Enquête sur les caractéristiques physicochimiques d'un système à base de nanoliposomes pour l'administration de deux médicaments

Contexte

Les cancers incurables tels que les cancers du sein triple-négatifs ont des limites au traitement avec des thérapies standard en raison de la réponse aux dommages à l'ADN fortement interconnectée avec divers réseaux de signalisation [1,2,3]. Des stratégies thérapeutiques augmentant la chimio-sensibilité initiale de ces tumeurs récalcitrantes ont été étudiées pour en repousser les limites [4, 5]. Une étude récente supprimant les voies de signalisation oncogènes lors de l'utilisation d'un agent endommageant l'ADN est l'une des stratégies thérapeutiques combinatoires [6,7,8]. L'étude a suggéré que le prétraitement d'un inhibiteur du facteur de croissance des cellules cancéreuses résistantes synergise leur réponse apoptotique à un médicament génotoxique [9, 10]. Il existe un besoin clinique très important de stratégies thérapeutiques pour cibler plusieurs voies de survie spécifiques aux cellules cancéreuses afin d'améliorer l'étendue de la destruction des cellules tumorales et de réduire potentiellement l'exposition totale au médicament pendant le traitement [11, 12]. Pendant ce temps, afin de traduire les effets synergiques in vitro de deux types de médicaments en clinique, un système d'administration qui peut administrer les deux médicaments et les libérer de manière différente dans le temps est essentiel en raison de la différence entre les propriétés pharmacocinétiques (PK) du médicaments et la difficulté de cibler les mêmes cellules cancéreuses dans un ordre temporel approprié [13,14,15,16].

Un système d'administration nanoliposomal est l'un des systèmes d'administration à double médicament qui peuvent être appliqués à une thérapie combinée. Les principaux composants des liposomes sont en général des phospholipides similaires à ceux des membranes cellulaires. Les phospholipides forment une sphère concentrique bicouche avec un compartiment interne et des membranes bicouches [17]. Les nanoliposomes peuvent permettre aux médicaments ayant des propriétés physico-chimiques différentes d'être chargés dans le compartiment interne et la membrane bicouche des liposomes, puis délivrés à la lésion. Ainsi, l'effet synergique in vivo des deux médicaments administrés à l'aide du système nanoliposomal peut être obtenu grâce à une colocalisation améliorée des médicaments sur les cellules cancéreuses non seulement par la réconciliation des propriétés PK de chaque médicament, mais également par la perméabilité et la rétention améliorées ( EPR) effet du tissu tumoral. Outre l'encapsulation des médicaments dans le compartiment interne, le nanoliposome peut solubiliser les médicaments hydrophobes, améliorer leur stabilité, moduler leurs propriétés de circulation sanguine et donc induire leur accumulation dans les tissus tumoraux [18].

Malgré les études récentes sur les systèmes d'administration de chimiothérapie combinée à base de nanoliposomes, les processus de préparation des systèmes doivent être optimisés pour une fabrication fiable et reproductible, et leurs caractéristiques physico-chimiques doivent être élucidées pour le développement de systèmes plus avancés [13, 19]. Dans notre étude, un système de délivrance nanoliposomal co-encapsulé avec de l'elrotinib (ERL ; ERL free base, log_P = 3,3) et la doxorubicine (DOX ; DOX HCl, log_P = 1,27) dans une seule vésicule de liposomes a été préparé en tant que système de nanoliposomes modèle selon un rapport précédent, à l'exception d'une formulation de liposomes dite non pégylée [13], et les caractéristiques physico-chimiques du système ont été étudiées. Des études de libération de médicaments in vitro ont été menées pour étudier une libération différentielle dans le temps des médicaments. Parmi plusieurs méthodes telles que l'extrusion, la sonication et l'homogénéisation à haute pression [20,21,22], la sonication à l'aide d'un sonicateur à sonde a été utilisée pour réduire le diamètre des liposomes en raison de sa capacité de traitement plus efficace. Une étude comparative sur les effets des technologies de chargement de médicament telles que la méthode de gradient de pH ou de sulfate d'ammonium sur l'efficacité d'encapsulation (EE) du médicament a été réalisée pour optimiser l'encapsulation du médicament. De plus, le procédé le plus efficace pour l'encapsulation du médicament a été déterminé en étudiant les effets des conditions du procédé sur l'EE du médicament. Les conditions de préparation du système d'administration de médicaments à double nanoliposomes encapsulé avec ERL et DOX et libérant les médicaments dans un ordre approprié ont été optimisées. Les méthodes de préparation optimisées et les caractéristiques du système d'administration de double médicament suggèrent une plate-forme de processus de préparation fiables et reproductibles et un système d'administration plus avancé pour les études translationnelles.

Méthodes

Matériaux

1,2-Distearoyl-sn -glycéro-3-phosphocholine (DSPC) et 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn -glycéro-3-phospho-(1′-rac -glycerol) (sel de sodium) (POPG) ont été fournis par Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, Al, USA). Le cholestérol provenait de Sigma-Aldrich, Corp. (St. Louis, MO, USA). Le chlorhydrate de doxorubicine (DOX) et la base libre d'erlotinib (ERL) ont été achetés respectivement auprès de Boryung Co., Ltd. (Séoul, Corée) et de Shanghai Send Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Le sulfate d'ammonium (AS) et l'acide citrique (CA) anhydre ont été fournis par Daejung Chemicals &Metals Co., Ltd. (Siheung-si, Corée). Tous les autres réactifs étaient de qualité réactif et fournis par Sigma-Aldrich, Corp. (St. Louis, MO, USA).

Préparation de nanoliposomes encapsulés à double médicament

Les processus généraux de préparation des nanoliposomes encapsulés avec ERL et DOX sont représentés sur la figure 1. En bref, les liposomes encapsulés dans ERL ont été préparés à l'aide de la méthode dite d'hydratation par film lipidique mince [23]. L'ERL a été ajouté au mélange lipidique formant le film lipidique mince afin d'encapsuler le médicament dans la membrane bicouche lipidique des liposomes. Le diamètre du liposome a été réduit par ultrasonication avec un sonicateur à sonde (Vibra Cell; Sonics &Materials, Inc., Newtown, CT, USA). La DOX a été encapsulée dans le compartiment aqueux interne de nanoliposomes encapsulés par ERL en utilisant un gradient de concentration d'ions transmembranaire des nanoliposomes. Les méthodes expérimentales et analytiques détaillées du processus sont suggérées dans les sections suivantes.

Procédés de préparation et de caractérisation de nanoliposomes encapsulés par deux médicaments

Liposomes encapsulés par ERL

Un mélange lipidique composé de DSPC, de cholestérol et de POPG dans un rapport de 27:20:3 (w /w /w ) a été mélangé avec une base libre ERL à un rapport pondéral du médicament au lipide total, 3:50. Ces mélanges ont été dissous dans 9 mL d'un solvant mixte chloroforme:méthanol = 2:1 (v /v ). La solution lipidique a été placée dans un ballon à fond rond, et pour former une membrane lipidique, le solvant a été éliminé à l'aide d'un évaporateur rotatif (Rotavapor R-210; BÜCHI Labortechnik AG, Flawil, Suisse) sous vide à 40°C. La membrane a été séchée sous vide pendant une nuit pour éliminer tout le solvant résiduel. Dans ces processus, les molécules ERL sont insérées dans la membrane lipidique via des attractions hydrophobes, puis encapsulées spontanément dans la membrane lipidique bicouche des liposomes, qui sont formés par le processus d'hydratation suivant.

Afin d'hydrater la membrane lipidique contenant l'ERL, 8 mL de 250-400 mM de tampon d'acide citrique ou 300 mM d'acide citrique (pH 3,9) ont été ajoutés à la membrane formée à la surface interne du ballon à fond rond. Après incubation de la membrane à 65 °C pendant 30 min par rotation du ballon, la suspension de liposomes a été soniquée à l'aide d'un sonicateur à bain (Branson 3510E-DTH ; Branson, Danbury, CT, USA). Pour réduire le diamètre des liposomes, la suspension de liposomes a été soniquée à l'aide du sonicateur à sonde dans des conditions telles qu'une impulsion de 5 s activée et 2 s désactivée, une amplitude de 20 % et une énergie de 36 J par impulsion dans un bain d'eau glacée , soit au bain-marie sous agitation magnétique. Pour éliminer l'AS qui a été déchargée dans les nanoliposomes, la dialyse des nanoliposomes a été effectuée pendant la nuit dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) avec une membrane de cellulose de tube de dialyse (seuil de poids moléculaire 14 000 (MWCO) ; Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Missouri, États-Unis). Dans le cas d'une suspension de nanoliposomes préparée à l'aide du tampon acide citrique, le pH de la solution a été ajusté à environ 6,5 à l'aide d'un tampon bicarbonate de sodium 300 mM pour créer un gradient entre l'intérieur et l'extérieur des nanoliposomes.

DOX-Loading into ERL-Encapsulated Nanoliposomes

Pour encapsuler la DOX dans des nanoliposomes encapsulés dans l'ERL, le chlorhydrate de DOX a d'abord été dissous dans une solution aqueuse de NaCl à 0,9 % à 65 °C. En général, 2 mL de solution de DOX à 1,5 mg/mL ont été ajoutés à 8 mL de suspension de nanoliposomes encapsulés dans l'AS et l'ERL ou dans l'acide citrique et l'ERL. Les processus de chargement de médicament de la suspension de nanoliposomes ajoutés au DOX étaient composés d'une incubation, d'une sonication à l'aide du sonicateur de bain, d'un équilibrage à température ambiante (RT) et d'une dialyse contre du PBS (pH 7.4) à l'aide de la membrane de cellulose du tube de dialyse pour éliminer le DOX non encapsulé du suspension de nanoliposomes. Les effets des conditions de charge de DOX sur l'EE de DOX ont été étudiés à l'aide de quatre groupes expérimentaux. Le groupe 1 était le mélange de solution DOX et de liposomes, qui a été traité dans la séquence d'une incubation à 65 °C pendant 30 min, d'une sonication à 65 °C pendant 5 min et d'une dialyse pendant une nuit. Le groupe 2 a été incubé à 65 °C pendant 30 min, soniqué à 65 °C pendant 5 min, équilibré pendant 30 min à température ambiante, puis dialysé pendant la nuit. Le groupe 3 a été incubé à 65 °C pendant 30 min, soniqué à 65 °C pendant 15 min, puis dialysé pendant la nuit. Le groupe 4 a été incubé à 65 °C pendant 30 min, soniqué à 65 °C pendant 15 min, équilibré pendant 30 min à température ambiante, puis dialysé pendant la nuit.

Diamètre, morphologie et stabilité physique des nanoliposomes encapsulés à double médicament

Le diamètre des nanoliposomes encapsulés dans le médicament a été mesuré à 25 °C à l'aide d'un analyseur de taille de particules (ELS-Z ; Otsuka Electonics Co., Ltd., Osaka, Japon). La morphologie et le diamètre moyen des nanoliposomes encapsulés par un médicament simple ou double ont été observés à l'aide d'un microscope électronique à transmission à émission de champ (FE-TEM) (JEM 2100F ; JEOL Ltd., Tokyo, Japon, installé au Korea Basic Science Institute) à 200 kV. Afin de préparer l'échantillon, la suspension de nanoliposomes a été coulée sur une grille de cuivre recouverte de carbone, et la grille a été séchée à l'air à température ambiante avant d'être vue au microscope. La stabilité physique des doubles nanoliposomes encapsulés dans du PBS (pH 7.4) à différentes températures de 4, 25 et 37 °C a été étudiée en surveillant l'évolution du diamètre des liposomes en fonction du temps. Le diamètre des liposomes a été mesuré à l'aide d'un analyseur granulométrique (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Limited, Worcestershire, Royaume-Uni).

EE des drogues

L'efficacité d'encapsulation (EE) de la DOX ou de l'ERL dans les nanoliposomes à double médicament encapsulé a été déterminée par l'équation suivante. (1).

où C _f est la quantité d'ERL ou de DOX encapsulée dans les nanoliposomes mesurée après destruction des nanoliposomes avec 10 % de Triton-X 100 pour une libération complète d'ERL ou de DOX de ceux-ci. L'absorbance de l'ERL a été mesurée à l'aide d'un spectromètre UV-Vis (spectrophotomètre DU-800 ; Backman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA) à 345 nm et l'intensité de fluorescence de la DOX a été utilisée à l'aide d'un spectrofluoromètre (SFM-25 ; Tegimenta AG, Rotkreuz , Suisse) à 495 et 590 nm de longueurs d'onde d'excitation et d'émission, respectivement. La quantité d'ERL ou de DOX a été calculée en utilisant la courbe d'étalonnage d'ERL ou de DOX préparée à l'avance. C _i est la quantité d'ERL ou de DOX ajoutée au mélange lipidique ou aux nanoliposomes encapsulés dans l'ERL. Les quantités ont été déterminées en mesurant l'absorbance ou l'intensité de fluorescence de chaque médicament aux longueurs d'onde correspondantes.

Libération de drogue

Une cassette de dialyse (10 000 MWCO, Slide-A-Lyser Dialysis Cassette G2; Thermo Scientific Corp., Rockford, IL, USA) a été remplie de la suspension de nanoliposomes encapsulés avec à la fois DOX et ERL. La cassette a été placée dans du PBS (pH 7,4) et les milieux de test de libération ont été agités en continu à 37 °C. À des moments prédéterminés, des aliquotes de l'échantillon ont été prélevées de la cassette pour déterminer la concentration de chaque médicament, puis la libération de médicament a été calculée par l'intermédiaire de l'équation suivante. (2).

où D _t est la concentration de DOX ou ERL restant dans les nanoliposomes à un moment donné pendant la période de test de libération et D _i est la concentration de DOX ou ERL encapsulée dans les nanoliposomes avant l'expérience de libération du médicament. La concentration de DOX a été déterminée en mesurant l'intensité de fluorescence de l'échantillon avec le spectromètre à fluorescence à 495 et 590 nm de longueurs d'onde d'excitation et d'émission, respectivement. La concentration ERL a été déterminée en mesurant l'absorbance de l'échantillon à 345 nm avec le spectromètre UV-Visible.

Analyse statistique

Les résultats sont présentés sous forme de moyenne  ± SEM, sauf indication contraire.

Résultats et discussion

Effet des processus de préparation sur les caractéristiques des nanoliposomes

Des nanoliposomes encapsulés par un médicament double ont été préparés en encapsulant l'ERL dans la membrane bicouche lipidique et la DOX dans le compartiment interne des nanoliposomes. Les liposomes encapsulés avec le ERL uniquement ont été préparés en hydratant la membrane lipidique incorporée dans le ERL avec une solution aqueuse d'AS. Au cours de ces processus, les molécules ERL sont incorporées dans la membrane lipidique via des attractions hydrophobes puis encapsulées spontanément dans la membrane lipidique bicouche des liposomes. Après l'hydratation, la suspension de liposomes a été ultrasonique à l'aide du sonicateur à sonde de type cornet pour réduire le diamètre des liposomes. Pour étudier les effets des ultrasons et des méthodes de refroidissement sur le diamètre des liposomes, les liposomes ont été traités avec une augmentation du temps de sonication dans différentes conditions de refroidissement et les résultats sont présentés sur la figure 2. La figure 2a représente l'effet du temps de sonication sur le diamètre et indice de polydispersité (PDI) des liposomes traités dans les conditions de refroidissement d'un bain d'eau glacée. Le diamètre des liposomes encapsulés dans l'ERL non traités par l'ultrasonication était de 759 ± 44 nm. Cependant, jusqu'à 10 min d'ultrasonication, le diamètre des liposomes a diminué de manière remarquable à 222  ± 40 nm, et après 10 min, il n'y avait pas de changement significatif du diamètre à mesure que le temps d'ultrasonication augmentait. Ces résultats indiquent que les liposomes encapsulés par ERL formés par l'hydratation sont pour la plupart des vésicules multilamellaires (MLV). La haute énergie délivrée aux liposomes de type MLV via l'ultrasonication exfolie la multicouche de MLV et désassemble les gros liposomes. En solution aqueuse, les lipides séparés des MLV sont auto-assemblés grâce à des attractions hydrophobes et ainsi transformés en grandes vésicules unilamellaires (LUV) - ou en petits nanoliposomes de type UV (SUV). Au fur et à mesure que ces phénomènes se répètent, le diamètre moyen des nanoliposomes diminue progressivement [24,25,26]. Comme le montre la figure 2a, le diamètre des liposomes a été remarquablement réduit au cours d'une courte période d'ultrasons. On pense qu'au cours de cette période, la plupart des liposomes de type MLV ont été convertis en liposomes de type LUV ou SUV [27]. L'ultrasonication de plus de 10 min a provoqué une légère diminution du diamètre des liposomes, indiquant une moindre transformation du type de vésicule avec le temps d'ultrasonication. Le PDI du diamètre des liposomes a diminué avec une augmentation du temps d'ultrasonication, suggérant que le diamètre des liposomes est devenu uniforme avec le temps malgré une légère augmentation du PDI après 20 min. La figure 2b représente l'effet du temps d'ultrasonication sur le diamètre et le PDI des liposomes traités dans les conditions de refroidissement d'un bain-marie. Le diamètre des liposomes non traités par l'ultrasonication était de 1433 ± 143 nm. Le diamètre du liposome a diminué de manière significative à 337 ± 67 nm jusqu'à 5 min d'ultrasonication, et après 5 min, il y avait une diminution progressive du diamètre jusqu'à 15 min, suivie d'un petit changement dans le diamètre. Le PDI du diamètre des liposomes variait avec le temps d'échographie jusqu'à 15 min et atteignait un plateau par la suite. Dans les conditions de bain d'eau, le temps passé pour réduire le diamètre des liposomes à moins de 30 % du diamètre des liposomes non traités était plus court que le temps passé dans les conditions de bain d'eau glacée. On pense que la réduction du diamètre des liposomes a été réalisée par transfert de l'énergie thermique générée par l'ultrasonication aux liposomes de type MLV. Par rapport à la condition de bain d'eau glacée, la température de la suspension de liposomes soniquée dans les conditions de bain d'eau a été trop élevée, ce qui implique que la chaleur de la suspension de liposomes qui a eu lieu en raison d'un chauffage en vrac par cavitation ultrasonore était moins efficacement libérée. Pour protéger la suspension de liposomes des effets secondaires tels qu'une évaporation moyenne et une éventuelle détérioration des molécules lipidiques induite par une surchauffe, le bain d'eau glacée a été choisi comme condition de refroidissement pour l'ultrasonication. D'autre part, les liposomes soumis aux ultrasons ont été dialysés pour éliminer l'AS non encapsulé. Les nanoliposomes encapsulés par ERL et AS préparés à l'aide de l'ultrasonication et de la dialyse avaient environ 140 nm du diamètre moyen des nanoliposomes, suggérant une légère diminution du diamètre des nanoliposomes à travers la dialyse. Les nanoliposomes encapsulés par ERL et AS ont été utilisés pour l'encapsulation DOX dans le compartiment interne des nanoliposomes à l'aide de la méthode du gradient AS.

Effets du temps de sonication de la sonde sur le diamètre et l'indice de polydispersité des nanoliposomes encapsulés dans l'ERL :un bain d'eau glacée (a ) ou un bain-marie (b ) refroidissement de la suspension de liposomes dans un récipient pendant l'ultrasonication (n = 3, les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM)

La figure 3 montre le diamètre des nanoliposomes encapsulés par DOX et ERL en fonction du temps d'ultrasonication à l'aide d'un sonicateur à bain pendant un processus de chargement de DOX. Les faibles variations du diamètre étaient similaires à celles après 10 min d'ultrasonication de nanoliposomes encapsulés dans l'ERL, comme le montre la figure 2a. Malgré l'augmentation du temps d'ultrasonication, le diamètre des nanoliposomes n'a pas changé de manière significative jusqu'à 45 min d'ultrasonication. Ces résultats peuvent être attribués au fait que les nanoliposomes encapsulés par DOX et ERL sont des LUV ou des SUV [27]. Pendant ce temps, lorsque le temps d'ultrasonication était supérieur à 45 min, l'augmentation du SEM du diamètre moyen des nanoliposomes s'est produite, indiquant une augmentation des différences entre les échantillons de liposomes. Le PDI du diamètre diminuait à mesure que le temps d'échographie augmentait. Ces résultats suggèrent que l'uniformité du diamètre des liposomes augmente avec le temps d'ultrasonication malgré une légère augmentation du PDI après 60 min d'ultrasonication. En bref, le changement de diamètre des nanoliposomes par ultrasonication était le plus élevé au stade de la transformation où les liposomes seraient convertis de MLV en LUV ou SUV. Par conséquent, l'ultrasonication pour la réduction du diamètre des liposomes était la plus efficace lorsque le traitement était effectué entre l'hydratation de la membrane lipidique et l'encapsulation DOX dans le compartiment interne des nanoliposomes encapsulés par ERL pendant une durée relativement courte.

Effets du temps de sonication du bain sur le diamètre et l'indice de polydispersité des nanoliposomes encapsulés par DOX et ERL (n = 3, les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM)

Effet de la méthode de chargement de médicament sur l'EE

Les nanoliposomes encapsulés par un médicament double ont été préparés à l'aide d'un chargement de DOX dans des nanoliposomes encapsulés par ERL avec environ 30 % EE d'ERL et 140 nm du diamètre du nanoliposome. La quantité de DOX ou ERL encapsulée dans les liposomes a été mesurée après destruction des liposomes avec un tensioactif pour une libération complète des médicaments des liposomes. L'intensité de fluorescence de la DOX et l'absorbance de l'ERL ont été mesurées respectivement par spectrofluorométrie et spectrométrie UV-Vis. Pour étudier les effets des méthodes de chargement de DOX sur l'EE de DOX dans des nanoliposomes encapsulés par ERL et DOX, une méthode de chargement active telle que la méthode de gradient de pH ou de gradient AS a été utilisée pour l'encapsulation de DOX dans les liposomes. La différence d'EE entre les deux méthodes de chargement de médicament a été étudiée et les résultats sont présentés à la figure 4. Les EE de DOX en utilisant la méthode du gradient AS étaient de 90 % ou plus, et l'EE en utilisant le gradient de pH était d'environ 17 %, indiquant que la méthode à gradient AS était bien plus efficace dans l'encapsulation DOX que la méthode à gradient de pH [28].

Efficacité d'encapsulation de la DOX dans les nanoliposomes encapsulés par deux médicaments selon les méthodes de chargement de la DOX et les concentrations en sulfate d'ammonium (AS) :acide citrique CA (n = 3, les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM)

Lorsque les changements dans les EE de DOX en fonction des concentrations d'AS ont été comparés, l'EE était le plus élevé et le SEM de l'EE était le plus bas à 350 mM d'AS. La méthode du gradient AS ou du gradient de pH utilise un mécanisme de translocation de médicament, qui induit les médicaments à l'extérieur des nanoliposomes à migrer dans le compartiment interne des nanoliposomes en raison d'une force motrice générée à partir d'un gradient de concentration d'ions transmembranaire des nanoliposomes [29, 30]. L'EE de la DOX par la méthode du gradient AS était cependant bien supérieure à celle de la méthode du gradient du pH. Ces résultats peuvent être attribués au fait que la méthode à gradient AS est plus efficace pour développer des complexes cristallins que la méthode à gradient de pH en raison de la cristallisabilité plus élevée entre la DOX ionisée et les contre-ions à l'intérieur des nanoliposomes [31, 32].

Effet des conditions de chargement de médicament sur l'EE

Pour étudier l'effet des conditions de traitement pour un mélange de solution de DOX et de nanoliposomes encapsulés dans l'ERL sur l'EE de DOX pendant le processus de chargement de DOX, quatre groupes expérimentaux illustrés à la figure 5a ont été conçus et expérimentés en fonction des différentes conditions de traitement. Le groupe 1 était le mélange traité dans la séquence d'une incubation, d'une sonication et d'une dialyse pendant une nuit. Dans le groupe 2, pour étudier l'effet d'un équilibrage du mélange soniqué sur l'EE, le mélange a été incubé, soniqué, équilibré pendant 30 min à température ambiante, puis dialysé pendant la nuit. En tant que groupe pour étudier l'effet d'une sonication à long terme sur l'EE, le groupe 3 était le mélange incubé, soniqué à 65 °C pendant 15 min, puis dialysé pendant la nuit. De plus, en tant que groupe pour étudier les effets d'une sonication à long terme et d'un équilibrage sur l'EE, le groupe 4 était le mélange incubé, soniqué à 65 °C pendant 15 min, équilibré pendant 30 min à température ambiante, puis dialysé pendant la nuit. Dans tous les groupes, le chargement DOX a été effectué en utilisant la méthode AS-gradient. Comme le montre la figure 5b, les EE de DOX des groupes 1, 2, 3 et 4 étaient de 93 ± 7,8, 98 ± 2,5, 83 ± 4,9 et 59 ± 4,2 %, respectivement. Par rapport à l'EE du groupe 3, l'EE du groupe 1 était plus élevée, indiquant qu'une durée plus courte de sonication du bain est un traitement plus efficace pour augmenter l'EE dans les nanoliposomes. Par rapport à l'EE du groupe 1, le groupe 2 avait une EE de DOX plus élevée. L'EE du groupe 4 était la plus faible parmi tous les groupes expérimentés. Contrairement à l'amélioration de l'EE par l'équilibration après une sonication à court terme appliquée au groupe 2, l'équilibration après une sonication à long terme appliquée au groupe 4 n'a pas été efficace pour l'amélioration de l'EE. Ces résultats peuvent être dus à la quantité excessive d'énergie délivrée à la suspension, qui pourrait perturber les nanoliposomes lors de la sonication du bain décrite ci-dessus. En outre, on pense que par sonication de bain à long terme dans les groupes 3 et 4, l'EE a été abaissée en raison d'une diminution de la teneur en AS dans les nanoliposomes. Étant donné que la température de la suspension de nanoliposomes a augmenté bien au-delà de la température de transition de phase (T _c ) par la sonication en bain à long terme, la fluidité de la bicouche lipidique a augmenté et a donc induit la libération d'AS des liposomes. Les échantillons de nanoliposomes du groupe 3 ont été dialysés immédiatement après la sonication du bain, suggérant un refroidissement rapide des échantillons. En revanche, les échantillons de nanoliposomes du groupe 4 ont été traités par la sonication en bain à long terme suivie de l'équilibrage, ce qui pourrait soutenir la libération d'AS, augmenter la formation de complexe DOX-sulfate à l'extérieur des liposomes et donc abaisser l'EE. Bien que l'équilibrage après la sonication à long terme n'ait pas été efficace, ces résultats suggèrent que le processus de chargement de DOX tel qu'un traitement séquentiel du mélange de la solution de DOX et des nanoliposomes encapsulés dans l'ERL - une incubation au-dessus de T _c de phospholipide, un bain sonication, une équilibration en dessous du T _c , par exemple, à la température ambiante et une dialyse pendant la nuit - est une méthode plus efficace pour augmenter l'EE que d'autres processus sans traitement d'équilibration [33,34,35].

Efficacité d'encapsulation de la DOX dans des nanoliposomes encapsulés à double médicament selon diverses conditions de chargement de médicament :conditions de chargement de médicament pour chaque groupe expérimental (a ) et l'efficacité d'encapsulation des médicaments des groupes expérimentaux (b ) (n = 3, les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM)

Morphologie et stabilité physique des nanoliposomes encapsulés à double médicament

La figure 6 montre la morphologie des nanoliposomes observés par MET. Les échantillons pour l'observation MET ont été préparés par coulée goutte des nanoliposomes co-encapsulés ERL et DOX sur une grille de cuivre recouverte de carbone et séchage à l'air à température ambiante. Afin de comparer les caractéristiques des liposomes encapsulés par un médicament double avec les liposomes encapsulés par un médicament unique, la morphologie des nanoliposomes encapsulés par ERL ou encapsulés par DOX a été observée par MET. Comme le montre la figure 6a, le diamètre des nanoliposomes encapsulés par un médicament double était inférieur à 200 nm et la forme était presque sphérique. Le diamètre des liposomes observé par analyse MET coïncide avec la valeur mesurée à l'aide d'un analyseur granulométrique utilisant la diffusion dynamique de la lumière. La figure 6b montre l'image d'un seul nanoliposome contenant des complexes DOX-sulfate à l'intérieur du liposome. Les complexes ont été supposés être les cristaux formés par attraction entre les cations DOX protonés et les anions sulfate divalents [36]. La figure 6c montre une image MET à haute résolution (HR-), qui montrait les cristaux de médicament dans la région la plus externe du nanoliposome présent sur la figure 6b. L'image a révélé qu'un réseau hautement cristallin dans le compartiment interne du nanoliposome et un domaine moins cristallin ont un domaine amorphe proche du carbone sur la grille [37]. Le domaine amorphe dans la région la plus externe du nanoliposome peut être dû à l'instabilité de la bicouche lipidique lors de l'exposition au faisceau d'électrons à haute énergie. Le motif de diffraction électronique à zone sélectionnée (SAED) présent sur la figure 6d présentait une régularité de points de diffraction brillants, indiquant que les cristaux montrés sur la figure 6c ont un réseau cristallin hautement ordonné [38]. To compare the TEM analysis results of the dual drug-encapsulated nanoliposomes with those of the single drug-encapsulated nanoliposomes, the ERL-encapsulated nanoliposome was observed by TEM and the image is shown in Fig. 6e. The outermost region of the nanoliposome present in Fig. 6e was observed by HR-TEM, and the result is shown in Fig. 6f. From the result, it was found that the outermost region was composed of a number of small crystals and amorphous domains adjacent to the carbon on the grid. Figure 6g shows a SAED pattern of the crystals shown in Fig. 6f. The SAED pattern exhibited a ring made up of small spots arising from the individual crystals. Therefore, it is considered that the ERL intercalated between the lipid bilayer are present as small crystals with less ordered orientation [39]. On the other hand, as the other comparison, TEM analysis of the DOX-encapsulated nanoliposomes was carried out and the result is shown in Fig. 6h. The morphology and the diameter of the nanoliposome observed by TEM were similar to those of the dual drug-encapsulated nanoliposome. The HR-TEM image shown in Fig. 6i confirmed the crystalline lattice of the DOX-sulfate formed inside of the DOX-encapsulated liposome. The SAED pattern shown in Fig. 6j suggest that the crystals inside the liposome have a highly ordered crystalline lattice. These results verify that the diffractions of the ERL- and DOX-encapsulated nanoliposome by the electron beam were originated predominantly not by the ERL crystals in the lipid bilayer but by the DOX-sulfate crystals inside the nanoliposome. In summary, the morphology of the dual drug-encapsulated nanoliposomes and the crystals of each drug formed in the liposomes were identified by TEM, HR-TEM, and SAED analyses [40].

Transmission electron microscopy (TEM) and selected area electron diffraction (SAED) analyses of dual drug- or single drug-encapsulated nanoliposomes:ERL- and DOX-encapsulated nanoliposomes (scale bar, 200 nm) (a ), a single nanoliposome containing ERL and DOX-sulfate complexes (scale bar, 50 nm) (b ), a high resolution- (HR-) TEM image representing DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome and ERL crystals in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (c ), a SAED pattern of DOX-sulfate crystals and ERL crystals present in a nanoliposome (d ), a single nanoliposome encapsulated with ERL (scale bar, 50 nm) (e ), a HR-TEM image representing small crystals of ERL and amorphous domains in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (f ), a SAED pattern of ERL crystals present in an outermost region of the nanoliposome (g ), a single nanoliposome encapsulated with DOX (scale bar, 100 nm) (h ), a HR-TEM image representing crystalline lattices of DOX-sulfate inside the nanoliposome (sale bar, 5 nm) (i ), and a SAED pattern of DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome (j )

As a result of a physical stability study on the dual drug-encapsulated nanoliposomes, Fig. 7 shows the percent change in diameter of the nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at 4, 25, and 37 °C, respectively, as a function of the time. When incubated at 4 °C, in comparison with the initial diameter at day 0, the diameter of the nanoliposomes increased by 14.8% on day 5 and varied thereafter in a smaller extent of change in the diameter. The overall change of the diameter, however, was in a range of ± 15.0% during the stability test period. At 25 °C, the diameter of the nanoliposomes increased by 10.9% on day 5 and then decreased − 8.0% on day 19, indicating that the overall change was in a range of ± 10.0% during the test period. In addition, at 37 °C, the overall change in the diameter of the nanoliposomes was in a range of ± 6.0% during the test period, showing the smallest degree of change compared with the other test conditions. Based on the fact that in all three conditions tested, there was no significant change in the diameter of the nanoliposome, it is considered that the nanoliposomes prepared in our study have the physical stability in PBS (pH 7.4) for at least 3 weeks without aggregation or flocculation, which can affect therapeutic efficacy, targeting, and toxicity of the drug(s) encapsulated in the nanoliposomes. It has been acknowledged that the two important factors determining physical stability of nanoliposomes are T _c of phospholipid(s) and a content of cholesterol constituting the nanoliposomes [41]. The high stability of the nanoliposomes at 37 °C may be due to the low probability of phase transition of the phospholipid bilayer made up of DSPC, which has a high T _c and is utilized in general as a main lipid component in various liposome formulations. Also, a high composition ratio such as 40 wt% of cholesterol in the nanoliposomes seems to contribute to enhance the physical stability of the nanoliposomes [42]. On the other hand, nonetheless a low T _c (− 2 °C) of POPG having a double bond in its one acyl chain, a very low composition ratio such as 3 wt% of POPG had little effect on the stability of the nanoliposomes.

Stability of dual drug-encapsulated nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at different temperatures of 4, 25, and 37 °C, respectively:percent change in nanoliposome diameter relative to initial diameter as a function of incubation time

Time-Differential Drug Release

There are a number of systems that can carry two kinds of drugs with different physicochemical properties on one vehicle. The representative examples are a micelle system containing the two drugs in the same compartment of the system, a polymer matrix system composed of different compartments containing each drug, and a liposome or a polymersome system containing each drug in the core and shell of the system, respectively [43,44,45,46]. In particular, when sequential actions of the two drugs are essential to cause a synergistic effect of the drugs, the time-differential release of each drug from the dual drug-encapsulated carrier is highly important. The in vitro time-differential release of DOX and ERL from the dual drug-encapsulated nanoliposomes was investigated, and the results are shown in Fig. 8. The releases of DOX and ERL from the nanoliposomes were monitored against a test medium, PBS (pH 7.4), under continuous stirring. The released amount of DOX or ERL after designated release test period was calculated measuring the fluorescence intensity of DOX and the absorbance of ERL with the fluorescence spectrometer and the UV-Vis spectrometer, respectively.

In vitro release profiles of ERL and DOX from dual drug-encapsulated nanoliposomes:time-differential release (a ) and release rates of ERL and DOX (b ) (n  = 3, the data are presented as mean ± SEM)

As shown in Fig. 8, the ERL release was 36 ± 0.01%, while the DOX release was less than 10% until 8 h of the release test period. In particular, during this period, the release rate of ERL was much faster than that of DOX. By 48 h, 65 ± 0.07% of ERL were released from the nanoliposomes in contrast to 30 ± 0.01% release of the DOX. The release rates of ERL and DOX are shown in Fig. 8b. Until 8 h, the release rate of ERL was more than 4% per hour in contrast to less than 1% per hour of the DOX release rate. After 8 h, the release rate of ERL was slowed down. Compared with the release of ERL, DOX showed a slow release and had an almost zero-order release rate. These results suggest that during the initial period of release test, much more amounts of ERL were released from the liposomes than those of DOX and there was a time-differential release between ERL and DOX. The sequential release of the drugs was thought to be originated from the difference between the physicochemical states of each drug in the liposomes [28, 32, 47]. These results on the dual drug-encapsulated nanoliposome system can contribute to translation of in vitro synergistic effects of two kinds of drugs into the clinic through overcoming both the difference between PK properties of each drug and the difficulty in targeting the same cancer cells in proper temporal sequence.

Conclusions

As a dual drug delivery system, a nanoliposomal delivery system encapsulating both ERL and DOX was prepared and characterized. The liposome diameter was controllable by ultrasonication, and the sonication for diameter reduction was effective when carried out after the film-hydration and before DOX encapsulation. The nanoliposome diameter decreased remarkably during an initial period of ultrasonication. DOX was loaded into ERL-encapsulated nanoliposomes through pH- or AS-gradient method. AS-gradient method showed higher EE of DOX than pH-gradient, and the AS concentration for higher EE of DOX was determined. Equilibration of a mixture of DOX solution and ERL-encapsulated nanoliposomes in DOX-loading process was advantageous for EE increase of DOX. By HR-TEM and SAED analyses of the dual drug-encapsulated nanoliposomes, not only the highly oriented crystals formed between protonated DOX cations and divalent sulfate anions inside the liposome but also the less oriented small crystals of ERL in the outermost layer of the nanoliposome were identified. ERL and DOX co-encapsulated in the nanoliposomes showed a time-differential release, indicating much faster release of ERL than that of DOX from the liposomes. The elucidated preparation methods of the nanoliposomal dual drug delivery system can contribute to development of advanced dual drug delivery systems and translational researches of the combination therapies exhibiting synergistic effects via sequential actions of the drugs.

Abréviations

DOX:

Doxorubicine

DSPC:

1,2-Distearoyl-sn -glycero-3-phosphocholine

EE:

Encapsulation efficiency

EPR :

Enhanced permeability and retention

ERL:

Erlotinib

PK:

Pharmacokinetic

POPG:

1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn -glycero-3-phospho-(1′-rac -glycerol) (sodium salt)

SAED:

Diffraction électronique à zone sélectionnée

SEM :

Standard error of mean

T _c :

Phase-transition temperature

TEM :

Microscopie électronique à transmission