Influence des nanotubes de carbone et de leurs dérivés sur les cellules tumorales in vitro et paramètres biochimiques, composition cellulaire du sang in vivo

Contexte

L'une des applications les plus frappantes et les plus prometteuses des nanotubes de carbone est la médecine. Les nanotubes de carbone (CNT) sont caractérisés par des propriétés chimiques et biologiques uniques [1,2,3,4,5]. Les NTC ont une grande surface qui leur permet de fixer un large éventail de substances biologiques [6]. De plus, les NTC sont capables de pénétrer à travers les membranes cellulaires, les capillaires et s'accumulent dans les cellules et les tissus [7,8,9]. Les NTC sont facilement absorbés par les cellules et cela favorise la capacité des NTC à atteindre les noyaux cellulaires et implique la possibilité d'une thérapie génique [10]. C'est pourquoi les NTC sont des véhicules attractifs pour le transport de protéines, d'antigènes, de vecteurs ARN/ADN [11], de vaccins et de médicaments dans les cellules [12]. Un intérêt particulier porte sur les perspectives d'utilisation des NTC comme vecteur personnalisé avec libération contrôlée de médicaments pour la thérapie anticancéreuse [13], antibactérienne [14] et immunologique [15]. L'administration ciblée et la libération contrôlée sont le véritable problème de l'utilisation moderne des médicaments, en particulier avec des propriétés cytotoxiques. Le mécanisme exact de libération du médicament garantit une concentration efficace de la substance active dans le tissu cible avec une concentration minimale dans les autres. Cela réduirait la dose du médicament tout en maintenant son efficacité et en diminuant les dommages causés par les effets secondaires. Actuellement, il existe différentes manières d'administrer des médicaments à dessein, telles que l'administration à l'aide de liposomes [16], de micelles et de dendrimères polymères [17], de particules biodégradables [18] et d'autres nanoparticules [19]. Mais des expériences récentes ont démontré de nombreux avantages de l'utilisation des NTC dans l'administration de médicaments par rapport à d'autres nanoparticules [20, 21]. L'un d'eux est les NTC avec une surface assez grande et active qui peut être remplie de la substance chimique souhaitée, allant des petites molécules aux protéines, aux anticorps et à l'ARN/ADN. Les extrémités ouvertes des NTC rendent le volume intérieur et la surface accessibles pour la fonctionnalisation. Ainsi, la grande surface des CNT fournit de nombreux sites de liaison pour différents types de fonctionnalisation. Parallèlement aux perspectives des CNT, il existe certains problèmes de faible solubilité des CNT, de capacité d'agrégation, de qualités hydrophiles, de longue demi-vie et d'influence sur l'organisme entier [22]. Selon la littérature, l'introduction de NTC dans le corps des animaux de laboratoire s'accompagne d'une accumulation de NTC et de ses dérivés dans les organes du tube digestif, la rate, les reins [23], les muscles [24] et les tissus pulmonaires [25] . À l'étape suivante, les NTC influencent l'activité des processus métaboliques et inflammatoires [25, 26], l'état du système immunitaire [27] et la survie des animaux de laboratoire [28]. Néanmoins, ces problèmes font l'objet de recherches actives pour faire avancer l'utilisation des nanotubes de carbone. Les avantages des NTC en tant que nano-vecteurs pour l'administration de médicaments ont été démontrés de manière convaincante dans un certain nombre d'études. Les auteurs de [29, 30] ont rapporté que des nanotubes spécifiques peuvent être moins nocifs que les nano-supports pour les médicaments. Il a également été montré qu'une simple fonctionnalisation (-OH, -COOH, -NH, PEG) [31] ou encapsulation des NTC [22] augmente la solubilité dans l'eau, améliore la biodisponibilité et réduit la toxicité des NTC. Et l'introduction de NTC à des souris avec une tumeur transplantée peut être efficace contre les tissus transformés ciblés et conduire à une diminution du volume tumoral et à une augmentation de la survie des animaux [32].

A la base d'investigations précédentes [33], nous avons supposé que la substance antitumorale active (doxorubicine) pouvait être immobilisée à la surface des liaisons peptidiques des nanotubes de carbone. Le composé résultant, les nanotubes de carbone qui ont été fonctionnalisés par la doxorubicine (CNT-Dox), pourraient réduire les propriétés cytotoxiques des CNT comme la doxorubicine (Dox). Dans le même temps, la désintégration de la construction traitée peut permettre de réaliser les propriétés cytotoxiques CNT et Dox. Ainsi, il est possible d'obtenir une augmentation de l'activité antitumorale des deux substances. Par conséquent, le but de la présente étude était de déterminer l'effet cytotoxique de la construction CNTs-Dox en présence de protéase (trypsine) in vitro. Nous avons analysé l'impact des NTC et de ses dérivés sur les cellules tumorales en modèle cellulaire 2D et 3D, in vitro. L'autre objectif était d'étudier l'influence des composés obtenus (CNT, CNTox et CNT-Dox) sur l'activité du système enzymatique hépatique, le renouvellement des protéines et sur la composition sanguine cellulaire in vivo. Ainsi, les auteurs ont réalisé une estimation complexe de la toxicité, de la biodisponibilité et de l'efficacité de l'utilisation des NTC et de leurs dérivés contre les tumeurs du tractus gastro-intestinal.

Méthodes

La lignée cellulaire du carcinome de grade II d'adénocarcinome du côlon caucasien (HT29) a été utilisée comme modèle cellulaire expérimental dans un système 2D (monocouche) et 3D (sphéroïde) in vitro. La lignée a été achetée auprès de la Banque de lignées cellulaires et de tissus d'animaux de l'Institut de pathologie expérimentale, d'oncologie et de radiobiologie de Kavetsky NAS Ukraine. Les cellules ont été manipulées dans des conditions de culture cellulaire standard (95% d'humidité, 5% de CO₂ dans les airs; 37 °C) dans un milieu DMEM complet avec 10 % de FBS sous le niveau de confinement de laboratoire 2.

Synthèse, Oxydation et Fonctionnalisation des NTC

Les premiers nanotubes de carbone à parois multiples (MWCNT) ont été obtenus par dépôt chimique en phase vapeur (propylène et hydrogène avec Mo/Fe/Al₂ O₃ comme catalyseur). Les MWCNT synthétisés avaient 10-30 couches, diamètre interne 5-15 nm, diamètre externe 10-60 nm, longueur 20-500 μm, surface spécifique 120 m ² /g et densité apparente de 5 à 50 g/l [33].

La purification des MWCNT du métal/catalyseur a été réalisée par traitement HF. L'élimination du carbone amorphe des nanomatériaux de carbone a été réalisée par oxydation dans l'air à 450-500 °C. L'échantillon brut contenant des MWCNT a réagi avec l'oxygène de l'air et a créé du dioxyde de carbone ou du monoxyde de carbone. Une certaine quantité de dépôt de carbone a été obtenue après que la dissolution HF (aqua) du support de catalyseur a été oxydée dans l'air à 450-500 °C. Un réacteur tubulaire en quartz à flux d'air a été utilisé pour cette procédure pendant 130 à 150 min. Nous avons analysé et décrit les caractéristiques physiques et chimiques des MWCNT obtenus dans des travaux antérieurs [33].

La spectroscopie électronique à balayage (MEB) des MWCNT (JEOL SL6060LA, Japon) a été utilisée pour déterminer les caractéristiques structurelles des MWCNT. Après immobilisation des ligands, la morphologie n'a pas été modifiée.

Oxydation des MWCNT

A l'étape suivante, les nanotubes de carbone purifiés (CNT) ont été oxydés dans 70% HNO₃ à 99 °C pendant 4 h puis lavé avec de l'eau distillée et 10% NH₄ Solution d'OH pendant 12 h. En conséquence, des oxydes de nanomatériaux de carbone MWCNTox (CNTox) ont été synthétisés. Après cela, les NTC ont été lavés trois fois avec dH₂ O à pH neutre. Les sites acides à la surface des NTC ont été régénérés avec une solution de HCl 0,1 M. Les NTC-ox oxydés résultants ont été séparés par centrifugation, rincés abondamment et remis en suspension dans dH₂ O eau.

Préparation des particules CNT-Dox

La tâche de l'étape suivante consistait à immobiliser le chlorhydrate de Dox (Dox, Teva Nederland B.V, Pays-Bas) à la surface des particules de MWCNT. Pour fonctionnaliser les surfaces des NTC oxydés (200 mg) par du monohydrate de dox-lactose contenant des acides aminés, ils ont été incubés avec un agent de liaison bifonctionnel-N-cyclohexyl-N′-(2 morpholinoéthyl) carbodiimide metho-p-toluènesulfonate (C 1011, Sigma Aldrich , USA) pendant 15 min à température ambiante (Fig. 1a). Après cela, 100 mg de DOX-lactose monohydraté ont été ajoutés dans 10 ml de tampon phosphate 0,15 M pH 6,5 à chaque matériau nanocarboné. Le mélange a été laissé réagir à 30 °C pendant 24 h. Dans de telles conditions, des liaisons covalentes entre Dox et CNT se sont formées (Fig. 1b). La composition a été recueillie par centrifugation à 10 000 tr/min 15 min et lavée avec dH₂ trois fois. Les surnageants ont été utilisés pour la concentration de détection de DOX libre par spectrophotomètre. L'immobilisation du FITS sur la surface du CNT a été fournie par le schéma illustré sur la Fig. 2a, b.

un Schéma de réaction des NTC avec le carbodiimide. b Schéma de fonctionnalisation des NTC par la doxorubicine

un Schéma de réaction des NTC avec l'urée. b Schéma de la fonctionnalisation des CNT par le FITC

Préparation de suspensions stables de MWCNT

La suspension colloïdale de MWCNTs a été réalisée en deux étapes. Dans la première étape, les nanomatériaux de carbone ont été soumis à un traitement par ultrasons dans un tampon phosphate salin (PBS) à l'aide d'un disperseur à ultrasons UZDN-2 T. Les modes de traitement étaient I = 10 mA, R = 22 kHz, durée—30 min. Dans la deuxième étape, l'hydrolat résultant a été dispersé par centrifugation à température ambiante. Le procédé comprend plusieurs cycles de centrifugation. Ainsi, la fraction de dissolution hydrophile des SWCNT a été sélectionnée de cette façon. Avant d'être ajoutées aux cellules cultivées en suspension, les solutions de MWCNT ont été stérilisées par ébullition pendant 30 min. Les dérivés des CNT (CNT-Dox et CNT-FITC) ont été stérilisés par une concentration 100 fois supérieure de PSGA (Pénicilline :Streptomycine :Gentamycine :Amphotéricine).

Potentiel zêta des suspensions de nanotubes

Le potentiel zêta des échantillons a été mesuré par diffusion électrophorétique de la lumière (M3-PALS). Pour les mesures, l'analyseur Zetasizer Nano ZS, fabriqué par Malvern Instruments (Malvern, Royaume-Uni), a été utilisé. Les expériences ont été réalisées à 25°C avec sept répétitions. Pour mesurer les échantillons, une électrode submersible universelle (Universal Dip Cell) ZEN1002 et des cuvettes en polystyrène (DTS001), une source lumineuse, un laser H-Ne 633 nm, ont été utilisées.

Spectroscopie FTIR

La composition chimique des nanomatériaux obtenus a été étudiée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR). Les spectres IR ont été déterminés par le spectromètre FTS 7000e Varian FTIR. Les échantillons à analyser ont été préparés en broyant dans un broyeur un mélange d'environ 1 mg de NTC et 150 mg de KBr spectralement pur. Les échantillons ont été préparés à l'aide d'une presse avec une force de pression de 3,0–3,5 × 10 ³ kg/cm ² . Les échantillons ont été déshydratés par chauffage à une température de 600 °C pendant 60 min. Des spectres pré-tirés de KBr ont été obtenus au préalable, après quoi ils ont été soustraits des spectres des échantillons. Tous les spectres ont été analysés selon le catalogue d'identification spectrométrique des composés organiques [34]. À titre de comparaison, des échantillons de MWCNT oxydés (CNT-O), de MWCNT fonctionnalisés par la doxorubicine (CNT-D) et de MWCNT fonctionnalisés par un marqueur fluorescent (CNT-F) ont été utilisés. Tous les traitements et conditions, d'échantillons et de concentration, étaient les mêmes pour trois matériaux.

Dosage colorimétrique de la libération de doxorubicine à partir de la surface des NTC

Pour évaluer la quantité de Dox libre après immobilisation sur les CNM et l'efficacité de la libération de Dox, la capacité de Dox libre à fluorescent à une longueur d'onde de 495 nm a été utilisée [35]. La concentration active de Dox dans le chlorhydrate de Dox était de 16,7 % w /w . Pour tracer les lignes d'étalonnage, Dox Teva 20 mg/ml avec dix dilutions à 8 × 10 ⁻³ mg/ml a été utilisé. Ensuite, la fluorescence de la Dox libre a été mesurée dans le surnageant des complexes DOX avec les NTC par lecteur de plaques spectrophotométrique Multiscan (Labsystem, Finlande).

Concentration des groupes fonctionnels dans les particules CNT-DOX, CNT-FITC

Pour les immobilisations Dox, 1 g de MWCNT dans 1 ml de dH₂ O a été utilisé. La quantité de Dox-TEVA était de 100 mg de (16,7 mg de Dox actif) dans 1 ml de dH₂ O. La quantité de Dox libre dans le surnageant après réaction était de 0,37 mg ou 2,2 % de substances actives. Ainsi, nous avons conclu que 16,23 mg de DOX étaient immobilisés sur 1 g de CNTox. Pour le FITC, le pourcentage d'immobilisation était faible. Ensuite, 8,35 mg de FITC ont été immobilisés sur 1 g de CNTox dans 1 ml de dH₂ O. L'efficacité de la fonctionnalisation était de 1,62% w /w pour CNT-DOX et 0,84% w /w pour CNT-FITC. Un calcul supplémentaire des concentrations de CNT-Dox et de CNT-FITC est basé sur ces données.

Dosage cytotoxique de dérivés de NTC sur modèle cellulaire 2D et 3D

La cytotoxicité du Dox, des CNT, du CNT-FITC et du CNT-Dox a été évaluée par rapport aux cellules tumorales HT29 à l'aide du test MTT. Test MTT basé sur la conversion des sels de 3-[4,5-dimetltiazol-2]-2,5-dipheniltetratétrazolium en cristaux de formazan par les enzymes oxydoréductases mitochondriales NAD(P)H-dépendantes dans des cellules vivantes. Le protocole a été décrit par T. Mosmann [36]. En bref, 1 × 10 ⁴ Les HT29 ont été ensemencés dans des plaques à 96 puits et cultivés dans un milieu de culture complet pendant 12 h. Ensuite, le milieu de culture actuel a été remplacé par un milieu de culture contenant CNTox (échantillon #1), MWCNTs (échantillon #2), CNT-Dox (échantillon #3), Dox (échantillon #4) et CNT-FITC (échantillon #5) . Les concentrations des échantillons n° 1, 2, 3, 5 étaient de 12,5–25–50–100–200 μg/ml, la concentration du stock de l'échantillon n° 4 était de 20 μg/ml, la concentration finale de 1 à 10 μg/ml. Les cellules ont été cultivées en milieu complet et ont été utilisées comme contrôle. Après 24 h d'incubation, les cellules ont été analysées au MTT par dosage colorimétrique. A 100 μl de suspension cellulaire, nous avons ajouté 20 μl de solution de MTT (5 mg/ml PBS, Sigma). Après cela, les cellules ont été incubées avec du MTT pendant 4 h dans des conditions standard. Ensuite, les échantillons ont été centrifugés sous 1500 g, pendant 5 min, et le surnageant a été extrait. Au total, les puits ont été ajoutés 10 μl de DMSO (Sigma) pour la dilution des cristaux de MTT et 20 μl de glycine 25 mM. L'absorbance de la solution ayant réagi a été mesurée à 540 nm sur un lecteur de plaques spectrophotométrique Multiscan (Labsystem, Finlande).

Génération de sphéroïdes tumoraux multicellulaires

Le sphéroïde tumoral multicellulaire (MTS) des cellules HT29 (culture 3D) en tant que système modèle de micrométastase tumorale a été cultivé par une méthode bien établie qui a été décrite précédemment [33]. Brièvement, les suspensions cellulaires ont été comptées à l'aide de bleu Trypan et plantées un nombre égal de cellules (5 × 10 ⁴ cellules/ml). La culture cellulaire 3D a été maintenue en milieu DMEM (Sigma, USA) avec 10 % de FBS (Sigma, USA) dans des conditions standards (95 % d'humidité, 5 % de CO₂ dans l'air, 37 °C). La génération de MTS a été réalisée par une technologie qui a été développée dans notre laboratoire. La culture des cellules tumorales a été maintenue pendant 24 h dans des plaques à 24 puits recouvertes d'agar à 1 % dans un milieu de culture avec 0,24 % de carboxyméthylcellulose. Pour étudier la dépendance de la taille et du nombre de MTS sur la concentration et le type de CNT, MTS a été généré en présence de diverses concentrations de CNT. Avant la génération de MTS aux cultures cellulaires, une solution de NTC dans du PBS a été ajoutée à la culture jusqu'à la concentration finale comme décrit précédemment pour le dosage MTT. Une autre culture a été menée pendant 48 h à une rotation constante des plaques sur un agitateur orbital (80 tr/min). À l'étape suivante, des micro-images ont été prises par la méthode « champ noir ». Au total, plus de 120 images ont été réalisées. Ensuite, le volume de tous les MTS, qui se trouvaient sur les fichiers, a été calculé avec le programme d'utilisation Axio Vision Rel 4.7, Zeiss. Nous avons utilisé la formule de Rolf Bjerkvig :V = 0.4 ∙ a b ² , où les tailles géométriques des sphéroïdes (b < un ) [37]. La visualisation des résultats a été réalisée sur un microscope Stemy 2000C, Zeiss.

Analyse de l'impact des NTC sur le système enzymatique hépatique, le renouvellement des protéines et sur la composition cellulaire du sang in vivo

Les procédures concernant les animaux et leurs soins ont été conformes à la directive européenne 2010/63 UE, approuvée par les comités locaux d'éthique de l'expérimentation animale (Protocole №1 21.10.2016). Afin d'analyser l'influence des substances obtenues sur l'état général de l'homéostasie de l'organisme, une série d'expériences in vivo a été menée. Des études in vivo sur des souris de la lignée Balb/2a ont été utilisées. Les souris mâles et femelles étaient égales dans les groupes, âgées de 6 à 8 semaines, dix pour chaque groupe. Les souris ont été logées dans des cages avec des toits en fil d'acier et des litières en épi de maïs et maintenues dans une atmosphère contrôlée avec un cycle sombre/lumière de 12/12, une température de 22 °C ± 3 °C et une humidité de 50 à 70 %, avec un accès libre à la nourriture et à l'eau douce. Ainsi, quatre groupes de souris ont été formés. Groupe 1 :les animaux intacts ont été traités avec 200 μl de PBS, contrôle. Groupe 2 :les souris ont été traitées avec du CNTox à une dose de 1,5 mg/kg. Groupe 3 :les souris ont été traitées avec du CNT-DOX à une dose de 1,5 mg/kg. Et dans le groupe 4, les souris ont été traitées à la doxorubicine à la dose de 20 mg/kg. Les souris ont reçu du CNT par voie parentérale dans 200 μl de PBS, tous les 3 jours, pendant 4 semaines. La doxorubicine a été administrée par voie intrapéritonéale, une fois tous les 3 jours, à une concentration de 20 mg/kg de poids corporel.

Analyse biochimique du sérum

Un mois plus tard, les souris ont été retirées de l'expérience. Des échantillons de sang cardiaque ont été immédiatement prélevés sur des animaux morts. Le sang a été prélevé sur les animaux en même temps de 10 à 11 h 00. Pour le plasma, le sang a été incubé pendant 40 min à 37 °C puis centrifugé (20 min, 2000 rpm). Ensuite, les paramètres biochimiques, protéines totales, albumine, aspartate aminotransférase (AST) et alanine aminotransférase (ALT), phosphatase alcaline (ALP), ont été déterminés dans le plasma avec des kits de diagnostic (Cormay, Varsovie, Pologne). Les expériences ont été réalisées par des protocoles de laboratoire unifiés sur l'analyseur biochimique semi-automatique FP-901M (Labsystems, Finlande). La composition du sang cellulaire a été déterminée sur un analyseur hématologique Mindray BC-3000 Plus, Chine.

Analyse statistique

Pour l'analyse statistique de la culture 3D, tous les agrégats cellulaires ont été triés en groupes selon la taille de 1 × 10 ⁻⁴ mm ³ à 1 × 10 ⁻² mm ³ avec pas de 1 × 10 ⁻³ mm ³ . Ensuite, le nombre de MTS dans chaque groupe et la médiane du volume MTS pour chaque groupe ont été estimés. Toutes les mesures ont été répétées trois fois. Pour le dosage micro-statistique des variables aléatoires normalement distribuées, nous avons utilisé le coefficient de Student pour petite population. Le p indiqué la valeur était *р ≤ 0,05 ou **р ≤ 0,01.

Résultats et discussion

Microscopie électronique à balayage des MWCNT

Selon le protocole [38], le diamètre moyen des NTC était de 10 à 20 nm et la surface spécifique déterminée par désorption d'argon était de 200 à 400 m ² /g. Densité apparente comprise entre 20 et 40 g/dm ³ . En particulier, les agglomérats sous forme de tubes enchevêtrés de dimensions 20-500 μm sont obtenus lors d'une production industrielle de NTC par la méthode CVD (Fig. 3).

Images SEM de NTC, 1) échelle 0,5 m ; 2) échelle 5 m

Potentiel zêta des suspensions de nanotubes

CNTox et CNT indiquent une stabilité significative à l'agrégation, qui dépend directement de la valeur du potentiel zêta. Le CNT-DOX a un potentiel zêta plus petit que le CNTox et le CNT, et une reproductibilité élevée de la mesure, ce qui indique l'homogénéité des particules (tableau 1). Une petite valeur du potentiel zêta du CNT-FITC peut indiquer des tailles de particules importantes ou leurs faibles concentrations, comme indiqué par le rapport de bruit élevé lors de la mesure.

Spectroscopie FTIR des CNT, CNT-Dox et CNT-FITC

Les liaisons entre le CNTox et la doxorubicine (DOX) et la fluorescéine (FITC) ont été estimées sur la base de données spectrales infrarouges, comme le montre la figure 4.

Spectres infrarouges de CNTox (CNT-O), CNT-DOX (CNT-D), CNT-FITC (CNT-F)

La présence d'une bande forte à υ = 3311 cm ⁻¹ (CNT-O) et υ = 3451 cm ⁻¹ (CNT-D) attribuée aux fluctuations de couplage CON-H, ainsi qu'à la présence d'une bande forte à υ = 1634 cm ⁻¹ (CNT-O) et υ = 1631 cm ⁻¹ (CNT-D) attribué aux vibrations de liaison O-CNH, ce qui indique clairement le type de liaison amide entre CNT et Dox. En outre, l'IR a montré l'absorption des liaisons C-H qui est située à 2969-2834 cm ⁻¹ et une large bande à 1460-1407 cm ⁻¹ du fragment C-O-H. Ainsi, nous pouvons conclure qu'à la suite de réactions chimiques, les NTC ont été fonctionnalisés avec un médicament antitumoral (doxorubicine) et un marqueur fluorescent (FITC).

Cytotoxicité des NTC à différentes étapes de fonctionnalisation sur des modèles de croissance cellulaire monocouche et sphéroïdes

L'étape suivante consistait à déterminer la cytotoxicité des NTC oxydés (CNTox), des NTC fonctionnalisés à la doxorubicine (CNT-Dox) et du marqueur fluorescent (CNT-FITC). Les résultats du test MTT sur la culture monocouche de HT29 sont présentés sur la figure 5.

Viabilité des cellules tumorales HT29 en culture monocouche après incubation pendant 48h avec les NTC et ses dérivés (CNT-Dox et CNT-FITC). Signification statistique :*р ≤ 0,05 ou **р ≤ 0,01

En conséquence, il a été démontré que les CNTox, CNT-Dox et CNT-FITC ont un effet cytotoxique modéré à des concentrations de 12,5 μg/ml (81 %). L'augmentation de la concentration de CNTox de 25 à 50 et 100 μg/ml a conduit à une diminution dose-dépendante de la viabilité des cellules tumorales à 71,8–69,6–62,5% par rapport au témoin. À une concentration de CNTox allant jusqu'à 200 μg/ml, la viabilité de HT29 a diminué à 39,2 %. À ce moment-là, le CNT-Dox à de faibles concentrations (12,5 à 50 μg/ml) n'a pas montré de cytotoxicité statistiquement significative, par rapport au CNTox. À des concentrations élevées (200 μg/ml), le CTN-Dox avait encore moins de cytotoxicité que le CNTox (50 %). Dans le même temps, les NTC, fonctionnalisés avec de la fluorescéine, ont eu un effet cytotoxique relativement plus élevé sur les cellules tumorales. Après incubation avec le CNT-FITC à une concentration de 25 μg/ml, la survie des cellules HT29 a été réduite à 55 % et à 100-200 μg/ml à 23 et 7 % respectivement. Ainsi, dans ce cas, les NTC ont joué le rôle de substrat cellulaire plutôt inerte. Plus que cela, les NTC ont immobilisé Dox et réduit la cytotoxicité de Dox. Dans des études précédentes [33], nous avons démontré que les nanotubes primaires ont des qualités hydrophobes, un effet cytotoxique modéré et stimulent la formation d'un grand nombre d'agrégats cellulaires. Selon la littérature [39], la charge de surface des NTC change au cours de l'oxydation. Les NTC deviennent plus hydrophiles, ce qui conduit à la formation d'agrégats plus petits et augmente l'effet cytotoxique des NTC. Les données que nous recevons dans l'étude précédente confirment cette tendance. Le CNTox a réduit la survie des cellules tumorales d'au moins 60 % par rapport au témoin, le CNT-Dox à 45 % et le CNT-FITC à 97 % (à 200 μg/ml). L'explication des données obtenues peut être dans les rapports des autres auteurs selon lesquels les ligands fonctionnels, dans la plupart des cas, modifient le potentiel zêta de surface des NTC, stimulent la solubilité des NTC et augmentent la pénétration cellulaire des NTC [40]. La capacité des NTC à former des agrégats après oxydation et fonctionnalisation diminue, tandis que la perméabilité à travers la membrane cellulaire augmente et la réactivité des organites cellulaires augmente. De plus, le CNT-Dox, à des concentrations élevées, a un effet cytotoxique inférieur à celui du CNTox. Dans le même temps, selon les données obtenues, on peut supposer que la liaison peptidique maintient la doxorubicine à la surface du CNT. La liaison peptidique entre les NTC et le Dox est suffisamment stable dans des conditions de culture cellulaire. Il ne se décompose pas et prend la doxorubicine sous forme inactive. Dans le même temps, la molécule fluorescéine-sodium (C₂₀ H₁₂ O₅ ), un ligand de la taille de 332.311 g/mol, se dissocie assez facilement de la surface des NTC et pénètre dans les cellules. Dans les résultats, il y a des violations irréversibles des structures de l'ADN, des noyaux et des mitochondries [41].

Pour vérifier la cytotoxicité des NTC et de ses dérivés et l'impact sur les propriétés adhésives des cellules tumorales, la surface des colonies de cellules HT29 2D a été analysée. Les résultats sont présentés sur la figure 6. Il a été démontré que les NTC et leurs dérivés ont une influence sur la capacité d'adhérence des cellules tumorales et la formation de colonies de cellules tumorales en culture monocouche. L'incubation des cellules tumorales avec CNTox (échantillon n° 1) à des concentrations de 12,5, 50,0 et 200 μg/ml a entraîné une diminution dose-dépendante des colonies de cellules 2D à 55,2 %, 57,8 % et 78,3 % par rapport au témoin. Dans le même temps, l'échantillon de CNT-Dox (échantillon n° 3) aux mêmes concentrations n'a pas provoqué un tel effet. La superficie des colonies 2D a été réduite de 34,8%, 61,6% et 82,4% respectivement. Le CNT-FITC (échantillon #5) a démontré la plus grande influence sur les cellules tumorales en culture monocouche. La surface des colonies 2D après incubation avec CNT-FITC a diminué à 59,8 %, 85,2 % et 89,8 %, respectivement. Il convient de noter que les résultats obtenus ont la même tendance que le test MTT. Mais les résultats de l'analyse MTT n'ont pas montré un effet cytotoxique aussi significatif. Les écarts qui en résultent peuvent être le résultat d'effets non cytotoxiques des NTC sur la colonie cellulaire et, en partie, d'une influence anti-adhésive. Auparavant, nous avons démontré que les NTC ont moins de capacité cytotoxique que d'anti-adhérence. Selon nos données, les NTC stimulent la migration des cellules tumorales dans la fraction de suspension et la formation de sphéroïdes tumoraux multicellulaires (MTS). La sensibilité des cellules aux agents antitumoraux dans les cultures monocouche et sphéroïde est différente. C'est pourquoi à l'étape suivante, nous avons étudié la formation de MTS par les cellules tumorales HT29 en présence de CNTox, CNT-Dox et CNT-FITC. Les concentrations de NTC étaient les mêmes que dans les expériences précédentes. Sur la figure 7, il a été démontré que les CNTox (échantillon n° 1) sont capables de stimuler la formation de MTS. L'augmentation de la concentration de CNTox s'accompagne d'une augmentation dose-dépendante du volume médian de MTS. À la concentration CNTox de 12,5, 50, 200 μg/ml, le volume médian de MTS augmente de 1,79 à 2,18 et 10,98 mm ³ ; c'est presque dix fois. Les dérivés des NTC ne provoquent pas un tel effet sur les cellules tumorales. Le CNT-Dox (échantillon n° 3) stimule la formation de MTS en 2,83 fois. Dans le même temps, l'incubation de la culture de cellules tumorales 3D avec le CNT-FITC (échantillon n° 5) conduit à une diminution de 2,4 fois du volume de MTS.

La superficie des colonies de cellules tumorales HT29 en culture monocouche qui a été incubée avec CNTox (# 1), CNT-Dox (# 3), CNT-FITC (# 5). Signification statistique :*р ≤ 0,05 ou **р ≤ 0,01

La médiane du volume des sphéroïdes tumoraux multicellulaires. Les MTS ont été générés en présence de CNTox (échantillon #1), CNT-Dox (échantillon #3), CNT-FITC (échantillon #5). Signification statistique :*р ≤ 0,05 ou **р ≤ 0,01

Il est à noter que dans la plupart des expériences, le CNT-Dox n'a pas de tels effets cytotoxiques sur les cellules tumorales, à la fois en culture 2D et 3D, qui pourraient être comparés à l'effet d'une seule doxorubicine. The mechanism of cytotoxic action of doxorubicin is based on penetration into the cell nucleus and intercalation between nucleotide pairs, violation of replication and DNA repair, protein synthesis and, as a result, cell death. The cause of the reduction of cytotoxic effect of the CNT-Dox may be the binding of the doxorubicin with CNT surface through peptide bonds. It prevents Dox dissociation from CNT surface and Dox penetration into the cell and cellular organelles. This fact may let to deliver the compound to certain tissues without causing a negative effect on “non-target” objects.

In this case, the next step of the study was controlled release of doxorubicin. For peptide bonds breaking, we used the commonly known peptidase trypsin as the release agent. The effect of trypsin on the Dox release from the surface of the CNT was investigated by spectral analysis. Since the free doxorubicin has a fluorescence peak at 495 nm, bounded doxorubicin has no such ability. It was analyzed how the increasing of trypsin concentration affected on concentration of free doxorubicin. The results are shown in our previous work [42]. Shortly, it was demonstrated that increasing the concentration of 0.05% trypsin from 11 to 20% in culture medium contributed to an increasing the concentration of free doxorubicin from 3.13 to 6.55 μg/ml. A further increasing the concentration of trypsin to 60% did not lead to increasing in free doxorubicin. However, the concentration of trypsin by about 66% stimulated release again and led to increasing the concentration of doxorubicin in two times, to 11.38 μg/ml. Thus, it was concluded that 0.05% trypsin has several effective concentrations. Under these conditions, peptide bonds between doxorubicin and CNT were broken and doxorubicin was released. Therefore, to analyze how CNT-Dox influence the tumor cells after Dox release, we incubated tumor cells in the w/o fetal bovine serum (FBS) nutrient medium with trypsin and in the presence of CNT-Dox. The survival of tumor cells was determined using the MTT test. The ratio of the nutrient medium, trypsin, concentration of CNT-Dox, and doxorubicin are given in Table 2. The results of incubation HT29 during 48 h are demonstrated on Fig. 8. Cell viability in the presence of trypsin—blue columns, alone doxorubicin—orange columns, and CNT-Dox with trypsin—pink columns. In results, it has been found that the simultaneous use of trypsin and CNT-Dox significantly increased the cytotoxic effect of CNT and doxorubicin compared to the separately use of these substances. So doxorubicin alone at concentrations from 0.05 to 1.0 μg/ml causes a dose-dependent decreasing the percentage of living HT29 cells from 7.18 to 45.7% relative to control (Fig. 8, orange columns). Incubation of CNT-Dox at concentrations of 20.0 to 1.25 μg/ml with trypsin at concentration from 0 t0 70% led to a dose-dependent decreasing in the percentage of living cells from 80.9 and 99.8% respectively (Fig. 8, pink columns). At the same time, incubation with trypsin alone leads to decreasing percentage of living cells only by 34.0–42.0% (Fig. 8, blue columns). Thus, we can conclude that we observe the synergistic effect of CNT-DOX and trypsin. Each individual component has a small cytotoxic effect on cells, and together the cytotoxic potential of substances increases several times.

Percentage of alive cells HT29 after 48 h of incubation in the presence of trypsin, doxorubicin, CNT-Dox. Statistical significance:*р  ≤ 0.05 or **р  ≤ 0.01

As functional groups (Dox) were attached to CNTs surface by peptide bonds as, in vivo Dox release will be realized in organs of the gastrointestinal tract with an increased content of proteases, peptidases. In organism, proteases are used for various metabolic processes. Acid proteases secreted into the stomach (such as pepsin) and serine proteases present in duodenum (trypsin and chymotrypsin) enable us to digest the protein in food [43]. Other proteases are present in leukocytes (elastase, cathepsin G) and play several different roles in metabolic control. This is one of the fastest “switching on” and “switching off” regulatory mechanisms in the physiology of an organism. By complex cooperative action, the proteases may proceed as cascade reactions, which result in rapid and efficient amplification of an organism’s response to a physiological signal. Therefore, the authors suggest that CNT-Dox construction will be the most effective in the case of stomach, pancreas, liver, and small intestine cancer localization in case of parenteral administration of drug.

Influence of CNTs and Their Derivatives on Cell Blood Composition, Hepatic Enzyme System, and Proteins Turnover In Vivo

To determine the impact of the CNTox and CNT-Dox on the protein metabolism and the state of the hepatic enzyme system, the level of albumin (Al), total protein (Tp), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and alkaline phosphatase (ALP) was determined. Data are given in Fig. 9a, b. As a result, it was noted that CNT-Dox and Dox have influence on the hepatic enzymes activity, namely on the AST and ALP. AST level increased in mice serum from 1 group for 21.6%, 2 group for 93.9%, and 3 group for 126.4% compared with control. At the same time, the activity of ALP increased in mice serum from 1 group for 23.5%, 2 group for 119.1%, and 3 group for 147.8%. CNTox administration did not show statistically significant changes in AST, ALT, and ALP levels. In addition, it should be noted that CNTox, Doxorubicin, and CNT-Dox slightly increased the level of total protein in the blood of experimental animals. So, we found that systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage. Notably, symptoms of hepatitis had more manifestation after Dox treatment than CNT-Dox. To determine possible inflammatory processes and systemic effects of CNTox, CNT-Dox on the state of blood cells composition, it was analyzed the blood cell formula of the experimental animals. The results are shown in Table 3. Obtained data are in good agreement with the well-known manifestations of doxorubicin’s hematological toxicity:anemia (decreased red blood cells, hemoglobin, hematocrit), thrombopenia (platelet count), neutropenia (decrease in the number of granulocytes). Interestingly, that it was demonstrated the same direction of the changes of practically all hematological parameters in the 1 (CNTox), 2 (CNT-Dox), and 3 (Dox) groups of animals. However, the change in the 2 and 3 groups of animals was statistically significant accordingly to control and 1 group. In the 2 group (CNT-Dox), it was found pronounced decreasing of the monocyte content related to the system of phagocyte mononuclear cells and cell’s immune response (9.5% and 0.12 × 10 ⁹ /l in control, 4.6% and 0.06 × 10 ⁹ /l in 2 group, and 4.55 and 0.05 × 10 ⁹ /l in 3 group). Animals of 2 and 3 groups demonstrated reducing the content of granulocytes (neutrophils) (12.6 and 0.16 × 10 ⁹ /l in control and 8.5% and 0.2 × 10 ⁹ /l in 2 group and 8.05 and 0.16 × 10 ⁹ /l in 3 group). The number of lymphocytes, both in percentage and absolute, increased in 2 and 3 groups (77.9% and 0.97 × 10 ⁹ /l in control and 86.9% and 2.0 × 10 ⁹ /l in 2 group and 87.8% and 2.3 × 10 ⁹ /l in 3 group). The main function of the lymphocytes is recognition of the antigen and participation in the adequate immunological response of the body. T lymphocytes perform regulatory and effectors functions. B lymphocytes take part in humoral immunity, providing immunoglobulins in response to stimulation of other people’s antigens. So, it can be assumed that an increase in the index of lymphocyte content in experimental 1, 2, and 3 groups can be associated with the introduction of foreign antibodies (CNTs) and/or tissue distraction [44]. Some decrease in the absolute number of leukocytes in 2 (1.2 × 10 ⁹ /l) and 3 (0.85 × 10 ⁹ /l) groups compared with the 1 group of animals (2.0 × 10 ⁹ /l) can be regarded as the result of a gradual accumulation of the reversal of toxic effects of Dox. It is described the reaction of WBC in experimental animal groups as well-known toxic hematologic impact from doxorubicin in the development of leucopenia. The analysis of indicators reflecting the number and state of RBC (erythrocytes and hemoglobin) also showed the same trend of misbalance in the 2 and 3 groups of animals. Statistically significant thrombocytopenia and anemia are more indicative in animals of 2 and 3 groups:the number of erythrocytes (5.54 × 10 ¹² /l in control, 3.97 × 10 ¹² /l in 2 group, and 3.12 × 10 ¹² /l in 3 group), the amount of hemoglobin (78 g/dl for intact animals, 55.5 g/dl for 2 group, and 46.2 g/dl for 3 group), hemoglobin (25.25% for intact animals and 16.75% for 2 group and 15.12% for 3 group). The amount of erythrocytes decreased but the average content of hemoglobin in one erythrocyte did not decrease. And, as a result, concentration of hemoglobin per one erythrocyte increased. Analysis of the RBW counts let us suggest that in 2 and 3 group of animals, there are several processes:decreasing the formation of erythrocytes in the bone marrow, the acceleration of erythrocyte destruction, the violation of the structure of membranes of red blood cells, and molecular defects (oxidation) of hemoglobin. Thrombocytopenia (27 × 10 ⁹ /l in intact animals, 14.0 × 10 ⁹ /l in 2 group, and 12.05 × 10 ⁹ /l in 3 group), a dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia and granulocytopenia (neutropenia) are the predominant manifestations of doxorubicin hematologic toxicity and is the most common acute dose-limiting toxicity of this drug. The direction of changes in the platelet content in the blood of experimental animals treated with CNTox and CNT-Dox is the same; however, significantly more pronounced in the group of animals receiving free Dox.

Monitoring of clinical parameters following CNTox (1 group), CNT-DOX (2 group), free DOX (3 group) administration in Balb/2a mice. Mice were treated by CNTox, CNT-DOX, DOX every 3 days during 4 weeks, in concentrations:CNT—1.5 g/kg and Dox—20 mg/kg of weight. Each experiment was done in triplicate. Statistical significance:*р  ≤ 0.05 or **р  ≤ 0.01. ALT alanine transferase, AST aspartate transferase, AP alkaline phosphatase

Thus, according to our results from in vivo experiments, it was demonstrated that systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile and protein turnover. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage. More than that, dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia, and granulocytopenia (neutropenia) was shown for the group of animals receiving free Dox. This predominant manifestation of hematologic toxicity was less pronounced in the group of animals receiving free CNT-Dox and CNTs. So, we can assume that, in the case of parenteral administration of CNT-Dox under action of gastric juice peptidases, CNT-Dox particles breaks up into free CNT and Doxorubicin. After that, Doxorubicin enters to the stomach cells and partly in the bloodstream. That also causes the specified effect on blood cells composition. For modeling Dox release in vivo, trypsin were used in vitro.

One of the goals of this investigation was to minimize the side effects of carbon vehicle on the body. Previously, the authors demonstrated that CNTs may be a potential threat to tumor development due to its ability to stimulate cell migration and support cells in suspension fraction [33]. In this case, CNTs themselves play a role of artificial extra cellular matrix. Another way CNTs can stimulate suspension cells to aggregation. If this process will be coincident with antitumor drug accumulation on CNTs surface, CNTs will attract substrate-independent cells and kill them. Simultaneously, it was found that pure CNTs did not have statistically significant cytotoxicity to tumor cells. So, CNTs alone are not dangerous as cytotoxic agents and can act as carrier for antitumor drugs to target cells. Then, studies were conducted to the functionalization of the CNTs by antitumor antibodies. It was demonstrated that CNTs are able to carry on the surface not only the Dox but also specific tumor antibodies—anti EGFr [42]. Under the action of trypsin, Dox was released and realized strong cytotoxic effect on tumor cells. Recent studies have shown the synergy cytotoxic effect of CNTs and Doxorubicin after release from CNT-Dox construct in the presence of trypsin. Such effect was not demonstrated by CNTs and Dox separately. Therefore, the benefits from the use of CNTs seems in the usage CNTs as vehicle for antitumor antibody and drug. On the other hand, the negative effects of Doxorubicin, like many other early antitumor drugs, are totally cytotoxic effects. Binding of the Dox to the CNTs partially blocks it. This effect allows ensuring local accumulation of the Dox in the focus of tumor activity with subsequent release and action. Thus, greater efficacy can be achieved with a smaller dose of administration. This effect can be achieved only if there are tumor-specific antibodies on the surface of the CNTs. The possibility of creating such construct was demonstrated by the authors in previous work. Undoubtedly, that CNTs dissemination, accumulation, and Dox effective should be tested on mixed culture in vitro and on a tumor model in vivo. For this purpose, synthesized CNT-FITC was created and conducted. The ability of the CNTs to act as an extra-cellular matrix and the significance of this process for the “tumor-body” system should be tested on the animal model. The effectiveness of the drug will be investigated on the model of Ehrlich carcinoma and colon rectal carcinoma [44]. The distribution of CNTs in the tissues of the body will be investigated using the construct created by the CST-FITC, as was mentioned in this work. The accumulation of CNTs in the tissues of the organs of the gastrointestinal system, namely the stomach, liver, and intestines, will be analyzed by histological assay. These studies are already conducted by the authors.

According to Shang-Lin Wang [4] and our data, free doxorubicin causes similar side effects, but more pronounced than CNT-Dox. Other authors reported that toxicity effect of CNTs depends on way of administration, dose, and time of exposure and varies according to the size and type of the cells [45,46,47,48,49]. Settling of CNTs in the tissues of the liver, kidneys, and stomach with prolonged exposure can cause oxidative stress, DNA damages, compromise cell proliferation, necrosis of tissues, and chronic inflammation [50]. According to Manna [51], CNTs can cause oxidative stress and compromise cell proliferation. In the case of in vitro studies, the cytotoxicity of CNT highly depends on the degree of CNTs purification, functionalization, size, and surface charge [52,53,54,55]. According to our results and previous data, the obtained CNTs did not demonstrate a significant cytotoxic effect [33]. More than that, our data let us suggest that there is a combined cytotoxic effect of CNTs and DOX that occurs as in vitro. That is why we assumed that obtained CNTs can be used against tumor cells, in case of the target accumulation of CNTs/CNT-Dox in tumor tissue. However, mechanisms of the cytotoxic effect of CNTs are not completely clear. Some authors suggested that CNT particles activate NF-kappaB pathway depending on the dose and that the mechanism of activation was due to activation of stress-related kinases [51]. Other authors reported that CNTs have a direct pro-apoptotic effect in vitro in different cancer cell lines and tumor cells obtained from surgical specimens [56], CNTs able to modify fatty acids in cell membranes [57] or erythrocyte membrane damage [58]. For further investigation of accumulation CNTs in cells and tissue, we plan to use CNT-FITC composite.

Other unclear questions are as follows:what is the prolonged impact of CNTs/CNT-Dox on organism level and how does it stimulate accumulation CNTs/CNT-Dox in tumor tissue? To investigate the influence of chronical introduction of CNTs/CNT-Dox, long-time studies on model of transplanted or initiated tumors of various localizations will be realized. Other authors analyzed the distribution of nanotubes throughout the body of mice after pulmonary exposure [59]. In results, accumulation of MWCNTs was documented in several organs, including notably the white pulp of the spleen and the bone marrow. The CNTs usually deposit in the liver, spleen, or lungs after they have served their purpose from where they are expelled gradually out of the body through the renal excretion route [60]. Zhao and Liu reported that accumulation of CNTs in the body can lead to granulomatous inflammation or alveolar septal thickening. Zhuang Liu et al. reported that SWNT-PTX affords higher efficacy in suppressing tumor growth than clinical Taxol® in a murine 4T1 breast-cancer model, owing to prolonged blood circulation and tenfold higher tumor paclitaxel (PTX) uptake by SWNT delivery likely through enhanced permeability and retention [61]. Accumulation of CNTs in the target tissue can be enhanced by placing on the CNTs surface specific antibodies which over expressed by tumor cells. The possibility of using antibodies for the targeted delivery of nanostructured preparations has been described by many authors [62, 63].

Conclusion

In 2D culture CNTox concentration from 25 to 50 and 100 μg/ml led to dose-dependent decreasing the viability of tumor cells to 71.8–69.6–62.5% accordingly compared with control. At concentration of CNTox up to 200 μg/ml, the viability of HT29 decreased to 39.2%. At that time, CNT-Dox at concentrations 12.5–25–50 μg/ml did not show statistically significant cytotoxicity, compared with CNTox. At high concentrations (200 μg/ml), CTN-Dox had even less cytotoxicity than CNTox (50%). After incubation with CNT-FITC in concentration of 25 μg/ml, HT29 cell survival reduced to 55% and at 100–200 μg/ml to 23 and 7% respectively. In 3D culture, increasing of CNTox concentration is accompanied with dose-dependent increasing of median volume of MTS. At concentration CNTox from 12.5, 50, 200 μg/ml median volume of MTS increases from 1.79 to 2.18 and 10.98 mm ³ . CNTs-Dox and CNT-FITC did not cause such effect on tumor cells. Doxorubicin alone at concentrations from 0.05 to 1.0 μg/ml causes a dose-dependent decrease in the percentage of living HT29 cells from 7.18 to 45.7% relative to control. Incubation CNT-Dox at concentrations of 20.0 to 1.25 μg/ml with trypsin at concentration from 0 to 70% led to a dose-dependent decreasing the percentage of living cells from 80.9 and 99.8% respectively. At the same time, incubation with trypsin alone leads to decreasing percentage of living cells only by 34.0–42.0%. So, the synergistic effect of CNT-DOX and trypsin was observed. Each individual component has a small cytotoxic effect on cells, and together the cytotoxic potential of substances increases several times. In vivo, systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage, thrombocytopenia, a dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia, and granulocytopenia (neutropenia). Notably, symptoms of hepatitis had more manifestation after Dox treatment than CNT-Dox.

So, the possibility of targeted delivery and controlled release of any highly toxic drug with the use of CNT depends on strategies of reducing toxicity of CNTs and realizing potential of CNTs and anti-tumor drugs “in right place in right time.” According to the data obtained by authors and literature, it is possible. Our data support the assumption that this approach allows to reduce toxicity of the doxorubicin on the general biochemical indicators of blood and violations in the blood cells composition. At the same time, doxorubicin releasing is realized under certain conditions. And combined effect of CNTs and doxorubicin let us achieve greater efficacy in suppressing tumor cell growth in vitro.

Abréviations

Al:

Albumin

ALP:

Alkaline phosphatase

ALT:

Alanine aminotransférase

AST :

Aspartate aminotransferase

CNT-Dox:

Carbon nanotubes which were functionalized by doxorubicin

CNT-FITC:

Carbon nanotubes which were functionalized by fluorescein

CNTox:

Oxidized carbon nanotubes

CNTs:

Carbon nanotubes

Dox:

Doxorubicine

FTIR :

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

MTS:

Multi-cellular tumor spheroid

MWCNT :

Nanotubes de carbone multi-parois

PTX:

Paclitaxel

Tp:

Total protein