Nanosphères de silice creuses encapsulées dans de la peroxydase de raifort pour la détection intracellulaire d'espèces réactives de l'oxygène

Contexte

Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) constituées de molécules radicalaires et non radicalaires, telles que les anions superoxyde, le peroxyde d'hydrogène, le radical hydroxyle, l'oxygène singulet et le peroxynitrite, sont produites en continu au cours du métabolisme aérobie. Les ROS cellulaires sont principalement générés à partir de la chaîne de transport d'électrons mitochondriale (mETC) et sont normalement contrebalancés par des enzymes (comme les superoxydes dismutases, les catalases et les peroxydases) et non enzymatiques (par exemple, les vitamines A, C et E ; l'urate ; et la bilirubine ) défenses antioxydantes [1]. Cependant, des déséquilibres dans la production de ROS peuvent entraîner un stress oxydatif et des dommages ultérieurs à l'ADN, aux acides gras, aux protéines et à d'autres composants cellulaires, contribuant potentiellement au diabète [2], au cancer [3], aux troubles cardiovasculaires [4] et aux troubles neurodégénératifs. [5] comme la maladie d'Alzheimer et la maladie de Parkinson. L'imagerie directe et la quantification des ROS dans les cellules vivantes sont hautement souhaitables mais très difficiles.

Les progrès de la microscopie à fluorescence [6, 7] ont permis le développement de la mesure et de l'imagerie non invasives de l'évolution des ROS au niveau unicellulaire. Pour détecter les ROS, la plupart des sondes sont conçues pour mesurer les changements d'intensité de fluorescence ou les changements de longueur d'onde d'émission (c'est-à-dire les méthodes ratiométriques) suite à l'oxydation de molécules aromatiques profluorescentes ou à la déprotection de composés masqués en produits fluorescents [8]. La spécificité à un type particulier de ROS est importante lors de la conception de sondes réussies ; par exemple, l'oxydation du boronate est utilisée comme approche de réaction bioorthogonale pour étudier la chimie du peroxyde d'hydrogène dans les systèmes vivants [9]. Pour explorer la dynamique spatio-temporelle des ROS, plusieurs sondes à base de boronate conjuguées à une fraction phosphonium chargée positivement ont été générées pour le ciblage mitochondrial [10, 11]. Cependant, leur potentiel pour l'imagerie in vivo est limité par leur instabilité dans le milieu biologique, leur faible pénétration des barrières tissulaires et leur élimination rapide de l'organisme par le système urinaire [12,13,14]. Pour surmonter de tels problèmes, certaines stratégies ont été développées soit en greffant chimiquement une structure stabilisatrice supplémentaire sur la sonde [15] (par exemple, une chaîne de triéthylène glycol), en développant des indicateurs génétiquement codés à base de protéines fluorescentes [16], ou en appliquant une réaction basée sur reporters bioluminescents [17] ou sondes de tomographie par émission de positons (TEP) pour l'imagerie moléculaire des ROS [18]. De plus, plusieurs études approfondies ont mis en évidence les nano-formulations comme une considération de conception importante et ont démontré que les sondes à base de nanoparticules peuvent fournir des informations mécaniques et des stratégies innovantes pour imager les ROS dans les organismes vivants avec une spécificité et une sensibilité élevées [19,20,21,22]. Des enzymes avec une activité catalytique élevée et une sélectivité de substrat distincte ont également été utilisées comme outils de diagnostic clinique pour identifier des analytes cibles. Cependant, le manque de stabilité durable et la difficulté à traverser les membranes biologiques des enzymes libres ont souvent limité leurs applications en milieu biologique complexe. Même si l'application d'une électrode ne convient pas aux analyses intracellulaires ou à l'imagerie in vivo, des efforts considérables ont été consacrés au développement de biocapteurs incorporés à la peroxydase de raifort (HRP) pour déterminer H₂ O₂ basé sur des méthodes électrochimiques [23, 24].

Dans ce travail, des nanoréacteurs enzymatiques, composés de HRP encapsulé dans des nanosphères de silice creuses de 45 nm, ont été synthétisés par une voie de microémulsion eau-dans-huile (w/o) suivie d'un processus de gravure doux [25]. Auparavant, nous avons démontré que de tels nanomatériaux creux peuvent maintenir une activité stable des enzymes encapsulées et des nanocatalyseurs tout en les protégeant contre la protéolyse et le frittage, respectivement [26, 27]. Dans ce travail, nous avons évalué leurs utilisations potentielles en tant que biocapteurs intracellulaires en étudiant l'efficacité de piégeage enzymatique, la capacité de charge, la réactivité et la sélectivité du peroxyde, l'absorption cellulaire, la toxicité et les effets de prolifération des HRP@HSN. En utilisant la dihydrorhodamine 123 (DHR123) comme substrat, qui a été couramment couplée à la HRP pour détecter la production de peroxyde d'hydrogène intracellulaire, les interactions entre les HRP@HSN et divers types de ROS dans des solutions aqueuses ont été étudiées par cytométrie en flux et microscopie à fluorescence. De plus, il a été démontré que l'utilisation de HRP@HSN avec DHR123 peut simultanément imager et quantifier le H₂ physiologique. O₂ niveaux dans les macrophages RAW264.7 stimulés par le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA). Pris ensemble, les nanoréacteurs enzymatiques de HRP@HSNs ont le potentiel pour l'imagerie des cellules inflammatoires associées aux ROS in vivo et les composants encapsulés peuvent être étendus à plusieurs enzymes différentes [28], nanoparticules [26] et molécules de reconnaissance pour des applications synergiques.

Méthodes/Expérimental

Produits chimiques et réactifs

Décane, n -hexanol (98%), hydroxyde d'ammonium (NH₄ OH, 35 % en poids %), l'orthosilicate de tétraéthyle (TEOS, 98 %), le 3-aminopropyltriméthoxysilane (APTMS, 95 %) et l'isomère d'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ont été achetés auprès d'ACROS. Éther isooctylphénylique de polyoxyéthylène (5) (Igepal CA-520), HRP type VI-A (HRP), 3,3′5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB), acide citrique, diméthylsulfoxyde (DMSO) et isothiocyanate de rhodamine B ( RITC) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich. Le 2-(4-iodophényl)-3-(4-nitrophényl)-5-(2,4-disulfophényl)-2H-tétrazolium a été acheté auprès de Clontech. Le DHR123 et le PMA ont été achetés auprès de Cayman Chemical. Peroxyde d'hydrogène (H₂ O₂ , 35%) a été acheté auprès de SHOWA Chemical Industry. Solution d'hydroperoxyde de tert-butyle (70% dans H₂ O) a été acheté chez Aldrich. Perchlorate de fer (II) (Fe(ClO₄ )₂ ) a été acheté à Alfa Aesar. De l'eau ultrapure désionisée (D.I.) a été générée par un système Millipore Milli-Q Plus. Tous les réactifs ont été utilisés sans autre purification.

Synthèse de nanosphères de silice creuses (HSN)

Les HSN ont été synthétisés par un système de microémulsion inverse accompagné d'une méthode de gravure sélective telle que décrite dans nos études précédentes [25, 29]. En règle générale, 20 mL de décane en tant que phase huileuse, 1,63 mL de CA-520 en tant que tensioactif et 550 μL de n -hexanol en tant que co-tensioactif ont été mélangés et agités magnétiquement avec un barreau d'agitation revêtu de PTFE de 2 cm à 650 tr/min. Après cela, 350 μL de D.I. de l'eau a été ajoutée au mélange à température ambiante, générant un système de microémulsion eau-dans-huile (w/o). Ensuite, 25 μL de solution éthanolique d'APTMS (200 μL d'APTMS dans 1,4 mL d'éthanol absolu) et 100 μL de TEOS ont été ajoutés sous agitation. Après agitation pendant 10 min, 250 μL d'ammoniac aqueux (35 % en poids) ont été introduits dans le système sous agitation à 20°C. Après 10 h, de l'éthanol à 95 % a été ajouté pour déstabiliser le système de microémulsion et les nanoparticules de silice solides (SSN) ont été collectées par centrifugation à 11 000 tr/min pendant 20 min. Pour obtenir des HSN, les SSN ont été suspendus en D.I. eau sous agitation à 40 °C pendant 40 min. Ensuite, les HSN ont été collectés par centrifugation à 11 000 tr/min pendant 20 min et lavés plusieurs fois avec de l'éthanol à 95 %. Enfin, les HSN ont été suspendus et conservés dans de l'éthanol à 99,5 %.

Synthèse de nanosphères de silice creuses encapsulées dans de la peroxydase de raifort (HRP@HSNs)

Les HRP@HSN ont été synthétisés par une méthode basée sur nos études précédentes [27, 28]. Typiquement, la synthèse est similaire à la procédure ci-dessus, sauf que 350 μL de D.I. l'eau a été remplacée par 350 μL de HRP aqueux (90 μL de 10 mg/mL d'une solution de HRP dans 350 μL d'eau déminéralisée). Après synthèse, les HRP@HSN ont été conservés en D.I. eau à 4 °C.

Synthèse des FITC-HSN et HRP@FITC-HSN

Les HSN et HRP@HSN avec un colorant fluorescéine émettant du vert incorporé (désignés FITC-HSN et HRP@FITC-HSN) ont été synthétisés de la même manière que la procédure ci-dessus, sauf que la solution éthanolique APTMS a été remplacée par une solution FITC-APTMS. Une solution éthanolique FITC-APTMS a été préparée en mélangeant 10 mg de FITC et 200 μL d'APTMS avec 1,4 mL d'éthanol absolu dans l'obscurité pendant 18 h à température ambiante.

Efficacité de piégeage HRP et capacité de chargement des HRP@HSN

Tout d'abord, un mélange composé de HRP (6 mg dans 500 μL d'eau déminéralisée) et de RITC (3 mg dans 350 μL de DMSO) a été agité dans des conditions sombres pendant 24 h à 4 °C. Après cela, le mélange a été transféré sur une membrane de dialyse composée de cellulose régénérée avec un seuil de poids moléculaire de 12 à 14 kDa. Ensuite, pour éliminer le RITC n'ayant pas réagi, la poche de dialyse a été dialysée contre 1 L de D.I. l'eau et agité doucement pendant 3 jours. Enfin, le HRP labellisé RITC (désigné RITC-HRP) a été utilisé pour synthétiser les RITC-HRP@HSN.

Pour déterminer la capacité de charge HRP, RITC-HRP@HSNs ont été dissous dans 1 mL de NaOH (1 M) pendant 1 h, et la quantité de RITC-HRP piégé a été calculée à partir d'une courbe d'étalonnage établie en traçant l'intensité de fluorescence par rapport à la concentration de RITC-HRP. La fluorescence a été mesurée avec un instrument Hitachi F-4500 à une longueur d'onde d'excitation de 543 nm et une longueur d'onde d'émission de 550 à 650 nm. L'efficacité de piégeage HRP et la capacité de charge des HRP@HSNs ont été définies comme suit :efficacité de piégeage (%) = masse de RITC-HRP dans RITC-HRP@HSNs/masse initiale de RITC-HRP ; et capacité de chargement = masse de RITC-HRP dans HRP-RITC@HSNs/masse de RITC-HRP@HSNs.

Test d'activité HRP

Pour détecter l'activité de l'enzyme peroxydase, un substrat chromogène de TMB a été utilisé. Le TMB peut être converti en un produit coloré lorsqu'il est oxydé par HRP en utilisant du peroxyde d'hydrogène comme agent oxydant. Tout d'abord, diverses concentrations de HRP native et HRP@HSN ont été préparées dans un tampon phosphate et citrate (pH 5,2). Ensuite, chaque solution a été complétée par 50 μL de solution de TMB (20 μM dans du DMSO) et 50 μL de H₂ O₂ (20 μM dans de l'eau déminéralisée). La réaction a été suivie en mesurant l'absorbance à 655 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (BioTek Synergy Hybrid Reader). L'activité de la HRP encapsulée dans les HSN a été calculée à partir de la courbe d'étalonnage de la HRP native.

Test de réactivité des HRP@HSN à divers ROS

DHR123 (20 μM) seul ou mélangé avec HRP@HSNs (50 μg/mL) a été incubé avec différents types de ROS (100 μM) dans 100 μL de solution DMEM (pH 7,4). L'émission de fluorescence à 530 nm (λex = 488 nm) a été surveillée toutes les 5 min pendant les 120 premières minutes. Les ROS étudiés ont été obtenus comme suit :peroxyde d'hydrogène (H₂ O₂ ) et l'hydroperoxyde de tert-butyle (TBHP) ont été préparés à partir de solutions aqueuses à 32 et 70 % disponibles dans le commerce, respectivement. Superoxyde (O₂ ^•− ) a été généré à partir d'un stock de 10 mM de superoxyde de potassium (KO₂ ) dans DMEM. Les radicaux hydroxyle (•OH) et les radicaux tert-butoxy (•OtBu) ont été produits par la réaction de 1 mM Fe(ClO₄ )₂ avec 100 μM H₂ O₂ ou 100 μM TBHP, respectivement.

Culture cellulaire et test de viabilité

La lignée cellulaire de macrophages de souris RAW264.7 a été obtenue auprès de l'ATCC. Les cellules RAW264.7 ont été maintenues dans du DMEM avec 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (Gibco) à 37 °C dans 5 % de CO₂ atmosphère. Typiquement, 2 × 10 ⁵ Des cellules RAW264.7 par puits ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits pour les tests de viabilité. Après 24 h, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et incubées avec différentes quantités (0, 50, 100 et 200 μg/mL) d'une suspension de nanoparticules dans du DMEM sans sérum pendant 2 h. Pour le test de cytotoxicité, les cellules traitées aux nanoparticules ont été lavées deux fois avec du milieu de culture suivi d'une incubation avec le réactif WST-1 (Clontech) à 37 °C pendant 2 h. Pour le test de prolifération, les cellules après traitement avec des nanoparticules pendant 2 h ont été laissées à croître dans un milieu de croissance régulier pendant 24 h, suivi d'une incubation avec le réactif WST-1. La viabilité cellulaire a été déterminée par le colorant formazan généré par les cellules vivantes, et l'absorbance à 450 nm a été mesurée, avec une longueur d'onde de référence de 650 nm, à l'aide d'un lecteur de microplaques (Bio-Rad, modèle 680).

Analyse de l'absorption des cellules

Cellules RAW264.7 à 1 × 10 ⁶ par puits ont été ensemencés dans des plaques à six puits pendant la nuit. Ensuite, les macrophages RAW264.7 ont été traités avec différentes quantités (0, 50, 100 et 200 μg/mL) d'une suspension de nanoparticules dans un milieu DMEM sans sérum pendant 2 h. Après cela, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et détachées par une solution de trypsine-EDTA. L'absorption de nanoparticules par les macrophages RAW264.7 a été examinée par cytométrie en flux. Le bleu trypan a été utilisé pour éteindre la fluorescence des nanoparticules adsorbées sur la membrane extérieure des cellules.

Analyse par cytométrie en flux de la production de ROS dans les macrophages RAW264.7 stimulés par PMA

Typiquement, après 2 h de traitement des macrophages RAW264.7 avec des nanoparticules, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS suivi d'une incubation avec 20 μM de DHR123 dans du DMEM sans sérum pendant 30 min. Ensuite, les cellules RAW264.7 ont été lavées avec du PBS et incubées avec un milieu de culture contenant du PMA à différentes concentrations pendant 1 h. Après lavage, les macrophages RAW264.7 ont été récoltés et analysés par un cytomètre en flux FACS Canto II.

Analyse quantitative

Cellules RAW264.7 à 3 × 10 ⁴ par puits ont été ensemencés dans des plaques à 96 puits pour des dosages semi-quantitatifs. Après incubation avec 50 μL de 100 μg/mL d'une suspension de nanoparticules dans du DMEM sans sérum pendant 2 h, les cellules traitées aux nanoparticules ont été traitées avec 50 μL de DMEM sans sérum contenant différentes concentrations de PMA, et 20 μM de DHR123 pour un temps supplémentaire 1 h à 37 °C. Dans le même temps, les normes externes de H₂ O₂ mélangés avec 50 μg/mL HRP@HSNs ont été utilisés pour développer une courbe d'étalonnage en traçant l'intensité de fluorescence en fonction de la concentration de H₂ O₂ . L'intensité de fluorescence a été mesurée avec un lecteur de microplaques (BioTek Synergy Hybrid Reader) avec une excitation à 488 nm et une émission à 530 nm. En utilisant la courbe d'étalonnage établie, les quantités de H₂ O₂ dans RAW264.7, les cellules stimulées avec diverses quantités de PMA ont été calculées.

Caractérisation

Des images au microscope électronique à transmission (MET) ont été prises sur un JEOL JEM-1200 EX II fonctionnant à 100 kV. Les images ont été enregistrées avec une caméra CCD GatanOrius. Les échantillons ont été dispersés dans de l'éthanol à 95 % et déposés sur une grille de cuivre recouverte de carbone, puis séchés à l'air et examinés. Pour vérifier la HRP dans les sphères creuses, un échantillon de coloration négative a été agité dans de l'acétate d'uranyle (UA) aqueux à 1 % pendant 1 h, puis centrifugé pour éliminer l'UA restant. Enfin, l'échantillon a été dispersé dans de l'éthanol et déposé sur la grille de cuivre pour l'imagerie. Des mesures de diffusion dynamique de la lumière (DLS) et de potentiel zêta ont été effectuées sur un Zetasizer Nano ZS (Malvern, Royaume-Uni). Les images optiques des cellules RAW264.7 ont été obtenues avec un microscope inversé Zeiss Axio Observer Z1.

Résultats et discussion

Conception et synthèse de HSN et HRP@HSN

Typiquement, les HSN et HRP@HSN ont été synthétisés via un procédé sol-gel catalysé par l'ammoniac combiné à un système de microémulsion eau-dans-huile (w/o) selon notre méthode précédente [27, 28]. Le schéma 1 illustre la synthèse des HRP@HSN. D'après les images MET (Fig. 1), les HSN avec et sans HRP encapsulée ont montré un diamètre moyen de 45 nm (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1). La coloration UA ​​a clairement affiché une densité électronique améliorée à l'intérieur des HRP@HSN, mais aucune coloration n'a été observée en dehors des HRP@HSN (Fig. 1b), indiquant que les enzymes HRP ont été piégées avec succès dans la cavité intérieure des HRP@HSN.

Organigramme de la synthèse de nanosphères de silice creuses encapsulées dans de la peroxydase de raifort (HRP@HSNs). APTMS, 3-aminopropyltriméthoxysilane; TEOS, orthosilicate de tétraéthyle; SSN, nanoparticule de silice solide

Images TEM de a nanosphères creuses de silice (HSN), b HSN colorés à l'acétate d'uranyle, c HSN encapsulées dans de la peroxydase de raifort (HRP@HSN) et d HRP@HSN colorés à l'acétate d'uranyle. En médaillon :une vue agrandie

Les mesures DLS et les analyses de potentiel zêta effectuées à température ambiante sont présentées dans le tableau 1. Les données DLS ont montré que les HSN et HRP@HSN ont donné des potentiels zêta positifs dans l'eau (pH ~ 6,5) avec des diamètres hydrodynamiques de 188 ± 4 et 184 ± 6 nm dans l'eau, respectivement. Cependant, lorsque les nanoparticules ont été dispersées dans du DMEM sans sérum, les diamètres hydrodynamiques ont augmenté jusqu'à 1767 ± 94 nm pour les HSN et 1598 ± 127 nm pour HRP@HSNs. Ceux-ci indiquent un faible degré d'agrégation des HSN, mais ils étaient encore bien suspendus dans les médias. Pendant ce temps, les potentiels zêta négatifs des deux nanoparticules mesurés dans les milieux impliquaient que certains des ions et des biomolécules du milieu biologique pouvaient avoir été adsorbés sur les surfaces des nanoparticules [30, 31]. Dans ces conditions, les surfaces chargées positivement des nanoparticules étaient recouvertes de substances chargées négativement, ce qui provoquait rapidement l'agrégation des nanoparticules par le biais d'interactions électrostatiques. Pour réduire l'agrégation non spécifique et favoriser la stabilité colloïdale des nanoparticules, la sérumalbumine bovine (BSA) a été introduite dans les milieux biologiques [28]. Par la suite, les diamètres hydrodynamiques des HSN et HRP@HSN ont montré une diminution considérable des diamètres hydrodynamiques à 197 ± 43 et 195 ± 19 nm respectivement.

Efficacité de piégeage HRP et capacité de chargement des HRP@HSN

Pour étudier l'efficacité et la capacité de charge du piégeage de la HRP, une HRP marquée par un colorant fluorescent (RITC) a été préparée (appelée RITC-HRP). L'intensité de fluorescence des RITC-HRP@HSN a été mesurée en suspendant les nanoparticules dans 1 M de NaOH, et la quantité de RITC-HRP encapsulée a été déterminée selon une courbe d'étalonnage établie en traçant l'intensité de fluorescence en fonction de la concentration de RITC-HRP natif. dans les mêmes conditions (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2). Pour étudier les effets de la concentration en enzyme sur l'efficacité de piégeage et la capacité de charge, trois quantités différentes de HRP (11,1, 22,2 et 33,3 nmol) ont été introduites dans la synthèse. Il convient de noter que dans cette gamme de concentration, quelle que soit la quantité d'enzyme introduite, l'efficacité de piégeage des enzymes pour chacun des trois cas était d'environ 6 %. Cette faible efficacité peut être due au fait que seule une fraction des gouttelettes de la microémulsion a nucléé et s'est développée en HSN; la plupart des gouttelettes de la microémulsion n'étaient pas nucléées et restaient dans sa petite taille d'environ 8 nm [25]. Des travaux futurs pourraient être nécessaires pour augmenter l'efficacité de chargement. Cependant, la capacité de charge HRP de HRP@HSNs a augmenté progressivement jusqu'à 12,5 ± 1,2 μg HRP/mg HSNs lorsque 33,3 nmol de HRP ont été utilisées (Fichier supplémentaire 1 :Tableau S1). Cela indique que la capacité de charge HRP peut être contrôlée par la quantité d'enzyme présente dans la réaction.

Cytotoxicité et absorption cellulaire des HSN et HRP@HSN

Pour évaluer la cytotoxicité in vitro des HSN et HRP@HSN, la viabilité cellulaire a été examinée par des tests WST-1. Comme le montre le fichier supplémentaire 1 :Figure S3, aucun changement significatif dans la prolifération des cellules RAW264.7 n'a été observé après des traitements de nanoparticules pendant 2 h ou 2 h suivis de 24 h supplémentaires de culture. Aucun effet évident sur la fonction mitochondriale cellulaire causé par les nanoparticules de silice n'a été trouvé aux moments indiqués, indépendamment de la présence ou de l'absence de HRP à l'intérieur des HSN.

Ensuite, les HSN conjugués au FITC et les HRP@HSN ont été respectivement préparés pour étudier l'effet de concentration des nanoparticules sur le marquage RAW264.7. Les résultats de cytométrie en flux (Fichier supplémentaire 1 :Figure S4) ont montré que les cellules RAW264.7 ont été étiquetées avec succès avec FITC-HSN et HRP@FITC-HSN à différentes concentrations pendant 2 h dans un milieu sans sérum. Dans les deux cas, des augmentations dose-dépendantes de l'efficacité du marquage ont été trouvées, et plus de 80 % des cellules RAW264.7 ont été marquées par exposition à des nanoparticules à une concentration>   50 μg/mL pendant 2 h. Des propriétés telles que le marquage intracellulaire à haute efficacité avec un temps d'incubation court, une dose relativement faible de nanoparticules et la non-cytotoxicité rendent les HRP@HSN adaptés à la détection intracellulaire des ROS.

Réactivité des HRP@HSN à divers ROS

Selon le dosage de l'activité enzymatique HRP utilisant le TMB comme substrat, environ 40 % de l'activité enzymatique initiale est restée lors de l'encapsulation ultérieure de HRP dans des HSN. Cette diminution de l'activité spécifique observée de l'enzyme encapsulée (moles de substrat converties par unité d'enzyme par unité de temps) pourrait résulter de limitations de transfert de masse, qui se produisent lorsque les substrats traversent la coque de silice vers le HRP [32]. Néanmoins, la stratégie d'encapsulation offre des fonctionnalités supplémentaires, par exemple, la coque de silice poreuse peut protéger la HRP contre la protéolyse tout en permettant le transport de petites molécules de réactifs et de produits [26, 27]. Dans l'ensemble, la réactivité observée des HRP@HSN aux ROS, évaluée en incorporant une sonde fluorescente (DHR123), pourrait résulter d'une combinaison de l'affinité des nanoparticules ainsi que de la propriété intrinsèque de HRP pour les ROS.

Des systèmes sans cellules ont été utilisés pour générer une variété de ROS biologiquement pertinents, y compris le peroxyde d'hydrogène (H₂ O₂ ), TBHP, radicaux hydroxyles (•OH), radicaux tert-butoxy (•OtBu) et superoxyde (O₂ • ⁻ ). Tout d'abord, DHR123 a été incubé avec un panel de ROS en l'absence et en présence de HRP ou HRP@HSNs suivi de la mesure de l'intensité de fluorescence du produit rhodamine 123 (R123). Comme le montre la figure 2, quel que soit le type de ROS utilisé, l'intensité de la fluorescence a été mesurée en fonction du temps (30, 60, 90 et 120 min). Cependant, les différences apparentes d'intensité entre les divers ROS dépendent des propriétés intrinsèques de DHR123. D'une part, en accord avec une étude précédente [33], la Fig. 2a montre que ni H₂ O₂ ni O₂ • ⁻ pourrait oxyder le DHR123 en R123. De plus, le DHR123 présentait une réactivité plus élevée pour les radicaux •OtBu et •OH par rapport aux autres ROS. Avec l'activité catalytique de la HRP, des augmentations remarquables de l'intensité de fluorescence ont été observées en présence de HRP native et de HRP@HSN, comme le montre la Fig. 2b, c. Il a été noté que l'intensité de fluorescence plus élevée trouvée dans le cas de la HRP native par rapport aux HRP@HSN au même temps de réaction était positivement corrélée avec leurs activités enzymatiques observées.

un –c Intensité de fluorescence dépendante du temps de la réaction d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) sélectionnées avec a dihydrorhodamine 123 (DHR123), b DHR123 + peroxydase de raifort (HRP) et c DHR123 + HSN encapsulées dans de la peroxydase de raifort (HRP@HSN). d Rapport d'intensité amélioré de la réaction des ROS sélectionnés avec DHR123 + HRP et DHR123 + HRP@HSNs à 1 h. Les données indiquées concernent 20 μM de DHR123, 400 ng/mL de HRP, 50 μg/mL de HRP@HSNs et 100 μM de ROS. (*p < 0,05 par rapport au groupe témoin aux moments correspondants)

Pour permettre une comparaison directe entre divers ROS, les données à un intervalle de temps de 60 min ont été sélectionnées et rapportées en tant qu'intensité de fluorescence relative normalisée par rapport au contrôle (Fichier supplémentaire 1 :Figure S5). Une analyse ultérieure du rapport d'intensité amélioré a été montrée en divisant l'intensité de fluorescence relative de DHR123 + HRP ou DHR123 + HRP@HSNs par DHR123 (Fig. 2d). Dans les deux cas contenant du HRP, une tendance similaire du rapport d'intensité amélioré sur divers ROS ainsi que des augmentations significatives de la réactivité de DHR123 à H₂ O₂ et O₂ • ⁻ ont été observés, démontrant que la HRP encapsulée donnait un degré élevé d'activité enzymatique intrinsèque, et les coquilles de silice des HRP@HSN permettaient le transport de petites molécules pour effectuer une bio-catalyse sélective.

Détection intracellulaire de ROS avec HRP@HSN

Pour évaluer la fonctionnalité de détection des ROS de HRP@HSN à l'intérieur des cellules, les macrophages RAW264.7 ont été incubés avec HRP@HSN pendant 2 h, suivis d'un lavage puis d'une incubation avec DHR123 (20 μM) pendant 30 min. Par la suite, les cellules ont été lavées et traitées avec du PMA (1 μg/mL) pendant 1 h supplémentaire. Il est connu que la stimulation des macrophages avec le PMA entraîne la production de superoxyde, qui est transformé en peroxyde d'hydrogène par la superoxyde dismutase ou par dismutation spontanée [34,35,36]. Ainsi, le PMA peut fonctionner comme un stimulant pour générer H₂ O₂ dans les macrophages RAW264.7 pour évaluer le H₂ intracellulaire O₂ -Capacité de détection des HRP@HSN. Comme le montre la Fig. 3a, les deux cas de macrophages RAW264.7 cultivés seuls et cultivés avec des HSN ont montré une faible fluorescence dans l'analyse par cytométrie en flux, indiquant que les cellules non stimulées ont produit un faible niveau basal de ROS, où aucun ROS significatif n'a été induit dans la présence de HSN. De plus, les cellules traitées avec HRP@HSN ont montré une augmentation significative de l'intensité (Fig. 3a), suggérant que les HRP@HSN délivrés ont donné une activité catalytique supplémentaire à l'intérieur des cellules.

un Analyses par cytométrie de flux de macrophages RAW264.7 stimulés avec et sans phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) en présence et en absence de nanoparticules. b PMA et c La concentration de HSNs encapsulés dans de la peroxydase de raifort (HRP@HSNs) a modifié de manière dépendante la fluorescence des macrophages RAW264.7. d Les images de fluorescence représentatives des macrophages RAW264.7 dans les conditions indiquées. Barres d'échelle 50 μm

Pour les expériences de stimulation, les cellules traitées au PMA généraient généralement des niveaux de fluorescence R123 plus de deux fois supérieurs à ceux des cellules non stimulées. De plus, les cellules traitées avec HRP@HSN avaient le niveau de fluorescence le plus élevé, suivies par les HSN et ensuite les cellules seules. Il a été noté que le traitement des macrophages RAW264.7 stimulés avec des HSN entraînait une légère augmentation de l'intensité de fluorescence par rapport à celle du contrôle. Ce résultat suggère que les réponses cellulaires au stress sont déclenchées extrêmement rapidement et sensibles aux stimuli externes, y compris l'exposition aux nanoparticules [37]. De plus, le PMA (0,1, 0,25, 0,5, 1 et 2 μg/mL) et le HRP@HSN (50, 100 et 200 μg/mL) ont induit l'expression de R123 de manière dose-dépendante, comme le montre la figure . 3b, c.

Conformément à l'analyse par cytométrie en flux, la figure 3d affiche les images de fluorescence représentatives des macrophages RAW264.7 stimulés avec et sans PMA en présence et en l'absence de nanoparticules. Le système était capable de visualiser H₂ endogène O₂ génération dans des cellules RAW264.7, et l'intensité de fluorescence la plus faible a été observée dans les cellules traitées avec HRP@HSN suivies d'une stimulation PMA. Comme le montre la figure 4a, la viabilité cellulaire des macrophages RAW264.7 en présence du stimulant PMA ou de H₂ exogène O₂ a été examiné par des tests WST-1. Alors que les ROS ont été impliqués dans l'apoptose [38], seul un petit effet sur la viabilité cellulaire a été trouvé au moment indiqué, ce qui rend l'analyse semi-quantitative suivante pratique et significative.

un Dosage WST-1 des macrophages RAW 264.7 après traitements de H₂ exogène O₂ ou stimulation avec du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pendant 1 h. b Détection de la concentration de H₂ O₂ produit de manière endogène par les macrophages RAW264.7 sous diverses concentrations du stimulant PMA en présence de nanosphères de silice creuses encapsulées dans de la peroxydase de raifort (HRP@HSNs) et de dihydrorhodamine 123 (DHR123). En médaillon :une courbe d'étalonnage obtenue à partir des étalons externes de H₂ O₂ mixed with HRP@HSNs and DHR123

Application of HRP@HSNs In Vitro for Quantitative Analysis of H₂ O₂

To evaluate the capacity of HRP@HSNs for quantifying endogenous hydrogen peroxide produced in PMA-stimulated RAW264.7 cells, a calibration curve from the exogenous H₂ O₂ experiment, with a detection range of 0.625~15 μM, was established by microplate measurements (Fig. 4b, inset). The standard calibration curve appears to be linear as expected. Then, RAW264.7 cells were treated with 100 μg/mL of HRP@HSNs for 2 h, followed by co-incubation with various concentrations of PMA and 20 μM of DHR123 at 37 °C for 1 h. After that, the concentration of H₂ O₂ endogenously produced by PMA-stimulated RAW264.7 cells was determined by measuring the fluorescence intensity, followed by conversion using the established calibration curve. Notably, because most of the HRP@HSNs were uptaken within the cells, the H₂ O₂ -triggered fluorescence of R123 could be attributed to intracellular enzyme-catalyzed reactions rather than the extracellular contribution. Although H₂ O₂ is able to diffuse across biomembranes, due to its limited diffusion and rapid enzymatic consumption inside cells, concentration gradients of H₂ O₂ are formed across membranes [39, 40]. Typically, under normal physiological conditions, H₂ O₂ has an extracellular concentration estimated at 10 ^− 7 ~10 ^− 6  M, which is about 10-fold higher than that observed in intracellular fluid [1, 41, 42]. In pathological conditions, extracellular concentrations of H₂ O₂ are in the range of 10~50 μM and are additionally elevated to as high as 10 ^− 4  M in apoptosis [1]. As shown in Fig. 4b and Additional file 1:Table S2, endogenous hydrogen peroxide caused by PMA-stimulated RAW264.7 cells was created in a dose-dependent manner and produced at levels of about 10 μM when the concentration of PMA used exceeded 0.25 μg/mL. Taken together, these results indicate that HRP@HSNs were capable of detecting semi-quantitatively endogenous the concentration of hydrogen peroxide of RAW264.7 macrophages under oxidative stress conditions.

Conclusions

In summary, we have demonstrated that hollow silica nanospheres encapsulating HRP can be synthesized via a microemulsion-templating system and act as intracellular fluorescent ROS sensors. The shells of HRP@HSNs are permeable to small molecules, such as the enzyme substrates, which allows them to react with large enzyme payloads in the hollow cavity. Both the effective intracellular delivery and satisfactory catalytic activity of HRP@HSNs significantly enhance reduction-triggered fluorescence and constitute the ability of semi-quantitative measurements of endogenous H₂ O₂ in RAW264.7 macrophages under oxidative stress conditions.

Because the concentration and location of H₂ O₂ in eukaryotic cells strongly rely on the types of cells, and cellular compartments [1], specific targeting of tumor cells or organelles could further be achieved by surface modification of HRP@HSNs with monoclonal antibodies or peptides. Also, non-enzymatic H₂ O₂ detection could be realized by replacing the interior nanoreactors of HRP with nanoparticles [43, 44] or boronate-based fluorescent probes [42, 45]. Future efforts should be devoted to maximizing the sensitivity and specificity for H₂ O₂ as well as enabling more informative designs of next-generation nanomaterials. Such hollow capsules could be a promising platform for modern nanomedicines that aims to simultaneously image, sensing, and deliver therapeutic molecules specifically to defective cells.

Abréviations

APTMS:

3-Aminopropyltrimethoxysilane

BSA:

Bovine serum albumin

DHR123:

Dihydrorhodamine 123

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

HRP:

Horseradish peroxidase

HSNs:

Hollow silica nanospheres

Igepal CA-520:

Polyoxyethylene (5) isooctylphenyl ether

mETC:

Mitochondrial electron transport chain

PET :

Positron emission tomography

PMA:

Phorbol 12-myristate 13-acetate

R123:

Rhodamine 123

RITC:

Rhodamine B isothiocyanate

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

SSN:

Solid silica nanoparticles

TBHP:

Tert-butyl hydroperoxide

TEM :

Transmission electron microscopic

TEOS:

Tetraethyl orthosilicate

TMB:

3,3′5,5′-Tetramethylbenzidine