Évaluation de l'activité du cytochrome P450 3A4 inhibée par les nanoparticules d'or et des mécanismes moléculaires sous-jacents à sa toxicité cellulaire dans la lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire humain C3A

Contexte

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est l'un des cancers les plus fréquents dans le monde et la cause de mortalité par cancer à la croissance la plus rapide aux États-Unis [1, 2]. Étant donné que le CHC a été diagnostiqué à des stades avancés, les traitements curatifs du CHC comprennent la transplantation hépatique ou la résection chirurgicale au début du développement tumoral et la chimiothérapie et la radiothérapie pour un état tumoral avancé. Le HCC développe souvent une résistance élevée aux agents antinéoplasiques conventionnels, une molécule cytotoxique non sélective qui pourrait entraîner des effets indésirables systémiques. Les progrès récents de la thérapie génique, c'est-à-dire la thérapie génique basée sur l'interférence ARN (ARNi), ont été utilisés dans le traitement actuel du CHC [3, 4]. L'efficacité de l'ARNi nécessite que le vecteur soit délivré à l'intérieur de la cellule cible [5]. Les vecteurs pour une délivrance réussie de gènes sont des vecteurs viraux et non viraux. Les virus offrent une plus grande efficacité de livraison de gènes, mais les vecteurs non viraux sont préférés en raison de problèmes de sécurité avec les vecteurs viraux. Les nanoparticules (NP) en tant que vecteurs non viraux pour l'administration ciblée de gènes ou le système d'administration de médicaments ont attiré une grande attention pour améliorer l'efficacité thérapeutique et réduire la toxicité aux niveaux systémiques et/ou cellulaires dans le traitement du CHC [4, 6]. Ainsi, il devient très important d'identifier le mécanisme moléculaire et la voie biologique qui sous-tendent la perturbation cellulaire et la toxicité des NP dans les cellules et tissus cibles. Des études in vitro récentes ont démontré que le profilage de l'expression génique combiné à des réponses cellulaires et biochimiques a fourni une évaluation directe de la perturbation cellulaire et de la toxicité potentielle des NP [7,8,9,10].

Les nanoparticules d'or (AuNP) ont été utilisées comme véhicule de livraison pour la livraison spécifique à la cible de fragments d'inactivation génique, seuls ou en combinaison avec d'autres médicaments en raison de leurs propriétés physico-chimiques uniques et de leur chimie de surface [11, 12]. L'interaction de l'AuNP avec les protéines du plasma sanguin forme une couronne protéique, qui à son tour altère la chimie de surface des NP et influence les réponses biologiques ultérieures telles que l'absorption cellulaire et la toxicité potentielle [13, 14]. Les absorptions cellulaires d'AuNP dans différentes lignées cellulaires cancéreuses humaines et cellules primaires ont été affectées de manière critique par la formation de couronnes protéiques, indépendamment de la taille et de la charge de surface [7,8,9, 14,15,16,17].

Le stress oxydatif dépendant de la taille et de la charge de surface a également été observé dans la lignée cellulaire de cancer du sein humain, MDA-MB-231, le carcinome hépatocellulaire HepG2 et les cellules de leucémie humaine HL-60 en réponse à AuNP, qui étaient associées à la cytotoxicité des NP [18 , 19]. La cytotoxicité induite par AuNP s'est produite dans diverses lignées cellulaires cancéreuses humaines et cellules humaines primaires d'une manière spécifique au type cellulaire [7,8,9, 20, 21].

Les enzymes du cytochrome P450 (CYP) jouent un rôle important dans la bioactivation ou l'inactivation de nombreux médicaments cytotoxiques et la susceptibilité de l'hôte à la cancérogénicité des médicaments anticancéreux [22]. AuNP a influencé l'activité catalytique des enzymes CYP aux niveaux cellulaire et moléculaire in vivo et in vitro [7, 23, 24, 25]. AuNP a considérablement présenté l'expression génique différentielle principalement impliquée dans les marqueurs de stress oxydatif dans la lignée cellulaire de fibroblastes pulmonaires humains MRC-5, et le dysfonctionnement mitochondrial dans les cellules de la veine ombilicale humaine (HUVEC) et les hépatocytes humains, qui sont en corrélation avec une augmentation de la production de peroxyde lipidique et un cytotoxicité élevée [8, 9, 26]. Bien que cette connaissance suggère réciproquement que l'AuNP provoque la mort cellulaire apoptotique ou nécrotique dans divers types cellulaires et altère les fonctions cellulaires et biochimiques combinées à l'expression différentielle des gènes dans les voies de réponse au stress et la toxicité, les voies spécifiques par lesquelles AuNP exerce ses effets toxiques au sein de la cellule ou biologique système restent inconnus.

Ici, cette étude a examiné les effets de la couronne protéique, de la taille et de la charge de surface sur l'interaction AuNP avec la cellule humaine HCC C3A. Principalement, l'absorption cellulaire dépendante du temps des AuNP de 40 et 80 nm fonctionnalisés avec du BPEI cationique, de l'acide lipoïque anionique (LA) ou du polyéthylène glycol neutre (PEG) dans les cellules C3A a été déterminée avec et sans couronne de protéine plasmatique humaine (PC). Deuxièmement, la cytotoxicité induite par l'AuNP et la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS)/d'espèces réactives de l'azote (RNS) ont été surveillées ainsi que leurs effets inhibiteurs sur l'activité du CYP3A4. Enfin, le mécanisme d'action moléculaire associé à la toxicité de l'AuNP a été caractérisé à l'aide du Human Molecular Toxicology Pathway Finder et du Human Drug Transporters RT ² Puce de PCR Profiler™.

Méthodes

Synthèse de nanoparticules d'or

Le BPEI cationique 40 et 80 nm, le LA anionique et le PEG Biopure ™ AuNP neutre ont été synthétisés sur mesure à partir de nanoComposix (San Diego, CA). La taille des particules, l'indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zêta (z) et les propriétés spectrales ont été caractérisés par diffusion dynamique de la lumière (DLS), microscopie électronique à transmission (MET) et spectroscopie UV-Vis. Les AuNP ont été synthétisés par la réduction de l'hydrate de tétrachloroaurate d'hydrogène (III) dans une solution aqueuse de carbonate de potassium suivie du processus de vieillissement et d'une filtration à flux tangentiel (TFF). La surface AuNP a été fonctionnalisée avec du LA ou du PEG en ajoutant de l'acide dihydrolipoïque (0,2:1, w /w ) ou PEG à terminaison thiol-méthoxy (Laysan Bio Inc., Arab, AL) (0,5:1, w /w ), respectivement, suivi d'un lavage TFF et d'une filtration stérile. Les surfaces fonctionnalisées par BPEI d'AuNP ont été synthétisées via la chimie EDC en liant l'acide carboxylique de LA aux amines libres de BPEI, suivi d'un lavage TFF et d'une centrifugation ultérieure pour éliminer le BPEI non lié.

Préparation Corona Protéine

Plasma sanguin humain poolé (n =5) ont été obtenus auprès de Biological Specialty Corp. (Colmar, PA). AuNP ont été incubés dans du plasma humain (55 %, v /v ) à une vitesse constante de 250 tr/min à 37 °C pendant 1 h, comme indiqué [7, 8]. Les protéines non liées et faiblement associées ont été éliminées par des lavages répétés avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 20 000 ×g pendant 20 min à 20 °C. Les AuNP finales de la couronne de protéine plasmatique humaine (PC) ont été dispersées dans du PBS puis diluées dans un milieu de culture cellulaire pour une caractérisation physico-chimique ou un dosage plus poussé. Le protocole détaillé est donné dans le fichier supplémentaire 1.

Caractérisation physicochimique de l'AuNP

Diamètres hydrodynamiques (D _H ), le PDI et le potentiel z des AuNP nus à 40 et 80 nm (pas de PC) fonctionnalisés avec BPEI, LA et PEG dans de l'eau déionisée (DI) ont été analysés à 25 °C à 0 h en utilisant le Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, Royaume-Uni); pour AuNP revêtu de PC dans du PBS à 25 °C à 0 h ; et pour tous les AuNP nus et PC en milieu de culture cellulaire complet à 37 °C à 0 h et 24 h. Milieu de culture cellulaire complet contenant du milieu essentiel minimum d'Eagle (EMEM) complété avec 10 % de FBS (ATCC ^® , Manassas, Virginie). Un échantillon a été mesuré 5 fois avec 11 sous-analyses de 10 s chacune. De plus, les spectres d'absorption optique ont été mesurés à l'aide du lecteur de microplaques multimode hybride Synergy H1 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT) à température ambiante à 0 h.

Microscope électronique à transmission

La morphologie de l'AuNP a été caractérisée par MET. Toutes les solutions d'AuNP nues et PC (5 μL) ont été placées sur des grilles de cuivre de 200 mailles suivies d'un séchage à l'air à température ambiante. Les échantillons ont été visualisés sur un Tecnai G2 Spirit BioTWIN avec un détecteur Oxford (FEI Company, Hillsboro, OR) à une tension d'accélération de 120 kV. La suite de microscopie GATAN (GATAN Inc., Pleasanton, CA) a mesuré les diamètres AuNP.

Culture cellulaire et mesure de la viabilité

Cellules de carcinome hépatocellulaire humain C3A (ATCC ^® CRL-10741™) ont été achetés auprès d'ATCC ^® (Manassas, VA), cultivé en EMEM complet (ATCC ^® , Manassas, VA) complété avec 10 % de FBS et étendu à environ 80 % de confluence dans un flacon T75 avec des changements de milieu tous les 4 jours. Après 0,25% (w /v ) trypsine–0,53 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), les cellules ont été étalées dans des plaques à 96 puits à 8 × 10 ⁴ cellules par puits et incubées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 95 % d'air et 5 % de CO_2. Après 48 h d'incubation, les cellules ont été dosées avec AuNP en l'absence et en présence de PC. Les cellules C3A entre les passages 9 et 12 ont été utilisées pour le dosage.

La viabilité du C3A a été déterminée à l'aide de l'alamarBlue ^® test de viabilité (Thermo Sci., Waltham, MA) comme décrit [7, 27]. Les cellules dans les plaques à 96 puits ont été traitées avec les BPEI-, LA- et PEG-AuNP à 40 et 80 nm avec et sans PC allant de 0 à 250 μg/cm ² . Après 24 h, 10 % d'alamarBlue ^® réactif en EMEM complet (v /v ) a été ajouté à la culture cellulaire et incubé pendant 3 h à 37 °C. L'EMEM complet a servi de dispersant. Les interactions de l'AuNP avec le principe actif de l'alamarBlue ^® réactif, la résazurine ou un produit réduit, la résorufine ont été mesurés comme témoins. L'AuNP et la résazurine (pas de cellules) ou le milieu de maintenance (pas de cellules) ont servi de témoins de fond. La fluorescence, proportionnelle à la viabilité cellulaire, a été normalisée par rapport aux témoins et exprimée en pourcentage par rapport au groupe de cellules témoins.

Mesure de l'absorption cellulaire avec spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif

Les cellules ont été ensemencées à 8 × 10 ⁴ cellules par puits de plaques 96 puits et dosées à une concentration non toxique de 1,56 μg/cm ² de tous les AuNP nus et PC pendant 0,5, 1, 3, 6, 12 et 24 h. L'étape de gravure a été incorporée pour éliminer l'AuNP lié à la membrane cellulaire et sa liaison non spécifique aux puits, comme indiqué précédemment [28]. La récolte cellulaire a été séchée et digérée dans l'eau régale et la concentration en Au intracellulaire a été quantifiée à l'aide du NexION ^™ Spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif 350X (ICP-MS) (PerkinElmer, Waltham, MA). L'absorption cellulaire d'AuNP a été calculée comme indiqué précédemment et exprimée en nombre d'AuNP par cellule [29]. Le protocole détaillé est donné dans la Fiche Complémentaire 1.

Mesures du stress oxydant/nitrosatif

Les cellules ont été ensemencées à 8 × 10 ⁴ cellules par puits de plaques 96 puits et dosées avec les 40 nm nus BPEI- et PEG-AuNP jusqu'à 125 μg/cm ² pendant 1, 3 et 24 h. La mesure directe du stress oxygène/nitrosatif a été dosée avec le kit de dosage des espèces réactives totales de l'oxygène (ROS)/superoxyde (SO) (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) comme décrit précédemment [30]. La fluorescence, proportionnelle à l'augmentation des ROS/espèces azotées réactives (RNS) (Ex488/Em520 nm) ou SO (Ex550/Em610 nm) a été mesurée avec le lecteur de microplaques. Le protocole détaillé est donné dans la Fiche Complémentaire 1.

Activité du cytochrome P450 3A4

Les effets indésirables des AuNP nus et PC à 40 et 80 nm sur l'activité du CYP3A4 ont été caractérisés à l'aide des tests P450-Glo™ (Promega Corp., Madison, WI) comme décrit en détail [7]. Les cellules C3A dans des plaques à 96 puits ont été dosées à la concentration létale médiane (LC₅₀ ) : 127,3 μg/cm ² du 40 nm BPEI-AuNP, 205,5 μg/cm ² du 80 nm BPEI-AuNP, 192,5 μg/cm ² du LA-AuNP 40 nm et 129,5 μg/cm ² du PEG-AuNP 40 nm. Depuis LC₅₀ les valeurs de 80 nm LA- et PEG-AuNP n'ont pas été déterminées, les cellules ont été traitées avec LC₅₀ valeurs de 40 nm LA- et PEG-AuNP (192,5 μg/cm ² et 129,5 μg/cm ² , respectivement). Après la fin des 24 heures d'incubation, les cellules ont été incubées avec un substrat du CYP3A4 (luciférine-IPA) à 37 °C pendant 3 h. Le signal de luminescence, proportionnel à une activité enzymatique, a été mesuré avec un lecteur de microplaques puis normalisé par rapport aux témoins. Des contrôles ont été assignés pour évaluer l'interaction de l'AuNP avec les substrats parentaux ou les métabolites et les substrats acellulaires. L'activité CYP a été exprimée en pourcentage par rapport au groupe de cellules de contrôle.

Profilage d'expression génique

Étant donné que le PEG-AuNP toxique à 40 nm a été utilisé dans l'inhibition de l'activité du CYP3A4 et de l'activité antioxydante dans les cellules C3A présentant une absorption cellulaire élevée, il a été sélectionné pour caractériser les mécanismes d'action moléculaires qui sous-tendent sa toxicité et ses réponses cellulaires différentielles. Les cellules ont été ensemencées à 2,5 × 10 ⁶ cellules par puits de plaques 6 puits et dosées en LC₅₀ valeur du PEG-AuNP 40 nm pendant 24 h à 37 °C. À la fin de l'incubation, les cellules ont été soumises à un isolement d'ARN, puis à une synthèse d'ADNc à l'aide d'ARN total avec une valeur moyenne de nombre d'intégrité de l'ARN (RIN) de 7,8 comme décrit précédemment [7,8,9]. L'ADNc résultant a été mélangé avec RT ² SYBR green master mix (Qiagen Inc., Valencia, CA), puis appliqué au Human Molecular Toxicology Pathway Finder ou au Human Drug Transporters RT ² Puces de PCR Profiler™ dans Quantstudio™ 7 Flex (Applied BioSystem, Foster City, CA). Gènes exprimés de manière différentielle avec le changement de pli <− 2 et> 2 et un p <0,05 représentait une régulation à la baisse et à la hausse du gène d'intérêt. Pour valider le RT ² PCR array data, une expression de neuf gènes sélectionnés a été évaluée avec la synthèse d'ADNc et la PCR en temps réel qui a suivi. Les séquences d'amorces sont résumées dans le fichier supplémentaire 1 :tableau S1. Toutes les réactions PCR ont été réalisées en triple. Le protocole détaillé des conditions et de la quantification de la PCR en temps réel est donné dans le fichier complémentaire 1.

Analyse statistique

Concentration létale médiane (CL₅₀ ) les valeurs d'AuNP dans les cellules C3A ont été estimées en ajustant une équation de Hill avec une pente variable aux données observées (l'entrée des niveaux de concentration d'AuNP et la viabilité cellulaire correspondante) à l'aide de GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA) comme décrit [7]. Une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) a été réalisée à l'aide de SAS 9.4 (SAS Institute, Cary, NC) pour évaluer les effets de l'AuNP sur la production de ROS/RNS et l'absorption cellulaire dans les cellules C3A. Si elle est significative, la comparaison multiple a été effectuée avec le test de différence significative honnête (HSD) de Tukey à un p < 0,05.

Résultats et discussion

Caractérisation physico-chimique des PC AuNP de plasma nu et humain

Les effets de la taille des NP, de la charge de surface et de la formation de PC plasmatiques humains autour d'AuNP sur le diamètre hydrodynamique (D_H ), l'indice de polydispersité (PDI), le potentiel z et une propriété spectrale ainsi que la morphologie ont été caractérisés par spectroscopie DLS, TEM et UV-Vis (Fig. 1). Dans les images MET, tous les AuNP nus (pas de PC) dans l'eau DI étaient monodispersés avec une distribution de taille serrée et des plages de spectre UV-Vis uniques de 521 à 553 nm (Fig. 1a). Des formations de PC autour de l'AuNP ont été observées avec les changements de distribution de taille et les décalages vers le rouge des spectres d'absorption (Fig. 1b). Le D _H et les valeurs PDI des 40 et 80 nm nus et PC AuNP dans l'EMEM complet étaient compatibles jusqu'à 24 h à 37 °C sauf pour les PC BPEI-AuNP à 40 et 80 nm qui ont montré une diminution des valeurs PDI (0,29 et 0,32, respectivement ) à 24 h à 37 °C par rapport à ceux à 0 h à 37 °C (0,62 et 1,0, respectivement) (tableau 1). Les valeurs de potentiel Z de tous les AuNP nus et PC ont relativement diminué à 24 h à 37 °C par rapport à celles à 0 h à 37 °C. Une agrégation des PC BPEI-AuNP à 40 et 80 nm dans du PBS et de l'EMEM complet a été observée, ce qui est corrélé avec plusieurs pics dans une distribution de taille et des changements dans D_H et les décalages vers le rouge des spectres d'absorbance par rapport au BPEI-AuNP nu (Fig. 1 et fichier supplémentaire 1 :Figure S1, Tableau 1). Ces résultats ont été corroborés par les études récentes selon lesquelles le PC 40 et 80 nm et le BPEI-AuNP enrobé de sérum albumine humaine ont été agrégés dans du PBS et divers milieux de culture cellulaire [7,8,9].

Micrographies électroniques à transmission de a AuNP dans de l'eau déminéralisée et b PC AuNP dans du PBS à 0 h à 25 °C, longueur d'onde des spectres UV-Vis (encart supérieur) et distribution dynamique de la diffusion de la lumière (encart inférieur). Les flèches indiquent la formation de PC. PC couronne de protéines plasmatiques humaines, BPEI polyéthylèneimine ramifiée, LA acide lipoïque, PEG polyéthylène glycol

Cytotoxicité AuNP

La cytotoxicité de l'AuNP a été mesurée en utilisant la concentration létale médiane (LC₅₀ ) dans les cellules C3A. La charge de surface NP, la taille des particules et la formation de PC autour de la LC dépendante de NP₅₀ les analyses avec AuNP ont été montrées dans la Fig. 2. Tous les BPEI-, LA et PEG-AuNP à 40 nm et le BPEI-AuNP à 80 nm étaient cytotoxiques pour les cellules C3A avec la LC₅₀ correspondante. varie de 127,3 à 205,5 μg/cm ² (Fig. 2a). Le PEG-AuNP nu à 80 nm présentait une viabilité cellulaire de 59 % à la concentration la plus élevée de 250 μg/cm ² , alors que les LA-AuNP à 80 nm n'étaient pas cytotoxiques. Le PC a réduit la toxicité de l'AuNP en fonction de la taille et de la modification de la charge de surface, à l'exception du BPEI-AuNP à 80 nm qui a montré une viabilité cellulaire de 51 % à 250 μg/cm ² à 24 h (Fig. 2b). Des études récentes ont démontré que le BPEI-AuNP nu à 40 nm était toxique pour les hépatocytes humains primaires, les HUVEC et les cellules tubulaires proximales rénales humaines (HPTC) (LC₅₀ varie de 22,4 à 80,3 μg/cm ² ) [7,8,9]. Les BPEI-AuNP recouverts de PC étaient cytotoxiques pour les hépatocytes humains, mais les AuNP recouverts de HSA n'étaient pas cytotoxiques [7]. Ces résultats suggèrent que les cellules C3A sont plus résistantes à la toxicité AuNP que les cellules humaines primaires en raison d'un taux de prolifération et d'une activité métabolique élevés de la lignée cellulaire cancéreuse [31].

Viabilité C3A et LC₅₀ valeurs des 40 et 80 nm a AuNP et b PC AuNP. Les données représentent la moyenne  ± S.D. (n = 3). Corona de protéine plasmatique humaine PC, ND non déterminé, polyéthylèneimine ramifiée BPEI, acide lipoïque LA, PEG polyéthylène glycol, LC₅₀ concentration létale médiane

Captation intracellulaire d'AuNP

L'absorption cellulaire dépendante de la taille, de la charge de surface et du PC de tous les AuNP nus et PC a été déterminée à 1,56 μg/cm ² jusqu'à 24 h. L'ANOVA a montré des changements significatifs avec la taille, le PC et le temps (p < 0,0001) et les interactions (PC × taille, PC × temps, taille × temps et PC × taille × temps) (p < 0.001) pour toute l'absorption d'AuNP en plus d'une interaction insignifiante (PC × taille) pour l'absorption de LA- et PEG-AuNP (p = 0.2). Comme le montre la Fig. 3a–f, une augmentation linéaire de l'absorption cellulaire des 40 et 80 nm nus et PC AuNP a été observée en plus des 40 nm nus et PC BPEI-AuNP qui ont atteint l'absorption cellulaire la plus élevée à 6 h et ont diminué par la suite ( 3a). Cependant, à 24 h, le BPEI-AuNP cationique à 40 nm contenait l'absorption la plus élevée, suivi du PEG-AuNP neutre à 40 nm, puis du LA-AuNP anionique à 40 nm, qui était associé à l'ordre de la cytotoxicité des cellules C3A de l'AuNP (Fig. 2a ). Ce résultat est cohérent avec les études précédentes selon lesquelles le poly cationique (N-(2-aminoéthyl) acrylamide) - et le BPEI-AuNP avaient la plus grande absorption cellulaire par rapport à ceux du poly(acide acrylique) anionique - et LA-AuNP et le poly neutre ( N-(2,3-dihydroxypropyl)acrylamide- et PEG-AuNP dans les cellules d'adénocarcinome colorectal humain Caco-2, HPTC et hépatocytes humains [9, 32]. De plus, le complexe NP-PC a atténué tous les BPEI- à 40 et 80 nm. et LA-AuNP et le PEG-AuNP à 40 nm dans les cellules C3A, mais ont accéléré l'absorption de PEG-AuNP à 80 nm (Fig. 3f). Ces résultats sont corroborés par les études récentes selon lesquelles le PC a inhibé l'absorption d'AuNP dans HUVEC, HEK et HPTC, indépendamment de la taille et de la charge de surface [8, 9, 33]. En revanche, les couronnes PC et HSA ont amélioré l'absorption de PEG-AuNP à 40 nm dans les hépatocytes humains, mais cette dernière a induit l'absorption de PEG-AuNP à 80 nm dans HEK [7, 33] .

Absorption cellulaire en fonction du temps du 40 nm a BPEI-AuNP, b LA-AuNP, et c PEG-AuNP, et le 80 nm d BPEI-AuNP, e LA-AuNP, et f PEG-AuNP en l'absence et en présence de PC dans les cellules C3A jusqu'à 24 h. Les données représentent la moyenne  ± S.D. (n = 3). Les lettres étaient significativement différentes selon le test HSD de Tukey. BPEI polyéthylèneimine ramifiée, LA acide lipoïque, PEG polyéthylène glycol, PC couronne de protéines plasmatiques humaines, MSD différence minimale significative. *p < 0,05 ; ** p < 0,005 ; ***p < 0,0001

Mesures du stress oxydatif et nitrosatif

Étant donné que le BPEI et le PEG-AuNP nus à 40 nm présentaient une cytotoxicité et une absorption cellulaire plus élevées dans les cellules C3A par rapport aux autres AuNP, ils ont été sélectionnés pour étudier le stress oxydatif/nitrosatif induit par AuNP. Les deux AuNP ont modulé la génération de ROS/RNS dans les cellules C3A de manière dépendante du temps et de la concentration (p < 0,0001) et par interaction (temps × concentration, p < 0,0001). Comme le montre la figure 4a, la génération de ROS/RNS a diminué aux concentrations les plus élevées de BPEI-AuNP à 40 nm (62,5 μg/cm ² et 125 μg/cm ² ) à 1 h à 37 °C mais a augmenté jusqu'à 24 h. En revanche, le PEG-AuNP à 40 nm a considérablement supprimé la génération de ROS/RNS à 39,1 μg/cm ² avec un changement de pli < 0,5 jusqu'à 24 h (Fig. 4b). L'activation de la mort cellulaire contribue souvent à la toxicité des NP et dans la plupart des cas, une augmentation de la production de ROS/RNS, conduisant à un stress oxydatif, est responsable de la toxicité des NP [34]. La production de ROS/RNS dépendante de la charge de surface a été observée avec le BPEI cationique de 40 nm et le PEG-AuNP neutre. Le BPEI-AuNP à 40 nm a montré un schéma biphasique de génération de ROS/RNS (antioxydant à 1 h et pro-oxydant à 3 h) à des concentrations élevées, ce qui était associé à sa cytotoxicité dans les cellules C3A (Fig. 2a). Ce résultat est cohérent avec les études précédentes selon lesquelles le BPEI-AuNP à 40 et 80 nm et la génération de ROS induite par le citrate-AuNP à 20 nm étaient associés à leurs cytotoxicités dans les hépatocytes humains et les cellules HepG2, respectivement, de manière dépendante du temps et de la concentration. [7, 35]. AuNP a montré une cytotoxicité induite par le stress oxydatif dans les cellules de leucémie promyélocytaire humaine, HL-60 avec une réduction totale du glutathion, quelle que soit la taille [19]. En revanche, le PEG-AuNP à 40 nm a servi d'antioxydant, ce qui suggère que le stress oxydatif/nitrosatif peut ne pas être un mécanisme direct de la cytotoxicité induite par le PEG-AuNP à 40 nm dans les cellules C3A (Fig. 2b).

Production de ROS/RNS dépendante du temps et de la concentration dans les cellules C3A exposées à a le 40 nm BPEI-AuNP et b le PEG-AuNP 40 nm jusqu'à 24 h. Les données représentent la moyenne  ± S.D. (n = 3). Les lettres étaient significativement différentes selon le test HSD de Tukey. BPEI polyéthylèneimine ramifiée, LA acide lipoïque, PEG polyéthylène glycol, CTRL contrôle, MSD une différence significative minimale, PCN pyocyanine (inducteur de ROS). ** p < 0,005 ; ***p < 0,0001

Mesure de l'activité CYP3A4

Les effets inhibiteurs des 40 et 80 nm nus et PC AuNP sur l'activité du CYP3A4 ont été caractérisés. Comme le montre la Fig. 5, le BPEI-, LA- et PEG-AuNP à 40 nm et le BPEI-AuNP à 80 nm à LC₅₀ les valeurs ont inhibé l'activité catalytique du CYP3A4 dans les cellules C3A avec l'activité correspondante de 20,1 à 31,4 % par rapport aux témoins, indépendamment de la taille et de la charge de surface. Les concentrations non toxiques de 80 nm LA- et PEG-AuNP ont également supprimé son activité (31,4 et 26,6 %, respectivement). Cependant, le PC a considérablement amélioré l'inhibition du CYP3A4 induite par l'AuNP à 40 et 80 nm en plus du PEG-AuNP à 40 et 80 nm, montrant une activité de 63 et 46% par rapport aux témoins. Ceci est cohérent avec les études in vitro avec du tissu hépatique humain et des hépatocytes selon lesquelles l'acide tannique anionique-AuNP et le BPEI-AuNP cationique à 40 et 80 nm inhibaient considérablement l'activité catalytique du CYP3A4 [7, 25]. En revanche, la PEI-AuNP cationique et la polyvinylpyrrolidone neutre-AuNP ont induit l'expression d'ARNm de CYP1A2, CYP2C9 et CYP3A4 dans les cellules HepG2 et CYP2B et CYP3A dans une tranche de foie de rat, respectivement [36, 37]. Une étude récente rapporte que le BPEI-AuNP nu à 40 et 80 nm et le PC BPEI-AuNP ont considérablement supprimé l'activité du CYP3A4 dans les hépatocytes humains via un changement de conformation de la protéine ou en bloquant la poche de substrat en tant qu'inhibition réversible [7].

Un effet inhibiteur de l'AuNP sur l'activité du CYP3A4 dans les cellules C3A exposées aux BPEI-, LA- et PEG-AuNP à 40 et 80 nm en l'absence et en présence de PC pendant 24 h. Les valeurs représentent la moyenne  ± S.D. (n = 3). BPEI polyéthylèneimine ramifiée, LA acide lipoïque, PEG polyéthylène glycol, PC couronne de protéines plasmatiques humaines

Profilage d'expression génique focalisé sur la voie de la toxicité du PEG-AuNP à 40 nm

À partir des gènes représentatifs couvrant 13 voies différentes de stress et de toxicité, un total de 212 gènes (↓186 et 26 gènes) ont été exprimés de manière différentielle à CL₅₀ valeur du PEG-AuNP à 40 nm (Fig. 6, Fichier supplémentaire 1 : tableaux S2-S7). Les 12,3% (26 gènes, ↓26, 0 gènes) du total des gènes (212 gènes) étaient principalement impliqués dans la β-oxydation des acides gras mitochondriaux ; pour l'apoptose 11,3 % (24 gènes, 18, 6); pour les dommages à l'ADN et la voie de réparation 11,3 % (24 gènes, 18, 6 gènes) ; et pour la réponse au choc thermique 11,3 % (24 gènes, 22, ↑2).

Gènes représentatifs impliqués dans a -oxydation des acides gras mitochondriaux, b apoptose, c stress oxydatif et réponses antioxydantes, et d transporteurs hépatiques d'absorption et d'efflux à LC₅₀ valeur de 40 nm PEG-AuNP. Toutes les données avaient un changement de pli <− 2 et> 2 à p < 0,05. L'analyse de l'ontologie des gènes est répertoriée dans le fichier supplémentaire 1 :tableaux S2 à S7

Dans la voie de la β-oxydation des acides gras mitochondriaux, des gènes codant pour trois enzymes différentes impliquées dans la production d'acyl-CoA et des équivalents réducteurs de NADH et FADH₂ ont été principalement supprimés ; Gènes ACAD11, ACAD9, ACADM et ACADS dans les déshydrogénases Acyl-CoA (2,0 à 13,6 fois); ACAA1 et ACAA2 dans les cétoacyl-CoA thiolases (7,3 à 14,9 fois) ; DECR1, ECHS1, EHHADH et HADHA (10,7 à 18,9 fois) dans l'énoyl-CoA hydratase (Fig. 6a, Fichier supplémentaire 1 :Tableau S2). La β-oxydation des acides gras mitochondriaux joue un rôle important dans la production d'acyl-CoA et d'équivalents réducteurs de NADH et FADH₂ , qui est associé à quatre enzymes principales (acyl-CoA déshydrogénases, énoyl-CoA hydratases, hydroxyacyl-CoA déshydrogénases et cétoacyl-CoA thiolases [38, 39]. De plus, les transporteurs d'électrons, NADH et FADH₂ , sont impliqués dans le cycle de l'acide tricarboxylique (TCA) et la chaîne respiratoire mitochondriale, entraînant la production d'ATP. Dans la présente étude, le PEG à 40 nm a induit un dysfonctionnement mitochondrial, une perte du maintien de l'ATP via une diminution des niveaux intracellulaires d'ATP et de FADH₂ , définissant par conséquent sa cytotoxicité dans les cellules C3 (Fig. 2a). Le phénomène similaire a été rapporté dans les hépatocytes humains, HUVEC et HPTC, exposés au BPEI-AuNP de 40 nm, indiquant que le dysfonctionnement mitochondrial peut être un mécanisme courant de toxicité AuNP, indépendamment de la charge de surface et des types cellulaires [7,8,9]. Une étude récente a rapporté qu'une cytotoxicité liée au dysfonctionnement mitochondrial a été observée dans des cellules épithéliales immortalisées du cancer de la prostate et des cellules épithéliales du cancer du poumon en réponse à un inhibiteur de la phosphorylation de STAT3, l'OPB-51602 [40].

Dans la voie de l'apoptose, les six gènes pro-apoptotique de CASP3, CASP7, CASP9, TNFRSF10A, TNFRSF10B et TNFSF10 ont été régulés à la hausse, tandis que les six gènes anti-apoptotique de AKT1, ALB, BCL2, BCL2L1, MCL1 et XIAP ont été régulés à la baisse (Fig. 6b, fichier supplémentaire 1 :tableau S3), qui était corrélé à la cytotoxicité dose-dépendante dans les cellules C3A (Fig. 2a). Au point de contrôle des dommages et de la réparation de l'ADN, les gènes des kinases du point de contrôle (CHEK1/2), les gènes de réparation par excision de l'ADN (ERCC1/2/3) et l'ADN ligase IV (LIG4) ont été régulés à la hausse, mais d'autres gènes de réparation par excision (ERCC5/ 6, XRCC1/5), les gènes de la kinase du point de contrôle (CDKN1A) et des protéines kinases (PRKDC) ont été régulés à la baisse (2 à 19 fois). Ces résultats suggèrent que l'interférence induite par le PEG-AuNP à 40 nm avec le cycle cellulaire et le système de réparation de l'ADN peut être corrélée à une induction de la mort cellulaire dans les cellules C3A (Fig. 2a, fichier supplémentaire 1 :tableau S3). Les gènes codant pour deux protéines de choc thermique (HSP) différentes (A1A et A1B) étaient régulés à la hausse (10,2 à 14,2 fois) mais les sous-familles A, B et C de HSP40 ; membre HSP90 1 ; et HSP60 ont été régulés à la baisse (2 à 16 fois) (Fichier supplémentaire 1 :Tableau S4).

Dans le stress oxydatif et la réponse antioxydante, le PEG-AuNP 40 nm à LC₅₀ La valeur a induit les gènes antioxydants et supprimé les pro-oxydants, ce qui était associé à une diminution de la génération de ROS/RNS étant elle-même un antioxydant (Fig. 4b). Dans les gènes antioxydants, la glutathion peroxydase (GPX) 1, GPX2, GPX4, PRDX1, PRDX2, PRDX6, la superoxyde dismutase (SOD) 1 et la CAT ont été induites (3,8 à 18,1 fois). Dans les gènes pro-oxydants, TXNIP et PPP1R15B ont été supprimés (respectivement 4,8 et 17 fois) (Fig. 6c, Fichier supplémentaire 1 :Tableau S5). Ceci est cohérent avec une étude précédente selon laquelle AuNP présentait une cytotoxicité induite par le stress oxydatif dans HepG2 et les hépatocytes humains, quelle que soit leur taille [7, 19].

Dans le métabolisme de phase I, les gènes CYP3A4 et ESD ont été largement supprimés (respectivement 7 fois et 12 fois). En particulier, l'effet inhibiteur du PEG-AuNP à 40 nm sur l'expression du CYP3A4 était corrélé à une diminution de l'activité du CYP3A4 (Fig. 5). Des études récentes ont rapporté que le BPEI-AuNP à 40 nm inhibait l'expression des gènes CYP1A2, CYP2C9 et CYP3A4 dans les hépatocytes humains ; L'EDD aux HUVEC; et CYP1A1 dans HPTC [7,8,9]. Une étude épidémiologique a démontré que les enzymes CYP dans le tissu hépatique d'un patient atteint de CHC étaient considérablement inhibées par le processus tumorigène au niveau moléculaire et fonctionnel [41].

Profilage de l'expression génique de l'absorption de médicaments et du transporteur d'efflux

Le développement de la multirésistance aux médicaments (MDR) par les cellules tumorales est l'une des principales causes d'échec des traitements anticancéreux [42, 43]. La diminution de l'absorption de médicaments par les transporteurs membranaires intégrés et l'augmentation de l'efflux de médicaments, y compris la glycoprotéine P (P-gp) et la protéine de résistance au cancer du sein (BCRP), est l'un des principaux mécanismes de la MDR.

L'expression différentielle des gènes des transporteurs d'efflux et d'absorption de médicaments dans des cellules C3A exposées à du PEG-AuNP à 40 nm a montré qu'un total de 14 gènes de transporteurs ABC (gènes ↓12 et 2) et un total de 21 gènes de transporteurs SLC (↓21 et ↑0 gènes) ont été substantiellement modulés à LC₅₀ valeur (Figs. 6d et 7, Fichier complémentaire 1 :Tableau S7). Dans les transporteurs d'efflux de médicaments de la famille ABC, les gènes de la protéine associée à la multirésistance (MRP3/ABCC3), MRP4 (ABCC4) et de la protéine régulée par l'efflux du cholestérol (CERP/ABCA1) dans la membrane basolatérale ont été régulés à la baisse (7,2 à 10,4 fois). Les gènes codant pour la P-gp (ABCB1), MRP2 (ABCC2), BCRP (ABCG2) et sterolin 2 (ABCG8) dans les transporteurs d'efflux canaliculaires ont également été supprimés (8,6 à 13,8 fois). En revanche, la multirésistance (MDR4/ABCB4) dans la membrane canaliculaire et le transporteur ABC des mitochondries (MTABC3/ABCB6) dans la membrane mitochondriale externe étaient fortement régulées à la hausse (9,8 fois et 5,8 fois, respectivement). Dans les transporteurs d'absorption de médicaments, les gènes de la protéine de transport du cuivre (CTR1/SLC31A1) et, dans une moindre mesure, du transport des anions organiques (OAT7/SLC22A9) ont également été inhibés (18 fois et 15 fois, respectivement). Ces résultats corroborent une étude récente selon laquelle le BPEI-AuNP à 40 nm régule négativement MDR3 dans les hépatocytes humains mais régule positivement MRP3 dans HUVEC, indiquant une interaction dépendante de la charge de surface et du type cellulaire entre AuNP et les transporteurs d'efflux [7, 8]. Une étude épidémiologique a montré qu'une expression élevée de BCRP et une faible expression d'OCT3 se produisaient dans la tumeur HCC, qui était étroitement associée à la progression tumorale et à sa taille [44]. Une étude précédente a montré que l'inhibiteur de la P-gp, le vérapamil, augmentait la cytotoxicité du glutathion-AuNP conjugué à la doxorubicine dans les lignées cellulaires de fibrosarcome félin en augmentant la concentration intracellulaire de médicament [45]. La présente étude souligne que les informations dérivées des mécanismes sur le PEG-AuNP à 40 nm ont identifié une action distincte mais toujours complémentaire sur la β-oxydation des acides gras mitochondriaux, le cycle du TCA et la chaîne respiratoire, l'efflux de médicaments et les transporteurs d'absorption, ainsi que l'activité du CYP3A4 dans Cellules C3A (Fig. 7). À la fin, cela mettra en évidence l'interaction de l'AuNP avec les processus biologiques clés et son mécanisme moléculaire sous-jacent dans le CHC, qui pourraient être davantage impliqués dans le développement d'une cible thérapeutique plus efficace dans le traitement du CHC.

Une représentation schématique des mécanismes d'action de base du PEG-AuNP 40 nm dans le traitement du CHC. Les barres vertes (une inhibition) et les triangles roses (une induction) indiquent les marqueurs et voies biologiques modifiés par PEG-AuNP à 40 nm. L'analyse de l'ontologie des gènes est répertoriée dans le fichier supplémentaire 1 :tableaux S2 à S7

Pour valider l'analyse de l'expression génique à partir de la RT ² array, les neuf gènes ont été sélectionnés pour une PCR en temps réel. Dans le fichier supplémentaire 1 :tableau S1, les neuf gènes ont été modulés à LC₅₀ du PEG-AuNP 40 nm. Ces changements transcriptionnels étaient cohérents avec ceux de l'analyse de l'expression génique avec des puces PCR (Fig. 6, fichier supplémentaire 1 :tableaux S2 à S7).

Conclusions

Nous avons présenté que l'interaction cationique BPEI-, anionique LA- ou PEG-AuNP neutre avec la couronne de protéine plasmatique humaine (PC) a provoqué les changements de D _H , PDI et potentiel z de l'AuNP et ont influencé davantage les réponses cellulaires dans les cellules C3A. Tous les AuNP 40 et 80 nm nus (sans PC) étaient cytotoxiques pour les cellules C3A en plus du LA-AuNP 80 nm, mais le PC a complètement amélioré leurs cytotoxicités en plus du BPEI-AuNP 80 nm. Le BPEI-AuNP nu à 40 nm a montré l'absorption cellulaire la plus élevée, suivi du PEG-AuNP à 40 nm, puis du LA-AuNP à 40 nm, tandis que le PC a supprimé l'absorption d'AuNP en plus du PEG-AuNP à 80 nm. Le 40 nm BPEI-AuNP a provoqué des réponses biphasiques de stress oxydatif (pro- et antioxydant) dans les cellules C3A, tandis que le 40 nm PEG-AuNP était antioxydant. L'activité du CYP3A4 a été largement supprimée par tous les AuNP nus, indépendamment de la taille et des charges de surface, tandis que le PC a considérablement amélioré son effet inhibiteur sur l'activité enzymatique en plus du PEG-AuNP à 40 et 80 nm. Gènes différentiellement exprimés à CL₅₀ La valeur de 40 nm de PEG-AuNP était principalement impliquée dans la -oxydation des acides gras mitochondriaux et, dans une moindre mesure, les transporteurs d'efflux/captation hépatique. Le PEG-AuNP à 40 nm a inhibé trois enzymes principales de la β-oxydation (acyl-CoA déshydrogénase, énoyl-CoA hydratase et cétoacyl-CoA thiolase), d'autres enzymes du cycle du TCA et la chaîne respiratoire mitochondriale pour la production d'ATP. Le PEG-AuNP à 40 nm a augmenté l'expression des gènes pro-apoptotiques et diminué les gènes anti-apoptotiques à LC₅₀ valeur. Un niveau élevé d'antioxydants et un faible niveau de gènes pro-oxydants ont été observés dans les cellules C3A exposées à 40 nm de PEG-AuNP. De plus, les gènes des transporteurs d'efflux et d'absorption de médicaments situés à la fois dans la membrane basolatérale et canaliculaire ont été considérablement modulés.

Abréviations

ANOVA :

Analyse unidirectionnelle de la variance

AuNP :

Nanoparticules d'or nues :pas de PC

BPEI :

Polyéthylèneimine ramifiée

CAP :

Cytochrome P450

D _H :

Diamètres hydrodynamiques

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

EDTA :

Acide éthylènediaminetétraacétique

EMEM :

Milieu essentiel minimum d'Eagle

HCC :

Carcinome hépatocellulaire humain

HPTC :

Cellules tubulaires proximales rénales humaines

HSD :

Test de différence significative honnête de Tukey

HUVEC :

Cellules de veine ombilicale humaine

ICP-MS :

Spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif

LA :

Acide lipoïque anionique

LC₅₀ :

Concentration létale médiane

MDR :

Multirésistance

NP :

Nanoparticules

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

PC :

Corona de protéines plasmatiques humaines

PDI :

Indice de polydispersité

PEG :

Polyéthylène glycol neutre

ARNi :

Interférence ARN

RNS :

Espèces azotées réactives

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

SO :

Superoxyde

TEM :

Microscopie électronique à transmission

TFF :

Filtration à flux tangentiel