La libération successive d'inhibiteurs tissulaires de la métalloprotéinase-1 via un système d'administration à base d'oxyde de graphène peut favoriser la régénération de la peau

Contexte

Les lésions cutanées peuvent être causées par de nombreux facteurs tels que des accidents, des complications diabétiques, des brûlures ou une chirurgie superficielle [1]. L'autogreffe de peau, ou les biopolymères utilisés pour la fabrication de la peau artificielle, représentent l'approche la plus couramment utilisée pour la fermeture des plaies [2]. Ces substituts peuvent inclure une limitation des tissus mous du donneur disponibles, en particulier chez les patients gravement brûlés [3], une infection [4], une douleur et une nécrose du lambeau cutané [5], un ralentissement de la cicatrisation et de la biocompatibilité du matériau.

L'inhibiteur tissulaire de la métalloprotéinase-1 (TIMP-1) empêche la décomposition de la matrice extracellulaire (ECM) en formant un complexe inhibiteur avec les métalloprotéinases matricielles (MMP) [6, 7]. Les protéines TIMP contrôlent également le renouvellement et le traitement induits par les MMP des facteurs de croissance ainsi que des cytokines liées à la réparation et à la régénération des plaies [8]. Les TIMP et les MMP sont régulés pendant la cicatrisation normale des plaies et leur déséquilibre a été impliqué dans les défauts de réparation de la peau, les chéloïdes et la fibrose [9]. Le TIMP-1 d'origine épithéliale peut réguler l'épithélialisation à différents stades, directement ou indirectement. Une phase importante de la réparation des plaies par excision et de la régénération cutanée est la réépithélialisation, qui est la repousse de l'épithélium sur une surface traumatique [10]. La réépithélialisation se produit lorsque les cellules au bord de la plaie relâchent leurs contacts cellule-cellule et cellule-ECM et commencent à migrer à travers la plaie. Ces processus ont été liés à la biologie du TIMP-1 [11].

Un système d'administration régional optimal de TIMP-1 pour la restauration de la peau dépend du véhicule d'administration utilisé. Certains véhicules d'administration conçus pour libérer des cytokines ont été développés [12]. Les transporteurs comprennent le PLGA (poly(acide lactique-co-glycolique)) [13], le chitosan [14], les nanosphères de PLGA [15] et les hydrogels. L'utilisation d'un véhicule d'administration aiderait à réduire la dose de TIMP-1 pour la régénération de la peau et permettrait une administration régionale de l'agent. Le graphène est composé d'atomes de carbone avec une monocouche plate et une structure bidimensionnelle en nid d'abeille [16]. L'oxyde de graphène (GO) a été utilisé comme véhicule d'administration de médicaments à petite molécule dans la littérature car il a une charge efficace (absorption), est biocompatible et a une faible toxicité [17,18,19]. Les caractéristiques essentielles de GO incluent l'hydrophobe π domaines au cœur de la structure avec des régions ionisées le long des bords. Le distinctif π –π l'interaction d'empilement rend GO efficace avec la solubilité dans l'eau, avec une grande surface spécifique pour une capacité de charge élevée [20, 21].

Dans la présente étude, nous avons cherché à savoir si la protéine TIMP-1 humaine recombinante peut être associée à GO en tant que véhicule d'administration pour améliorer la régénération de la peau. Pour étudier l'effet sur la régénération de la peau, le TIMP-1 a été chargé sur des flocons de GO, et sa libération et sa toxicité sont mesurées in vitro via des fibroblastes de rat. Les résultats sont finalement testés sur des rats où un modèle de plaie cutanée est utilisé.

Matériaux et méthodes

Culture cellulaire

Des fibroblastes de rat ont été achetés à l'Institute of Biochemistry and Cell Biology, CAS (Shanghai, Chine) et cultivés dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA) contenant 10 % (v /v ) sérum bovin foetal (FBS, Gibco). Le support a été changé tous les 2 jours. Toutes les cellules ont été maintenues à 37 °C.

Caractérisation GO

Les flocons GO ont été achetés auprès de Chengdu Organic Chemicals Co., Ltd. Académie chinoise des sciences (Chengdu, Chine) et caractérisés par microscopie électronique à balayage (SEM, JSM-6701F, JEOL, Tokyo, Japon) après revêtement en platine. Les échantillons ont été scannés au microscope électronique à balayage (Hitachi S3000N) à une tension d'accélération de 15 kV. La distribution de taille des flocons GO a été déterminée avec un spectrophotomètre basé sur le potentiel électrique zêta (Zetasizer 3000 HSA, Malvern, Royaume-Uni). La morphologie des flocons GO a été déterminée en utilisant la microscopie à force atomique (AFM, MultiMode, VEECO, USA) couplée à un microscope inversé (microscope inversé IX71, Olympus, Tokyo, Japon). L'analyse thermogravimétrique et la calorimétrie différentielle à balayage ont été réalisées à l'aide d'un analyseur thermogravimétrique TGA/DSC (Pyris 1 TGA, Perkin-Elmer, USA) en plaçant les échantillons dans des bacs en alumine et en appliquant une rampe de chauffe de 25 à 1100 °C à 10 °C/ min.

Adsorption TIMP-1 sur GO

Les flocons de GO ont été marqués avec du perchlorate de 1,1-dioctadécyl-3,3,3,3-tétram-éthylindocarbocyanine (Dil, rouge, Sigma) avant l'adsorption de TIMP-1 recombinant humain (Huaan Co., Hangzhou, Chine). Pour l'adsorption du TIMP-1, de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC, vert, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) conjugué à du TIMP-1 (Huaan Co., Hangzhou, Chine) et du GO marqué DiI ont été ajoutés à une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ) et incubé pendant 4 h à 4 °C. Le rapport de GO au TIMP-1 recombinant était de 1:1 en poids. Pour déterminer la charge de TIMP-1 sur GO, TIMP-1 (1 μg) a été ajouté à 20 μl de PBS contenant GO et incubé pendant 4 h à 4 °C. Le TIMP-1 adsorbé sur GO a été visualisé à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (microscope inversé IX81-FV1000, Olympus). Pour confirmer l'adsorption de TIMP-1 sur GO, la spectroscopie infrarouge transformée de Fourier (FTIR) a été réalisée à l'aide d'une spectroscopie Nicolet 5700 (ThermoFisher Co., SGE, Australie) sur des pastilles (10 mm de diamètre) préparées en mélangeant 2 mg de GO avec 100 mg KBr et pressage pour produire le culot à analyser. Les spectres ont été analysés après correction de la ligne de base par le logiciel EZ OMNIC (Nicolet).

Cinétique de libération de la protéine TIMP-1

Les profils de libération de TIMP-1 à partir de diverses concentrations de GO (10, 20 et 30 μg/ml) ont été déterminés à l'aide d'essais commerciaux d'immuno-absorption enzymatique spécifique au TIMP-1 (ELISA, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, ETATS-UNIS). Après une incubation de 4 h à 4 °C, un ELISA du surnageant a montré que pratiquement tout le TIMP-1 était adsorbé sur le GO. Le GO chargé de TIMP-1 a été mis en suspension dans des boîtes de culture de 60 mm contenant 1,5 ml de PBS. Les boites ont ensuite été incubées à 37°C. À divers moments, le surnageant a été recueilli après agitation continue et du tampon frais a été ajouté aux boîtes de culture. La concentration de TIMP-1 humain dans le surnageant a été déterminée par ELISA.

Test de biocompatibilité GO

Vingt microgrammes par millilitre de flocons de GO chargés avec une concentration de 20 μg/ml de TIMP-1 ont été ajoutés à des cultures de fibroblastes de rat, et les cellules ont été cultivées pendant 6, 24, 48 et 72 h. La viabilité cellulaire a été évaluée en utilisant le test de comptage de cellules-8 (CCK8) tel que décrit dans les instructions du fabricant. L'absorbance de l'échantillon a été exprimée en valeur d'absorbance à 450 nm (n = 5 pour chaque groupe).

Caractérisation cytométrique en flux

Les fibroblastes ont été récoltés par trypsinisation et marqués avec Hoechst 33258 et Annexin-V-FITC/PI. L'activité du cycle cellulaire et l'apoptose cellulaire ont ensuite été déterminées par un kit d'analyse par cytométrie de flux (Lianke, Hangzhou, Chine). Le marquage a été effectué pendant 30 min à 4 °C en présence de réactif de blocage (Lianke, Hangzhou, Chine), suivi de deux étapes de lavage en utilisant du PBS. Après lavage et fixation, au moins 10 ⁴ les cellules ont été acquises et analysées. L'analyse par cytométrie en flux a été réalisée à l'aide d'un Becton Dickinson FACSCanto II.

Expérience In Vivo

Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément aux directives du NIH aux États-Unis. Les animaux pour les procédures expérimentales ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Université du Zhejiang. Des rats mâles Sprague-Dawley âgés de quatre semaines ont subi une chirurgie des défauts cutanés (SDS) comme décrit précédemment (Fig. 4a) [22]. La taille de la défection cutanée était de 10 mm × 10 mm. Après la chirurgie, les animaux ont été remis dans leurs cages individuelles. Quatorze jours après le SDS, les animaux ont été répartis au hasard en quatre groupes et le traitement a été initié. Injections locales d'agent de contrôle (4 ml de PBS uniquement), d'agent GO (4 ml de GO avec PBS, 1:20), d'agent TIMP-1 (4 ml de TIMP-1 avec PBS 1:20) ou d'agent TIMP-1-GO (4 ml GO avec TIMP-1, 1:1 v /w ) ont été administrés par voie sous-cutanée. Les injections ont été faites chaque semaine autour du défaut cutané (un total de 4 points, 1 ml chacun) pour un total de deux traitements sur une période de 2 semaines. Les rats ont été sacrifiés 4 semaines après la chirurgie (Fig. 4a). La peau régénérée a été disséquée, incluse dans de la paraffine et étudiée par coloration hématoxyline-éosine et coloration de Masson.

Analyse histologique et immunohistochimique

Les peaux régénérées ont été fixées dans du formol à 4% pendant 72 h. Ensuite, les échantillons ont été décalcifiés dans de l'acide formique à 9 % pendant 2 semaines à température ambiante. Les échantillons de peau ont été déshydratés par de l'éthanol calibré. Les coupes consécutives ont été colorées à l'hématoxyline-éosine (HE) et au Masson. L'expression de CD34 au niveau du défaut cutané a été analysée par coloration immunohistochimique. Les coupes ont été déparaffinées dans du xylène et hydratées avec des alcools gradués. Après blocage avec du sérum de chèvre à 1 % (dilution 1:100, Sigma), les coupes ont été incubées avec des anticorps primaires contre CD34 (Abcam, Cambridge, UK) pendant une nuit à 4 °C. Après trois lavages au PBS, les coupes ont été incubées avec un anticorps secondaire pendant 1 h à 37 °C. La coloration a été développée avec une solution de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) (Dako, Hambourg, Allemagne). La peau régénérée a été observée par trois observateurs entraînés. Les coupes immunohistochimiques ont été étagées en utilisant le pourcentage de DBA.

Analyse statistique

Toutes les expériences ont été répétées trois fois et les données ont été présentées sous forme de moyennes ± écart-type. L'ANOVA à un facteur et le test post hoc de Student-Newman-Keuls ont déterminé le niveau de signification. p les valeurs inférieures à 0,05 et 0,01 ont été respectivement considérées comme significatives et hautement significatives. L'analyse statistique a été réalisée avec SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, USA).

Résultats

Caractérisation GO

La représentation 2D des images GO est montrée à l'AFM (Fig. 1a). Un SEM a montré que les éclats de GO étaient des feuilles de forme irrégulière (Fig. 1b). La distribution de taille des flocons GO a été mesurée par un spectrophotomètre basé sur le potentiel électrique. La plus grande intensité de distribution de taille était de 1140 nm, et le volume le plus intense du GO était de 10 674,1 nm (Fig. 2a).

GO absorption. un Représentation 2D des images GO montrées à l'AFM. b Le SEM montre que les flocons GO sont des feuilles de forme irrégulière. Les flocons GO étaient des feuilles de forme irrégulière. c La distribution de la taille des flocons GO. L'intensité la plus élevée était de 1 140 nm et le volume le plus intense était de 10 674,1 nm

Caractérisation GO et TIMP-1-GO. un TIMP-1 a été absorbé par GO. L'analyse a révélé que 75 ± 1,2 % de GO étaient absorbés par le TIMP-1. b Les profils de libération cumulatifs de TIMP-1 ont été enregistrés. TIMP-1 intégré dans GO représente un système approprié pour une libération prolongée de TIMP-1 d'environ 40 jours. c La composition chimique entre le GO et le TIMP-1-GO a été étudiée à l'aide de la spectroscopie FTIR. La forme d'onde et le pic d'onde de GO étaient significativement différents de ceux de TIMP-1-GO. d La courbe d'analyse thermogravimétrique ne montre pas de différences majeures entre GO et TIMP-1-GO de 50 à 800 °C. La courbe d'analyse thermogravimétrique n'a montré aucune différence appréciable entre le témoin GO et le TIMP-1-GO

Adsorption TIMP-1 sur GO

Voici l'incubation du TIMP-1 conjugué au FITC (vert) et du GO marqué au DiI (rouge) dans du PBS pendant 4 h ; Le TIMP-1 a été adsorbé sur le GO. L'analyse a révélé que 75 ± 1,2 % de GO étaient absorbés par TIMP-1 après 4 h, ce qui suggère que GO se lie efficacement à la protéine TIMP-1 (Fig. 1c). Nous avons étudié la composition chimique de TIMP-1-GO en utilisant la spectroscopie FTIR (Fig. 2b). La forme d'onde et le pic d'onde de GO étaient significativement différents de ceux de TIMP-1-GO. Nous avons en outre étudié l'analyse gravimétrique thermique entre le contrôle GO et TIMP-1-GO (Fig. 2d). La courbe d'analyse thermogravimétrique n'a montré aucune différence appréciable entre le contrôle GO et le TIMP-1-GO.

Version TIMP-1

Différentes concentrations de TIMP-1 (groupe 1 3 μg/ml, groupe 2 2 μg/ml et groupe 3 10 μg/ml) ont été chargées sur GO. Les profils de libération cumulatifs de TIMP-1 sont présentés sur la figure 2c. La libération de 2 μg/ml de TIMP-1-GO a atteint 50 % de libération cumulée plus rapidement que les doses de 10 et 30 μg/ml de TIMP-1. TIMP-1 a été diffusé en continu pendant environ 40 jours. Cela suggère que l'application de TIMP-1 intégré dans GO peut représenter un système approprié pour une libération prolongée de TIMP-1 (Fig. 2c).

Prolifération et viabilité cellulaire sur TIMP-1-GO

La prolifération et la viabilité des fibroblastes de rat cultivés en contrôle, GO et TIMP-1, n'étaient pas sensiblement différentes de celles des cellules cultivées dans les différents échantillons de TIMP-1-GO (p> 0,05). Le cycle cellulaire et l'apoptose des fibroblastes cultivés dans le contrôle, GO et TIMP-1, n'étaient pas sensiblement différents de ceux des cellules cultivées dans les échantillons de TIMP-1-GO (p> 0,05) (Fig. 3a–c).

L'effet de TIMP-1-GO sur la prolifération et la viabilité des fibroblastes de rat. un La viabilité des fibroblastes cultivés dans différents groupes ne montre aucune différence significative à différents moments (p> 0,05). b Le cycle cellulaire des fibroblastes n'était pas significativement différent de celui des cellules cultivées dans différents groupes (p> 0,05). c L'apoptose cellulaire des fibroblastes n'était pas significativement différente de celle des cellules cultivées dans différents groupes (p> 0,05)

Efficacité de TIMP-1-GO dans le modèle de plaie cutanée par excision

Le TIMP-1-GO a été administré par voie sous-cutanée à des rats pour déterminer s'il pouvait favoriser la cicatrisation de la plaie expérimentale. Quatre semaines après la chirurgie, en comparaison avec le groupe témoin, les défauts cutanés traités avec TIMP-1-GO ont montré des différences significatives dans le point terminal (p < 0,05), tandis que les défauts cutanés traités avec TIMP-1 ont montré des différences significatives avec le groupe témoin et le groupe GO au point terminal (p < 0,05). De plus, le groupe TIMP-1-GO a montré un effet thérapeutique amélioré dans la régénération des follicules pileux (p < 0,05). Les défauts cutanés traités avec TIMP-1 ont montré des différences significatives avec le groupe témoin et le groupe GO au point terminal (p < 0,05) (Fig. 4b).

Expérience in vivo. un Schéma et la FDS et le modèle. b Analyse histologique et immunohistochimique in vivo (1 cm). La fibre de collagène continue est visible dans le groupe TIMP-1-GO. c L'évaluation quantitative a révélé des différences significatives entre le contrôle et GO par rapport à TIMP-1 et TIMP-1-GO (p < 0,05). Les follicules pileux des différents groupes étaient significativement différents (p < 0,05). Les défauts cutanés traités avec TIMP-1 ont montré des différences significatives avec le groupe témoin et le groupe GO par semi-quantitatif (p < 0,05)

Analyse histologique et immunohistochimique

Les caractéristiques histologiques de la régénération cutanée après traitement avec du PBS sont présentées sur la figure 4b. Les caractéristiques des groupes témoins après un défaut cutané montrent des fibres de collagène brisées visibles dans les échantillons 4 semaines après le traitement. En revanche, la fibre de collagène continue est visible dans les groupes TIMP-1-GO au même moment et montre une différence statistique par rapport au groupe témoin. Les caractéristiques immunohistochimiques de la vascularisation après traitement par TIMP-1-GO sont présentées sur la figure 3c. Les cellules sous-cutanées CD34+ sont visibles dans les échantillons après 4 semaines dans les groupes traités par TIMP-1-GO. L'évaluation quantitative a révélé des différences significatives entre les groupes témoins et le groupe de traitement TIMP-1-GO (p < 0,05) (Fig. 4c).

Discussion

Dans la présente étude, nous avons analysé une nouvelle approche potentielle pour améliorer la réparation des plaies par excision en combinant la protéine TIMP-1 recombinante avec une libération contrôlée de GO. GO a montré une bonne biocompatibilité in vitro. Et il est démontré que TIMP-1 est libéré en continu du véhicule GO jusqu'à 40 jours. Il a été démontré que la combinaison de TIMP-1 avec GO favorise la vascularisation et la régénération du collagène dans un modèle expérimental de défaut cutané.

Divers matériaux biomédicaux ont été évalués en tant que véhicules thérapeutiques pour l'administration d'agents dans la régénération tissulaire. Des véhicules tels que le collagène, la soie, le titane, le ciment de phosphate de calcium et l'acide polylactique-acide polyglycolique ont tendance à produire une libération rapide d'agent biologique qui peut être indésirable dans certains contextes thérapeutiques [23]. Par conséquent, la capacité d'un vecteur biomédical à fournir une libération lente et continue de molécules biologiques peut être considérée comme une caractéristique importante. Une exigence pour cette qualité est un flexible utilisé pour charger le médicament à l'aide d'une charge électrique [24]. L'oxyde de graphène (GO) fournit un effet « off-start » qui s'est avéré utile pour la libération lente de divers agents biologiques à la fois in vitro et in vivo [25,26,27]. Ici, nous avons montré que GO peut être utilisé pour exercer une libération prolongée de protéine recombinante humaine TIMP-1. L'interaction entre hydrophobe π les domaines de GO et l'interaction électrostatique peuvent activer les domaines chargés négativement de GO et permettre une absorption efficace de la protéine TIMP-1 vers GO via les régions hydrophobes internes. La longue libération de TIMP-1 de GO est idéale pour la revascularisation nécessaire dans la réparation des plaies cutanées.

Il est suggéré que des particules de carbone avec une concentration de plus de 50 mg/ml pourraient se déposer dans les tissus [28]. Wang et al. ont suggéré que cela peut provoquer des réactions inflammatoires en raison de son diamètre extrêmement petit mais d'une grande surface fonctionnelle de GO [29]. Contrairement aux études précédentes, le dépôt de GO n'a pas été détecté dans notre étude. Étant donné l'absence d'effet secondaire évident observé ici, le potentiel négatif des nanoparticules GO ne peut pas être pris en charge. D'autres études ont suggéré sur le graphène, y compris la réponse biologique et le test de sécurité [30].

La recherche sur l'effet de l'interaction de l'oxyde de graphène sur les cellules est un enjeu important. Le graphène est un matériau biomédical nouvellement développé dont les propriétés suggèrent son utilisation dans de nombreuses applications biologiques. Cependant, la biologie potentielle de la structure du carbone bidimensionnel/la toxicologie du graphène et les interactions biologiques générales ne sont pas entièrement comprises, ce qui nécessitera des études supplémentaires approfondies.

Conclusion

L'oxyde de graphène (GO) montre une biocompatibilité soutenue lorsqu'il est utilisé comme véhicule pour la livraison lente de TIMP-1 recombinant. Il est démontré que le TIMP-1 est libéré en continu de GO jusqu'à 40 jours, et la combinaison de TIMP-1 avec GO favorise la revascularisation et la régénération du collagène dans un modèle de régénération de la peau.