Diélectrophorèse à ondes modulées en fréquence des vésicules et des cellules :demi-tours périodiques à la fréquence de croisement

Contexte

La polarisabilité d'un phénotype électrique est principalement due à la membrane cellulaire et aux propriétés électriques cytoplasmiques qui dépendent de la fréquence du champ électrique appliqué. En conséquence, les cellules individuelles peuvent être identifiées par les différences dans les spectres diélectriques en utilisant des techniques électriques non invasives. Les techniques électriques sont actuellement compétentes pour séparer les cellules présentant des phénotypes utiles à partir d'échantillons inconnus [1-15]. Par rapport à d'autres méthodes de séparation, celles-ci offrent l'avantage majeur que la modification cellulaire par des anticorps ou l'adhérence à un matériau étranger est inutile, ce qui évite le potentiel de dommages cellulaires ou d'activation par ces sondes [1-16]. La caractérisation des propriétés diélectriques cellulaires a été réalisée principalement en utilisant soit la spectroscopie d'impédance [10, 12, 13] soit l'électrocinétique à courant alternatif (AC) telle que la diélectrophorèse (DEP), l'onde progressive DEP (twDEP) et l'électrorotation [1, 9, 15]. Parmi eux, nous nous concentrons sur l'extension de la méthode AC-DEP pour développer une nouvelle méthode de caractérisation diélectrique utilisant les ondes modulées en fréquence (FM) au lieu des champs AC.

En général, le DEP se produit dans un gradient de champ électrique qui crée une force électrocinétique exercée sur tout objet polarisable, chargé ou neutre, dans la direction déterminée non seulement par le vecteur gradient, mais aussi par la partie réelle du Clausius-Mossotti ( CM) facteur [1-15, 17-21]. Par exemple, nous considérons la force DEP induite par le champ électrique AC E _CA (r ,t ) dont la dépendance spatio-temporelle est exprimée par E _CA (r ,t )=Un (r ) cosθ _CA (r ,t ) en utilisant le vecteur d'amplitude A (r ) et la phase θ _CA (r ,t ). La force AC-DEP est générée par le gradient spatial de l'amplitude (i.e., A ) multiplié par la partie réelle du facteur CM, comme mentionné ci-dessus, alors que le gradient spatial de la phase (c'est-à-dire ∇θ _CA ) multiplié par la partie imaginaire du facteur CM crée la force de twDEP ou d'électrorotation, qui fournit donc des informations complémentaires à la méthode AC-DEP en termes de caractérisation diélectrique [9, 15, 20, 21].

Dans cette lettre, nous visons à formuler la force DEP induite par un champ FM et à comparer les méthodes AC- et FM-DEP, de sorte que ni le champ AC ni le champ FM ne prennent en compte la dépendance spatiale de la phase ; par conséquent, nous allons définir θ _CA (t )=2π f _CA t proportionnellement à la fréquence appliquée f _CA . Une caractéristique importante de l'AC-DEP est que la direction de la force ainsi que sa force dépendent de f _CA . Plus particulièrement, la direction de la force est inversée à la fréquence de croisement f _CA =f _X en raison du changement de signe de la partie réelle du facteur CM, qui a été trouvé disponible pour la caractérisation diélectrique en utilisant AC-DEP [1–15].

La dépendance en fréquence de la force AC-DEP a également rendu possible les manipulations suivantes [1-15, 22-31] :piégeage, focalisation et translation électriquement contrôlables de particules colloïdales, ainsi que le fractionnement et la caractérisation de la vie et/ou cellules mortes. Les systèmes conventionnels pour l'assemblage et/ou la manipulation diélectrophorétique de particules colloïdales ont souvent utilisé des électrodes microfabriquées entre lesquelles le champ électrique alternatif a été appliqué à des suspensions colloïdales, bénéficiant des récents progrès rapides dans la fabrication de dispositifs semi-conducteurs intégrés [24-30] . Cette technologie, offrant une manipulation sans contact, est actuellement intégrée à une variété de systèmes de laboratoire sur puce qui offrent l'avantage d'une manipulation précise et reproductible. Néanmoins, les électrodes sur puce qui créent des taches de haute intensité dans les champs alternatifs sont incapables de changer de position indépendamment du porte-échantillon, contrairement au foyer laser qui peut être positionné librement lors de la manipulation optique. Il résulte de la limitation des systèmes sur puce que les méthodes DEP précédentes ont présenté une certaine difficulté et complexité dans l'exécution des types d'opérations pour lesquelles les pincettes optiques sont adaptées. Une méthode candidate pour surmonter ces difficultés est le DEP basé sur l'image optique [32].

Ici, nous avons adopté, comme alternative plus simple, l'une des techniques de pinces électroniques [22, 23, 33-38] pour l'assemblage et/ou la manipulation diélectrophorétique à la demande sans appareil optique (voir Fig. 1). Comme le montre la figure 1, notre système de type plug-in utilise une paire d'aiguilles de microélectrodes contrôlées par des micromanipulateurs pour appliquer les champs électriques externes dans une suspension colloïdale. Les sondes à électrodes n'étaient pas fixes mais plutôt mobiles dans des suspensions colloïdales en raison de leur style enfichable. Il reste cependant une exigence importante pour l'utilisation pratique de la caractérisation diélectrique :la durée pendant laquelle un champ électrique est appliqué aux cellules entourées d'électrolytes salés doit être minimisée. Par exemple, la méthode AC-DEP implique l'utilisation d'électrodes en forme de peigne interdigitées qui sont intégrées dans un système microfluidique afin que les champs alternatifs de différentes fréquences puissent être appliqués simultanément dans une suspension cellulaire [24-30]. Bien que de tels systèmes sur puce raffinés se soient avérés pertinents pour la caractérisation diélectrique, la technique à paires d'électrodes multiples est inapplicable au système à paire d'électrodes unique qui a souvent été utilisé dans les techniques de pinces électroniques [22, 23, 33-38] .

Montage expérimental. Schéma du système de manipulation diélectrophorétique illustrant le champ électrique CA ou FM appliqué à une particule cible via une paire d'aiguilles d'électrode contrôlées par des micromanipulateurs patch-clamp

Pour effectuer des mesures multifréquences simultanées en utilisant le système à paire d'électrodes unique (Fig. 1), le changement du champ électrique appliqué doit être étudié. Dans cette lettre, nous abordons la disponibilité du DEP variable dans le temps en raison d'une onde FM (FM-DEP) de la forme suivante :

où la phase θ (t ) de l'onde FM est liée à la fréquence instantanée f (t ) comme 2π f (t )=d θ (t )/d t et

avec f _m désignant la fréquence de modulation. Nous utilisons la large bande FM satisfaisant que Δ f /f _m ≫1, de sorte que les conditions de f _m /f (t ), f _m /f _c , f _m /Δ f ≪1 sera appelé la limite de bande large (WBL) dans la formulation théorique donnée ci-dessous.

Dans cette lettre, une attention particulière est accordée à la relation entre la fréquence caractéristique de f _X et la trajectoire de FM-DEP. Dans la section suivante, nous décrivons à la fois les matériaux utilisés et les détails du système de plug-in pour induire FM-DEP. La troisième section fournit les résultats et la discussion qui se compose de quatre parties. Tout d'abord, nous étudions les détails de la répétition des demi-tours d'une seule cellule leucémique en quantifiant la trajectoire alternative, dont la périodicité est expliquée par la fréquence de modulation f _m , ou l'oscillation périodique de f (t ) donnée par l'Éq. (2). Ensuite, nous expliquons théoriquement la trajectoire alternative en dérivant la force diélectrophorétique variant dans le temps qui module en fonction de la fréquence instantanée f (t ) du champ FM satisfaisant à la condition WBL. La forme obtenue de la force diélectrophorétique fournit l'équation qui détermine le f _X des demi-tours observés. Troisièmement, nous mesurons l'amplitude de la force diélectrophorétique sur une vésicule multilamellaire (MLV) qui a été attachée à une aiguille d'électrode en raison de l'attraction de l'AC-DEP. La dépendance en fréquence de la force a été ajustée en utilisant l'équation spectrale qui a été déterminée à partir de la partie réelle du facteur CM, de sorte que f _X a été déterminée comme la fréquence caractéristique à laquelle la force d'attraction due à AC-DEP disparaît. Parce que la méthode FM-DEP donne également f _X en analysant la trajectoire alternative d'un MLV, nous évaluons l'étendue de la coïncidence entre les fréquences de croisement évaluées à partir des AC- et FM-DEP. Enfin, les conductivités cytoplasmiques et les capacités membranaires de trois types de cellules ont été évaluées à partir de f _X en fonction croissante de la conductivité de la solution, et les valeurs obtenues ont été comparées à celles rapportées dans la littérature.

Méthodes

Matériaux

Pour préparer des vésicules multilamellaires (MLV), nous avons utilisé du 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine (DOPC) comme lipides, achetés auprès d'Avanti Polar Lipids. Les MLV ont été obtenues par la procédure suivante. Le DOPC (1 mL, 20 mM) dissous dans du chloroforme/méthanol (2:1 v /v ) a été séché avec N₂ gaz, et le solvant a été complètement éliminé sous vide pendant plus de 12 h. Le film mince déposé sur le flacon en verre en raison de l'évaporation a été réhydraté à l'aide d'eau déminéralisée et incubé à 25 °C pendant plusieurs heures.

Deux lignées cellulaires utilisées dans les expériences étaient JKT-beta-del de la lignée de leucémie humaine à cellules T (TL) et CCRF-SB de la lignée de leucémie humaine à cellules B (BL). Les deux types de cellules TL et BL ont été utilisés après 1 semaine d'incubation dans un incubateur humidifié contenant 5 % CO₂ à 37, de sorte que nous avions les concentrations cellulaires dans la plage de 0,5 × 10 ⁶ à 1×10 ⁶ cellules/mL. Le milieu RPMI 1640 pour la culture cellulaire a été supplémenté avec 10 % de sérum de brovine fœtal et 100 mM de pyruvate de sodium. Les cellules ont été sédimentées par centrifugation à 370g pendant 3 min deux fois afin que les cellules puissent être purement remises en suspension dans 1 ml du milieu RPMI 1640 avant le pipetage. Les suspensions cellulaires obtenues ont été encore diluées à l'aide de la solution isotonique de saccharose 200 mM afin de préparer le solvant ayant une conductivité requise.

Nous avons également utilisé des globules rouges humains (RB) dispersés dans les suspensions suivantes. Des échantillons de sang total fraîchement prélevés ont été prélevés sur des volontaires sains au début de la vingtaine. Les cellules, mises en suspension dans un mélange de milieu RPMI 1640 et d'hématocrite de 3,1%, ont été diluées à l'aide de la solution isotonique de saccharose 200 mM afin de préparer le solvant ayant une conductivité requise ainsi que les cellules leucémiques ci-dessus. Toutes les expériences diélectrophorétiques utilisant les cellules RB humaines ont été terminées dans les 10 minutes suivant le prélèvement des échantillons de sang total.

Configuration expérimentale

Les conductivités des suspensions cellulaires ont été mesurées à l'aide d'un conductimètre (SevenMulti, Mettler-Toledo, Columbus, OH, USA). Un schéma du système enfichable utilisé est illustré à la Fig. 1. Un champ électrique externe avec une onde CA ou FM a été appliqué via un générateur de forme d'onde arbitraire (Agilent 33220A, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) avec un courant amplificateur (F30PV, FLC Electronics, Partille, Suède) auquel étaient connectées des microélectrodes de type enfichable. Les microélectrodes comprenaient des aiguilles en tungstène avec un diamètre de pointe de 0,5 μ m qui ont été contrôlés indépendamment par deux ensembles de micromanipulateurs patch-clamp (NMN-21, Narishige, Setagaya-ku, Tokyo, Japon). Dans toutes les expériences qui suivent, nous avons maintenu la séparation des pointes à 100 μ m lors de l'application des champs externes aux suspensions ci-dessus, et la magnitude maximale a été fixée à 0,5 kV/cm. La paire d'aiguilles a été insérée dans une goutte d'échantillon montée sur le microscope optique inversé (TE2000-U, Nikon, Minato-ku, Tokyo, Japon), et les micrographies optiques ont été obtenues à l'aide d'une caméra CCD (Retiga Exi, QImaging, Surrey, British Columbia, Canada) avec une fréquence d'images de 25 ips ; incidemment, il a été confirmé que la résolution de fréquence des ondes FM en raison de la fréquence d'images était toujours dans les barres d'erreur pour chaque donnée. A 50- μ L goutte de suspension a été montée sur la platine d'échantillon du microscope optique inversé, dont la température a été maintenue à 25 °C à l'aide d'un régulateur de chaleur.

La technique du plug-in permet au système simple d'effectuer diverses manipulations sans contact d'une seule cellule, telles que la pousser dans un canal étroit sans aucun contact et l'orienter dans la direction souhaitée. Bien qu'il soit souvent nécessaire de traiter les cellules dans une solution isotonique avec du sel, il est plus facile de mettre en œuvre les manipulations DEP ci-dessus sur des cellules entourées d'eau déminéralisée. Dans le fichier supplémentaire 1 :Films S1 à S3, le système de plug-in a induit l'AC-DEP de cellules de diatomées en suspension dans de l'eau déminéralisée. On peut voir dans le Fichier supplémentaire 1 :Films S1 à S3 qu'une cellule de diatomée anisotrope dispersée dans de l'eau sans sel a été manipulée comme un post-it par une paire de microélectrodes entre lesquelles le champ électrique alternatif (1 kV/cm) a été appliqué . Les opérations sans contact consistent en trois étapes :(i) une cellule cible a d'abord été tournée en parallèle à une paroi de verre chargée positivement par la combinaison de l'alignement des dipôles à une fréquence de 30 kHz et du changement de position de chaque microélectrode (Fichier supplémentaire 1 : film S1 ), (ii) nous avons par la suite changé la fréquence à 100 kHz pour la pousser vers le mur pour fixer électrostatiquement la cellule de demande avec des charges négatives sur la surface du verre (Fichier supplémentaire 1 :Movie S2), et (iii) la fréquence AC a été ajustée à 20 MHz pour induire l'AC-DEP dans la direction opposée, afin que la cellule électrostatiquement attachée puisse être retirée (Fichier supplémentaire 1 :Film S3).

Résultats et discussion

Observation expérimentale d'une cellule leucémique souffrant de FM-DEP

Nos microélectrodes enfichables (voir Fig. 1) permettent d'appliquer le champ électrique aux particules flottant bien au-dessus du substrat de l'échantillon, ce qui est d'une utilité pratique pour sélectionner les cellules appropriées. Par exemple, Additional file 1 :Movie S4 montre que la paire de microélectrodes a été contrôlée pour s'approcher d'une cellule de diatomées triangulaire flottante à laquelle nous avons appliqué le champ électrique alternatif avec sa fréquence sautant entre 100 et 500 kHz à des intervalles de 0,5 s. Dans le fichier supplémentaire 1 :Film S4, nous voyons la cellule triangulaire rebondir sur une microélectrode en raison du saut de fréquence comme résultat préliminaire avant la manipulation suivante à l'aide du FM-DEP.

Fichier supplémentaire 1 :Les films S5 et S6 montrent des comportements typiques de plusieurs cellules TL connaissant le FM-DEP, qui sont similaires à ceux de cellules de mammifères manipulées par une pince à épiler électronique utilisant une seule électrode AC-DEP [36]. La figure 2 illustre l'une des trajectoires périodiques en utilisant le tracé 3-D de (x ,y ) le long du t axe, où une coordonnée relative de (x ,y ) est affectée à la position de cellule temporaire avec l'origine de (0, 0) située en un point spécifique sur une aiguille de microélectrode pour extraire la configuration cellule-électrode. Alors que le x l'axe représente la tangente à la surface de l'électrode à (0, 0), le y L'axe, perpendiculaire à la tangente, reflète principalement la projection des demi-tours périodiques expliqués ci-dessous. Sur la figure 2, nous avons sélectionné une cellule TL flottante à laquelle nous avons appliqué le champ électrique FM avec sa fréquence de modulation f _m défini sur f _m =0,25 Hz dans la gamme de 200 kHz ≤f (t )≤ 3 MHz. Parce que nous avons ce Δ f /f _m , f (t )/f _m <10 ⁻⁵ , la condition WBL est effectivement vérifiée, comme mentionné après l'Eq. (2).

Trajectoire 3D d'une cellule TL ciblée. Des demi-tours périodiques dus à la modulation de fréquence sont démontrés pour la cellule TL subissant le FM-DEP

Il ressort du fichier Additionnel 1 :Films S5 et S6 ainsi que de la Fig. 2 que la trajectoire périodique est constituée de trois parties de sortie, d'approche et de séjour sur la microélectrode :(i) la cellule quitte la microélectrode, (ii) il s'approche de la microélectrode après avoir fait un demi-tour, et (iii) il reste sur la surface de la microélectrode. La cellule est souvent incapable de revenir à la même position sur la surface de la microélectrode en raison du flux de solvant, qui n'est pas seulement observé dans le fichier supplémentaire 1 :Film S6, mais est également représenté par les demi-tours avec la cellule migrant dans le x direction de la Fig. 2. Malgré l'interférence avec le flux de solvant, il est possible de distinguer les moments où la cellule commence à quitter la surface de la microélectrode et fait le demi-tour dans la trajectoire périodique, respectivement. En conséquence, nous pouvons voir sur la figure 2 que ces demi-tours sont répétés à des intervalles de 4 s en coïncidence avec la fréquence de modulation de 0,25 Hz, ou la période de 4 s de la fréquence instantanée f (t ).

Etude théorique sur le FM-DEP

Pour expliquer les trajectoires expérimentales, y compris les demi-tours périodiques, nous considérons un objet sphérique comme un modèle simplifié d'une seule cellule, auquel un champ électrique arbitraire variant dans le temps E (r ,t ) est appliqué. La figure 3 montre un schéma de la force DEP dépendante du temps agissant sur un objet sphérique [9]. Comme le montre la figure 3, la permittivité et la conductivité à l'intérieur d'un objet sphérique sont représentées par ε _dans et σ _dans , respectivement, et l'indice "out", tel que ε _sortie et σ _sortie , désigne l'extérieur. En général, F _DEP (r ,t ) est lié au moment dipolaire induit p (r ,t ) comme [17–19]

Modèle théorique. Représentation schématique de la force FM-DEP exercée sur une cellule qui est modélisée comme un modèle de sphère homogène ayant la permittivité et la conductivité de ε _dans et σ _dans , respectivement. La sphère est entourée d'un milieu électrolytique avec sa permittivité et sa conductivité de ε _sortie et σ _sortie , respectivement. Le modèle de sphère homogène est la simplification du modèle sphérique à coque unique qui considère la cellule comme un cytoplasme barbouillé entouré d'une membrane [9]

où K _H et Δ τ sont définis comme suit :K _H =(ε _dans −ε _sortie )/(ε _dans +2ε _sortie ), et \(\Delta \tau ^{-1}=\tau _{0}^{-1}-\tau ^{-1}\) en utilisant le rayon R de l'objet sphérique et deux temps caractéristiques de τ ₀ =(ε _dans −ε _sortie )/(σ _dans −σ _sortie ) et τ =(ε _dans +2ε _sortie )/(σ _dans +2σ _sortie ).

Substitution du champ électrique AC E _CA (r ,t )=Un (r ) cos(2π f _CA t ) dans les équations. (3) à (5), on obtient la force DEP moyenne <F _DEP (r ,t )> qui a été moyennée sur les cycles du champ AC [9, 15, 20] :

où A _RMS désigne le vecteur quadratique moyen (RMS) satisfaisant que \(\boldsymbol {A}_{\text {RMS}}^{2}=\boldsymbol {A}^{2}/2\), et χ (f _CA )≡2π R ³ ε _sortie Re[K (f _CA )] dépend de la fréquence appliquée f _CA en raison de Re[K (f _CA )], la partie réelle du facteur CM [9, 15, 20] :

où K _L =(σ _dans −σ _sortie )/(σ _dans +2σ _sortie ) et K _H , défini ci-dessus, correspondent aux valeurs réelles de CM dans les limites de basse et haute fréquence, respectivement, et ces valeurs limites, K _L et K _H , doivent avoir des signes opposés pour que f _X défini par χ (f _X )=0 peut exister [9, 15, 20].

Les équations (6) et (7) indiquent que le champ électrique alternatif crée la force DEP dont la direction dépend de la fréquence appliquée f _CA via χ (f _CA ) donnée par l'Éq. (7), ce qui explique la cellule de diatomée rebondissante dans le fichier supplémentaire 1 :Film S4 comme suit (voir également la figure 3). Lorsque la fréquence appliquée fournit le signe plus de la partie réelle du facteur CM (c'est-à-dire, χ (f _CA )>0), nous pouvons observer des cellules attirées vers les pointes d'aiguilles d'électrodes (le DEP positif) sur lesquelles la force du champ alternatif, appliqué via une paire d'aiguilles d'électrodes, est la plus grande. Le signe du facteur CM réel peut être inversé en négatif à f _X , la fréquence de disparition du facteur CM réel (c'est-à-dire, χ (f _X )=0), où nous avons la force diélectrophorétique nulle telle que trouvée à partir de l'équation. (6). Dans le signe négatif du facteur CM (c'est-à-dire, χ (f _CA ) <0), les colloïdes individuels sont repoussés de la paire d'aiguilles d'électrode (le DEP négatif). La cellule de diatomées triangulaires dans le fichier supplémentaire 1 :le film S2 a rebondi à cause de la direction opposée des AC-DEPs induites par les champs AC avec leurs fréquences de 100 et 500 kHz; combinant l'éq. (6) et les directions diélectrophorétiques observées, on trouve que χ (100 kHz)>0 et χ (500 kHz)<0.

Ensuite, nous considérons le FM-DEP en branchant la phase donnée par les Eqs. (1) et (2) dans les équations. (3) à (5). Comme prouvé dans le fichier additionnel 2, la condition WBL de l'onde FM valide la forme approximative de l'intégration dans l'Eq. (5), fournissant ainsi

qui devient la même forme que celle de l'AC-DEP lorsque la fréquence dépendante du temps f (t ) est remplacé par une fréquence constante de f _CA . On obtient ainsi la forme limite de la force DEP moyenne <F _DEP (r ,t )> qui a été moyennée sur des cycles de θ (t ) dans le champ FM (voir les équations (A1), (A13) et (A14) dans le fichier complémentaire 2) :

étant d'une forme similaire à l'Eq. (6) pour l'AC-DEP. La différence est de savoir si le coefficient de χ {f (t )} dépend de t via f (t ), qui change cycliquement en fonction de la modulation de fréquence avec la période de T _m =1/f _m .

Sur la base de l'expression simple (9) du FM-DEP, nous illustrons avec la Fig. 4 le mécanisme des demi-tours ci-dessus dus à l'onde FM. La figure 4 montre un schéma du DEP induit par l'onde FM dans le WBL lorsque la plage de f (t ) couvre la fréquence de croisement f _X tel que f _c −Δ f f _X f _c +Δ f . On suppose sur la Fig. 4 que la dépendance en fréquence de la partie réelle du facteur CM, ou χ {f (t )}, fournit les changements de signe alternatifs comme suit :signe moins (χ {f (t )}<0) pour f (t )<f _X et signe plus (χ {f (t )}>0) pour f (t )>f _X , ce qui est le cas de nos expériences. L'ancienne période satisfaisant f (t )<f _X a un temps de durée, alors que ce dernier f (t )>f _X a été retenu pendant le reste de la période :un cycle est classé en deux périodes marquées respectivement en rouge et en bleu sur la figure 4.

Direction de la force liée à la modulation de fréquence. Une illustration des demi-tours périodiques dus à l'onde FM avec sa fréquence dépendante du temps de f (t ) couvrant une fréquence de croisement f _X

De manière similaire à l'AC-DEP, l'Eq. (9) implique que le signe moins (χ {f (t )}<0) crée une force DEP répulsive entre la cellule et les microélectrodes tout en satisfaisant que f (t )<f _X . En conséquence, la cellule quitte la zone autour des pointes des aiguilles des microélectrodes entre lesquelles l'amplitude du champ électrique est la plus grande :la cellule subit le DEP négatif pendant la période rouge de Δ t _n dans la Fig. 4. A l'instant t _X comme solution de f (t _X )=f _X , χ (f ) disparaît, suivi du changement de signe en χ (f )>0 tandis que f (t )>f _X , et en conséquence la force DEP est commutée sur la force d'attraction à t _X . Après avoir fait demi-tour à t _X en raison de l'inversion de sens de la force DEP, la cellule ciblée commence à s'approcher de la microélectrode en migrant dans la direction opposée et est finalement piégée entre les pointes des aiguilles des électrodes ou fixée sur l'une des électrodes :la cellule subit le DEP positif pendant la période bleue de Δ t _p sur la figure 4. La figure 4 indique que le cycle de sortie, d'approche et de séjour sur la microélectrode doit être répété avec la période de modulation de T _m , en accord avec la Fig. 2 :Δ t _n +Δ t _p =T _m . Le mécanisme diélectrophorétique représenté sur la figure 4 peut ainsi expliquer les demi-tours périodiques observés dans le fichier supplémentaire 1 :Films S5 et S6 ainsi que sur la figure 2.

Considérons la solution périodique de l'équation, f (t _X )=f _X . Comme le montre la figure 4, t _X est exprimé par t _X =n T _m +0,5Δ t _p =n T _m +0.5(T _m −Δ t _n ) en utilisant un entier de n =0, ±1, ±2,⋯, qui se lit plus loin

Substituting Eq. (10) into Eq. (2), we have for n =0 that

clarifying that the FM-DEP method determines the crossover frequency if the duration time Δ t _n from leaving the microelectrode to doing the U-turn can be measured precisely.

Comparing Crossover Frequencies of a Single MLV Determined from the FM- and AC-DEPs

We investigated the experimental accuracy of Eq. (11). Experimentally, it is often necessary for the biological cells to be dispersed in an electrolyte. For MLVs, however, the use of deionized water is allowed during the preparation process of rehydration and dilution. We thus used the salt-free MLV suspension for comparing the crossover frequencies determined from both AC- and FM-DEPs.

The dielectrophoretic U-turns of a targeted MLV were induced by the FM wave in the range of 10 kHz ≤f (t )≤ 50 kHz (i.e., f _c =30 kHz and Δ f =20 kHz) with a setting that f _m =0.1 Hz, and correspondingly the FM-DEP has a 10-s period. In the experiments, it takes less than 30 s to observe a few U-turns of the targeted MLV from leaving to approaching microelectrodes. From the trajectory, we obtained the mean leaving time that \(\overline {\Delta t_{n}}=5.8\pm 0.2\) s. Because the WBL condition applies to the present experiment satisfying that f _m /Δ f /f _m , f _, m /f (t )<10 ⁻⁵ , the crossover frequency was evaluated to be f _X =35±1 kHz from substituting \(\overline {\Delta t_{n}}=5.8\pm 0.2\) s into Eq. (11).

For comparison, we made use of the programmable manipulator in the AC-DEP method that tries to evaluate the crossover frequency of the same targeted MLV to which the sinusoidal electric field with a frequency in the range of 30 to 100 kHz was applied via the electrode needle pair for inducing the AC-DEP. Because the programmable manipulator carries the electrode needle pair at a constant speed in one direction, we can measure the dielectrophoretic force similarly to the laser-trapping experiments [39]. Attaching the MLV on an electrode tip that undergoes uniform linear motion, not only the AC-DEP force but also the hydrodynamic force caused by the one-dimensional motion are exerted on the MLV. With the gradual increase of electrode velocity, F _DEP eventually becomes smaller than the hydrodynamic force. As a result, the MLV initially attached to the moving electrode, owing to the DEP attraction, is desorbed by the hydrodynamic force. Defining the critical value, v _c , by the maximum velocity value of the microelectrode pair prior to the desorption, the force balance equation between the DEP and hydrodynamic forces reads [39]

where F _DEP (f _AC )e ≡<F _DEP> with the unit vector e defined by \(\boldsymbol {e}=\nabla {\boldsymbol {A}}^{2}_{\text {RMS}}/|\nabla {\boldsymbol {A}}^{2}_{\text {RMS}}|\), η the water viscosity at 25 °C and 2R the diameter of the MLV.

Additional file 1:Movies S7 and S8 demonstrates the force measurement using the above AC-DEP method at the applied frequency of f _AC =60 kHz. In Additional file 1:Movie S7, the velocity of the electrode pair controlled by the programmed manipulator is 110 μ m/s, which is lower than v _c ; therefore, the MLV remains attached to one part of the electrode pair owing to the dielectrophoretic attraction. Additional file 1:Movie S8, on the other hand, shows the higher electrode speed of 120 μ m/s, under which the dielectrophoretic force becomes smaller than the hydrodynamic force that is exerted on the MLV, thereby desorbing the MLV from the electrode. Accordingly, v _c is evaluated to be 110 μ m/s ≤v _c ≤ 120 μ m/s, and we can calculate F _DEP (60 kHz) using Eq. (12).

We can determine f _X from the experimental results of F _DEP at various external frequencies. Figure 5 shows the frequency dependence of F _DEP , indicating that the DEP force experienced by the MLVs was reduced by lowering the applied frequency. It is found from Eqs. (6) and (7) that the fitting function of F _DEP (f _AC ) can be expressed as

Frequency dependence of F _DEP . The FM-DEP force (F _DEP ) as a function of external frequency (f _AC ) of applied AC field where F _DEP has been evaluated from Eq. (12), the balance equation between the FM-DEP and hydrodynamic forces exerted on a single MLV. It can be seen that F _DEP is increased and saturated as f _AC is higher, reflecting a typical behavior of the relaxation spectrum of the real CM factor. The solid line represents the best-fit result of Eq. (13)

implying that

Equation (13) is depicted by the solid line in Fig. 5 that has been fitted to the experimental data using the best-fit results of three parameters:L =−21.02 pN, H =19.03 pN, and τ =4.9 μ s. Substituting these results into Eq. (14), we evaluate that f _X =34.15 kHz, which coincides with the result of f _X =35±1 kHz evaluated from the FM-DEP method. The FM-DEP method is thus validated in terms of the consistency with the direct force measurement using the AC-DEP method.

Conductivity Dependencies of the Crossover Frequencies for Biological Cells

Let us return to the dielectrophoretic U-turns of biological cells mentioned in Fig. 2 to assess the practical reliability of the crossover frequencies when the FM-DEP method is applied to cell suspensions. Recently, an elaborate theory [40] has investigated, in more detail than before, the relationship between the homogeneous sphere model (see Fig. 3) and the single-shell model where the inner structure of cell is represented by a smeared-out cytoplasm surrounded by a membrane. As a result, the relation between f _X and the suspension conductivity σ _out has been formulated using radius R of a cell, membrane capacitance C _m , and cytoplasmic conductivity σ _cyt [40]:

where f _{X 0} is the extrapolated value to the crossover frequency at σ =0 mS/m and will be treated as a fitting parameter herein. The elaborate treatment adds the squared term, the second term on the right hand side of Eq. (15), to the conventional linear relation which has mainly been used for evaluating C _m from f _X [40–45]. Theoretically, it has still been claimed [40] that Eq. (15) is valid within a lower range of σ _out such that σ _out <10 mS/m; however, it should be better to include the squared term in the evaluation of C _m , considering that our range of σ _out is relatively high compared with previous results in the range of 10 mS/m ≤σ _out ≤ 100 mS/m [40–45]. Hence, we determined σ _cyt as well as C _m from fitting Eq. (15) to the experimental results of f _X as an increasing function of σ _out .

There are three kinds of biological cell used:TL and BL cells of human leukemia and RB cells of three human volunteers. In all the experiments using any species of cell, the conductivities were within the range of 60 to 160 mS/m, and the modulation frequency was set to be 0.25 Hz. Regarding the instantaneous frequency, most of the experiments adopted the range from 100 to 1.5 MHz (i.e., f _c =800 kHz and Δ f =700 kHz); exceptionally for leukemia cells, the frequency range was extended to 50 kHz ≤f (t )≤1550 kHz (i.e., f _c =800 kHz and Δ f X =750 kHz) in the conductivity range of 60 mS/m≤σ ≤80 mS/cm because f _X in this σ -range has been found to be lower than 100 kHz, and we were unable to observe the DEP U-turns in the range of 100 kHz ≤f (t )≤1500 kHz. Both of these frequency sets satisfy the WBL condition of Δ f /f _m , f (t )/f _m <10 ⁻⁵ as before.

Each time we measured the leaving times of cells dispersed in a suspension, we looked for an appropriate spot at which a few cells having a similar size could simultaneously experience the FM-DEP above the substrate, and the microelectrode tips were placed at the measurable position using the micromanipulator. We continued such scanning inside the cell suspensions until the FM-DEP trajectories of 10 cells were collected in total at a couple of appropriate positions. For each kind of cell, the measurement of 10 cells was repeated twice using different drops of the same cell suspension. As mentioned, it is indispensable for the implementation of the FM-DEP measurement at each spot to suppress the electrically induced solvent flows as much as possible. Hence, we traced only two cycles of the U-turn path so that the duration time of applying the electric field could be adjusted to be less than 10 s, and, correspondingly, the leaving time of each cell is given as the average of each trajectory, including the two U-turns. The mean leaving time \(\overline {\Delta t_{n}}\) of each cell suspension is thus obtained from averaging the leaving times of 20 cells. Particularly for human RB cells, we further averaged three sets of the mean crossover frequencies obtained for three RB cell suspensions of three human beings, supposing that cells of the same species are similar in C _m and σ _cyt as well as in R . The two-step averaging of Δ t _n will be denoted by \(\left <\overline {\Delta t_{n}}\right>\). Substituting into Eq. (10) the experimental data of either \(\overline {\Delta t_{n}}\) or \(\left <\overline {\Delta t_{n}}\right>\), the mean crossover frequency <f _X > was obtained.

Figure 6 shows the σ _out -dependencies of <f _X > measured for the above three kinds of biological cells using the FM-DEP method. The solid lines in Fig. 6 depict the best-fit results of Eq. (15). We evaluated C _m and σ _cyt from the best fitting of Eq. (15) into which the observed radii (R _obs ) were inserted. Table 1 lists the fitting results of C _m and σ _cyt , where we used the observed radii of 10 μ m ≤ 2R _obs ≤ 15 μ m for TL and BL cells, and 7.5 μ m ≤ 2R _obs ≤ 10 μ m for RB cells in evaluating C _m . It is to be noted from Table 1 that different species have different membrane capacitances, which are in good agreement with those reported in the literature [40–47]; the C _m values of RB cells with stationary whole blood samples from normal (healthy) donors are in excellent agreement with our value [46, 47], but are substantially higher than those of washed RB cells in isotonic buffered saline as noted in [47]. The best-fit results simultaneously provided cytoplasmic conductivities, which were consistently similar as seen from Table 1, but were slightly lower than the range of previous reports that 0.2 S/m ≤σ _cyt ≤1 S/m [40, 45, 48–51]. These results support that the FM-DEP method retains the practical reliability needed for the treatment of living cells.

Conductivity dependences of crossover frequencies. Mean crossover frequency, <f _X >, of TL cells (blue triangles), BL cells (green diamonds), and RB cells (red circles) varying with increase of solution conductivity σ _out . The best-fit results of Eq. (15) are delineated by the solid lines

Conclusions

Our theoretical treatment of the FM-DEP has mainly focused on the WBL condition. In this limit, we have proved theoretically that the direction of the FM-DEP force switches each time when the instantaneous frequency of the FM wave traverses the crossover frequency, thereby implying the periodic U-turns of micro/nanoparticles that undergo the FM-DEP. Two kinds of experiment have demonstrated the accuracy and reliability of f _X obtained from the observed trajectories of MLVs and cells using our formulation of the FM-DEP (Eqs. (9) and (11)):While the f _X evaluated from the FM-DEP of a single MLV coincides with that obtained from the force measurement of the same MLV experiencing AC-DEP, the conductivity dependencies of f _X provide the membrane capacitances of various cells that are in close agreement with the literature values. In other words, it has been validated theoretically and experimentally that the FM-DEP in the WBL limit can be mimicked by the time-varying AC-DEP induced by the AC wave with its frequency changing continuously according to the periodic function of f (t ). The simple view applies to other electrokinetics, including the twDEP and the electrorotation by applying the FM wave that has the spatial dependence of the phase as well as the magnitude. The AC- and FM-DEPs are associated with the real part of the dielectric spectra (or the CM factor), whereas the electrokinetics due to the spatial gradient of the phase reflect the imaginary part of the CM factor as mentioned before. Therefore, the application of the FM wave to either twDEP or electrorotation will be required for completing the dielectric characterization (the dielectric spectroscopy, in general) using the electrokinetics.

We have treated microparticles such as MLVs and cells for the precise tracking of particle trajectories. In these experiments, sedimented particles as well as floating ones have been observed; we need to increase the magnitude of electric field for inducing the DEP of the sedimented particles which are likely to be aggregated. Accordingly, we have used the plug-in system for applying the FM wave to a targeted particle floating above the substrate.

It is promising to further develop the FM-DEP method for smaller particles with their sizes of submicron to nanoscale, such as dispersed carbon nanotubes, thereby opening up the possibility of real-time spectroscopy using the FM-DEP as described below. When we apply the FM wave to the smaller colloids using the on-chip systems whose electrode configuration is designed to create a constant gradient of the applied electric field, the time-varying velocity vector v (t ) of the FM-DEP caused by the time dependence of the FM-DEP force is ascribed to the variation in χ (f ) (or the real part of the CM factor):it is found from Eqs. (9) and (12) that

Hence, measuring the velocity vector v (t ) of a submicron to nanoparticle could provide the frequency dependence of the real part of the CM factor directly, which would be nothing but the electrokinetic FM spectroscopy.

Abréviations

AC:

Alternating current

BL:

B cell leukemia

CM:

Clausius-Mossotti

DEP:

Dielectrophoresis

DOPC:

1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine

FM:

Frequency modulated

MLV:

Multilamellar vesicle

RB:

Red blood

RMS:

Root mean squared

TL:

T cell leukemia

twDEP:

Traveling wave dielectrophoresis

WBL:

Wide band limit