment, tandis que les vésicules chargées de DPH ont été filtrées à travers une taille de pores progressivement plus petite (de 5,0 à 0,22 m).

Les mesures d'anisotropie de fluorescence ont été réalisées à température ambiante à l'aide d'un spectrofluoromètre LS55 (PerkinElmer, MA, USA) à λ_exc = 400 nm et λ_em = 425 nm et l'anisotropie de fluorescence (A ) des échantillons a été calculé selon l'équation suivante [29] :

où je _vv et Je _vh sont les intensités de la fluorescence émise (unités arbitraires), respectivement parallèles et perpendiculaires à la direction de la lumière d'excitation polarisée verticalement. Le facteur de correction G = I _hv /I _hh est le rapport entre les composantes d'émission polarisées verticalement et horizontalement lorsque la lumière d'excitation est polarisée horizontalement. Les valeurs d'anisotropie de fluorescence sont inversement proportionnelles à la fluidité membranaire. Par conséquent, une valeur élevée d'anisotropie de fluorescence correspond à un ordre structurel élevé et/ou à une faible fluidité membranaire [30].

Afin d'évaluer la microviscosité et la micropolarité de la bicouche vésiculaire, des expériences de fluorescence avec du pyrène ont été réalisées avec un spectrofluoromètre Perkin-Elmer LS55 à λ_exc = 330 nm, enregistrant le spectre d'émission dans la gamme 350 < λ_em < 550 nm [28]. La structure fine de la fluorescence du pyrène présente cinq pics. Le rapport entre les intensités de la première (372 nm) et de la troisième (382 nm) bandes vibrationnelles du spectre de fluorescence du pyrène, I ₁ /Je ₃ , est liée à la polarité du milieu pyrénéen [31]. En effet, les faibles valeurs du I ₁ /Je ₃ rapport correspondent à un environnement non polaire. De plus, les molécules de pyrène incorporées dans la bicouche vésiculaire peuvent former des excimères intramoléculaires et ce processus est sensible à la viscosité du microenvironnement de la sonde [32]. Par conséquent, le rapport d'intensité de fluorescence excimère/monomère, I _E /Je _M , est lié à la microviscosité.

Ces études ont été réalisées sur les vésicules préparées avec et sans pHLIP et les résultats obtenus ont ensuite été comparés.

Études de libération de Calcein

Des vésicules de surfactant non ionique ou de phospholipides ont été chargées de calcéine à une concentration de 10 ⁻² M. A cette concentration, la fluorescence de la calcéine s'éteint automatiquement [33]. Des mesures d'extinction ont ensuite été utilisées pour déterminer la libération de calcéine du noyau aqueux de la vésicule. La sonde fluorescente a été chargée dans les vésicules lors de l'hydratation du film mince par addition de 5 mL de la solution aqueuse de calcéine. Les suspensions de vésicules ont été purifiées par chromatographie par perméation de gel, mises en contact avec 45 % de sérum humain ou Hepes, puis chargées à l'intérieur d'un sac de dialyse à membrane de cellulose (poids moléculaire seuil 8.000 Da de Spectra/Por®). Les expériences de libération ont été réalisées à 37°C, sous agitation magnétique dans du tampon Hepes (10 mM, pH 7,4) comme milieu externe. Des aliquotes du milieu externe ont été prélevées à différents moments sur 0 à 24 h. De temps en temps, les aliquotes retirées étaient réintroduites dans le système [34].

La libération de calcéine a été suivie par des mesures de la fluorescence du milieu à l'aide d'un spectrofluoromètre Perkin-Elmer LS50B avec λ_ex = 492 et λ_em = 520 nm. La valeur de référence F _∞ (unités arbitraires), corrélée à la quantité totale de calcéine piégée dans les vésicules [35], a été déterminée après rupture des vésicules à l'aide d'alcool isopropylique (1:1 v /v ). Les pourcentages de libération (F %) à chaque instant ont été obtenus à l'aide de l'équation suivante :

où F _t (unités arbitraires) est la fluorescence lue à un instant spécifique t .

Analyse statistique

Une ANOVA à un facteur a été utilisée pour l'analyse statistique. A posteriori Bonferroni t test a été réalisé pour évaluer la signification statistique du test ANOVA. Un p une valeur <0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Les résultats sont la moyenne de trois expériences ± écart-type.

Résultats et discussion

Les vésicules Tween20, Span20 et DMPC, préparées avec et sans DSPE-pHLIP, ont été caractérisées en termes de taille et de potentiel (tableau 2).

Selon les résultats présentés dans le tableau 2, les échantillons analysés ne présentent pas de variations significatives de taille ou de potentiel , quelle que soit la présence de pHLIP.

Les fourchettes de tailles rapportées ci-dessus ont été confirmées au moyen d'une technique d'analyse différente, telle que le cryo-MET (Fig. 1).

Images cryo-TEM représentatives de niosomes et de liposomes recouverts de pHLIP. Images de niosomes NioSpan20-pHLIP (a ) et des liposomes LipoDMPC-pHLIP (b ) obtenu au grossissement × 10 000 et liposomes LipoDMPC-pHLIP (c ) obtenu au grossissement × 40 000

La structure interne des niosomes/vésicules avec et sans DSPE-pHLIP a été déterminée par des expériences SAXS. Les spectres d'intensité SAXS, présentés sur la figure 2, sont différents, indiquant que chaque système a des caractéristiques particulières.

spectres SAXS. Spectres d'intensité des niosomes/vésicules sans (symboles noirs ouverts) et avec DSPE-pHLIP (symboles de couleur)

Les niosomes à base de Tween20 sont unilamellaires, tandis que les vésicules de DMPC présentent un certain degré de multilamellarité (sous forme de liposomes), comme le montre la présence du pic caractéristique à q ≅ 1 nm ⁻¹ , correspondant à une distance interlamellaire de 6 nm (environ 5 nm de bicouche lipidique et 1 nm d'eau). Les vésicules à base de Span20 sont définitivement multilamellaires, avec un pic caractéristique à q = 1,6 nm ⁻¹ correspondant à une distance interlamellaire de 3,8 nm, correspondant à deux fois la longueur de la molécule Span20. Les résultats indiquent que la coquille multicouche des vésicules Span20 est composée de bicouches adjacentes avec presque pas d'eau interlamellaire.

La présence de DSPE-pHLIP (moins de 1% de fraction molaire) n'affecte pas considérablement les systèmes. L'intensité diffusée dans tous les q étudiés -la plage est assez similaire, indiquant une fraction comparable de matériau structuré et une taille globale comparable des particules vésiculaires.

Les vésicules à base de DMPC montrent une légère augmentation du nombre de bicouches dans le liposome, comme en témoigne l'augmentation d'intensité du pic de Bragg à q = 1 nm ⁻¹ . L'insertion d'une faible fraction de chaînes DSPE C18, liées à chaque molécule peptidique, ne modifie pas l'épaisseur de la bicouche lipidique, et principalement dictée par la fraction importante de cholestérol par rapport au DMPC (environ 40 à 50 %). A cette concentration en cholestérol, les chaînes lipidiques sont organisées en phase liquide ordonnée (Lo), et caractérisées par le découplage de l'ordre de position latéral faible des chaînes par rapport à l'ordre d'orientation élevé le long des chaînes et capable d'héberger peu de C18- chaînes sans aucun changement structurel [36]. De plus, les vésicules multicouches basées sur Span20 ne présentent aucun changement dans leur structure interne.

Dans le système Tween20 + pHLIP, une petite quantité de cristallites de cholestérol est présente, comme le montre le pic net typique à q = 1.84 nm ⁻¹ (distance caractéristique de 3,41 nm) et la structure des vésicules n'est pas affectée. La présence de quelques microcristallites a souvent été associée aux niosomes à base de Tween [37] en quantité en fonction de la composition, de la procédure de préparation et de la purification. Sur la figure 2, les deux spectres expérimentaux des vésicules Tween20 et Tween20 + pHLIP sont présentés avec les courbes d'ajustement obtenues en modélisant la bicouche sphériquement fermée avec trois coques concentriques :les groupes de tête externes, les chaînes et les groupes de tête internes. La taille moyenne des vésicules est d'environ 168 nm dans les deux systèmes, en accord avec les résultats du DLS. Les paramètres structuraux sont les mêmes pour les deux bicouches fermées (voir Fiche complémentaire 1 :Figure S1 et Tableau S2) sauf pour la coque externe :en présence de DSPE-pHLIP, une légère diminution (5%) de la densité électronique des headgroups est observée (de 0,42 à 0,40 e/Å ³ ), accompagnée d'une augmentation de la rugosité de la couche. Ce résultat indique que l'ajout de DSPE-pHLIP affecte principalement l'enveloppe externe des vésicules. Ceci est cohérent avec une image où les chaînes DSPE C18 s'insèrent dans la bicouche et ancrent le peptide à la surface des vésicules, parmi les groupes de tête étendus et ramifiés de polyéthylène-glycol. Nous notons que la capacité du peptide pHLIP lui-même (non lié aux molécules lipidiques) à interagir avec la surface externe des vésicules à pH élevé et à s'insérer dans la bicouche à faible pH a été récemment observée par SAXS dans le cas des bicouches phospholipidiques insaturées [38 ]. Dans la présente étude, la fraction molaire du peptide est significativement plus faible et le peptide est lié aux lipides, car l'objectif est de concevoir des nanovecteurs de médicaments sensibles au pH revêtus de pHLIP. L'association pHLIP est entraînée par l'interaction hydrophobe des chaînes DSPE C18 conjuguées s'insérant dans la région hydrophobe du nanovecteur. Le peptide pHLIP est ancré et se trouve dans la région du groupe de tête externe, susceptible d'interagir avec les membranes cibles à pH acide et/ou de libérer le contenu du nanovecteur après réarrangement de la bicouche dans un environnement à faible pH.

Pour déterminer si la présence de pHLIP pourrait affecter les propriétés microrhéologiques de la bicouche (fluidité, microviscosité et polarité), une caractérisation de la coquille lipophile a été réalisée. Les études de caractérisation ont été réalisées en utilisant la sonde fluorescente pyrène, ajoutée aux échantillons au début de la procédure de préparation. En raison de sa nature lipophile, il s'insère dans la bicouche vésiculaire et fournit des informations sur la polarité et la microviscosité de l'environnement membranaire.

Comme le montre le tableau 3, dans les trois ensembles d'échantillons, les valeurs de polarité ne diminuent que légèrement en présence de pHLIP par rapport à la vésicule homologue sans pHLIP, tandis que les valeurs de microviscosité montrent une multiplication par trois, pour toutes les vésicules.

La bicouche a en outre été caractérisée par des mesures d'anisotropie de fluorescence d'une autre sonde fluorescente lipophile, DPH, incorporée dans les lipides. Ces mesures reflètent le mouvement de la sonde et son orientation au sein de la bicouche qui renseignent sur la fluidité de la bicouche pouvant affecter la capacité des vésicules à libérer leur contenu [29]. Les valeurs d'anisotropie de fluorescence sont inversement proportionnelles à la fluidité de la membrane. Par conséquent, une valeur élevée d'anisotropie de fluorescence correspond à un ordre structurel élevé et/ou à une faible fluidité membranaire, comme dans la phase liquide ordonnée [30].

Les valeurs d'anisotropie pour chaque échantillon sont présentées dans le tableau 3. Les données indiquent que la présence de DSPE-pHLIP dans les vésicules augmente la fluidité membranaire, puisque l'anisotropie de fluorescence a diminué. Il est bien connu que la fluidité de la bicouche est affectée non seulement par l'ordre et l'organisation latérale des chaînes apolaires mais aussi par les groupes de tête polaires [31]. Les résultats SAXS sur les trois systèmes différents montrent que les molécules DSPE-pHLIP affectent principalement la région du groupe de tête, provoquant éventuellement un tassement différent des têtes polaires. Les résultats structuraux semblent correspondre aux propriétés microrhéologiques des bicouches en présence de DSPE-pHLIP associé comme révélé par l'insertion de deux sondes différentes. Les résultats montrent une augmentation de la microviscosité révélée par le pyrène, une sonde qui pourrait s'insérer près de la région externe (le log P du pyrène est de 4,88). D'autre part, la DPH est supposée être noyée au cœur des bicouches, orientée parallèlement à l'axe de la chaîne lipidique acyle ou contrainte au centre de la bicouche, parallèlement à la surface. Il est largement sensible à la réorientation angulaire des chaînes acyles amphiphiles [39]. L'augmentation de la fluidité, révélée par le DPH, pourrait être liée à la fois à l'effet de l'insertion de chaînes DSPE parmi les autres chaînes acyles et à l'effet de la partition pHLIP dans la région des groupes de tête polaires, modifiant les propriétés de tassement des tensioactifs. (Fig.3).

Représentation des interactions pHLIP avec la membrane vésiculaire

D'autres études de caractérisation ont été menées sur les préparations examinées. Tous les échantillons, préparés avec et sans pHLIP, ont été conservés 90 jours à une température de 4°C afin d'évaluer la stabilité des vésicules dans le temps, en mesurant leur taille et les variations de potentiel ζ (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2). Aucune variation significative de taille et de potentiel n'a été observée au cours de l'expérience; par conséquent, toutes les préparations examinées se sont révélées stables si elles étaient conservées à une température de 4 °C.

De plus, la stabilité des échantillons a été examinée en présence de 90 % (v /v ) sérum humain et conservé à 37 °C pendant 3 h (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3).

Au contact du sérum humain, les vésicules de Tween20 ont montré une augmentation de taille, bien qu'elles soient restées inférieures à 300 nm. La taille et les valeurs PDI ont été mesurées pour être constantes tout au long de l'expérience de 3 h, ce qui suggère que les vésicules en suspension sont restées intactes tout au long de l'expérience.

Les deux échantillons Span20 en contact avec le sérum humain ont montré une augmentation de taille, en particulier dans la préparation avec pHLIP, tandis que les valeurs PDI suggèrent une distribution de taille homogène (données non présentées). Cet événement peut être dû à l'absorption de protéines plasmatiques à la surface du niosome, à la suite d'interactions électrostatiques, cependant, sans entraîner de rupture des vésicules. Cette hypothèse est étayée par la diminution du potentiel après le contact des vésicules avec le sérum humain. Ce phénomène se produit lorsque le potentiel ζ atteint des valeurs légèrement négatives, autour de la zone de neutralité, rendant le système instable, et les vésicules commencent à s'agréger.

En plus du Tween20, les vésicules de DMPC montrent une augmentation de taille par rapport à l'échantillon de pré-contact. Cependant, cette variation s'est avérée non significative et les valeurs de taille maintenues sous 280 nm (DMPC) ou sous 240 nm (DMPC + pHLIP).

La capacité de libération a été évaluée pour les échantillons préparés avec et sans pHLIP en fonction de la quantité de calcéine (sonde hydrophile) libérée des vésicules au cours du temps.

Les études ont été réalisées à la température de 37 °C pendant une période de 24 h, en exposant les échantillons purifiés avec soit du tampon HEPES soit du sérum humain. Comme le montre la figure 4, les profils de libération de calcéine s'avèrent très similaires pour le Tween20 et le Tween20-pHLIP dans le tampon HEPES ou le sérum humain.

Profil de libération de la calcéine. NioTween20 et NioTween20-pHLIP mis en contact avec le tampon HEPES (a ) ou sérum humain (b )

La quantité de calcéine libérée était comprise entre 30 et 50 %, ce qui n'indique aucune différence dans les capacités de libération entre les échantillons préparés avec et sans pHLIP.

Les mêmes résultats ont été obtenus pour les échantillons Span et DMPC (données non présentées).

Des profils de libération comparables ont été rapportés pour différents nanosupports sensibles aux stimuli, tels que les cubosomes thermosensibles [40] ou les nanosupports polymères auto-assemblés (SAN) [41, 42].

En conclusion, les différences physico-chimiques observées en termes de microviscosité et de fluidité pour les échantillons préparés avec et sans pHLIP (Tableau 3) n'affectent pas leurs capacités de libération (Fig. 4), d'après la preuve que l'insertion de DSPE-pHLIP les molécules affectent principalement la région du groupe de tête. Ces données sont en accord avec les résultats précédemment rapportés montrant qu'à des pH neutres et élevés, pHLIP est lié à la surface des liposomes fabriqués par 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn -glycéro-3-phosphocholine (POPC) et n'induit pas de fusion ni de fuite membranaire.

Conclusion

Cette étude confirme la possibilité de préparer des vésicules décorées de pHLIP. Les échantillons sont stables s'ils sont conservés à une température de 4 °C pendant au moins 3 mois et en présence de sérum. De plus, les nanovecteurs proposés sont capables de piéger une sonde hydrophile et de moduler sa libération.

Les vésicules pHLIP ont été entièrement caractérisées afin d'obtenir une compréhension fondamentale des caractéristiques des nanosupports et de faciliter la conception rationnelle de nanovecteurs sensibles à l'acidité.

The pHLIP association is driven by the hydrophobic interaction of the conjugated DSPE C18-chains inserting in the hydrophobic region of the nanovector. The pHLIP peptide is anchored and lies in the external headgroup region, prone to interact with target membranes at acidic pH and/or to release the nanovector content after bilayer rearrangement in low pH environment.

According to these findings, proposed pHLIP decorated vesicles could be useful to obtain a prolonged (modified) release of biological active substances for targeting tumors and other acidic diseased tissues.

Abréviations

Chol:

Cholesterol

Cryo-TEM:

Cryo-transmission electron microscopy

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMPC:

1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

DPH:

Diphenylhexatriene

pHLIP:

pH (low) insertion peptide

SAXS:

Small angle X-ray scattering

Span20:

Sorbitan monolaurate

Tween20:

Polyoxyethylenesorbitan monolaurate