L'administration de nanoparticules d'artésunate améliore l'efficacité antitumorale en activant l'apoptose cellulaire médiée par les mitochondries

Contexte

L'artémisinine et ses dérivés ont été largement utilisés dans le traitement du paludisme en raison de leur activité antipaludique élevée et de leur faible toxicité. Les chercheurs ont également découvert que l'artémisinine et ses dérivés présentaient une activité antitumorale significative en raison de leurs quelques effets secondaires toxiques et d'une plus grande tolérance par les patients [1]. Il a été rapporté que l'artésunate (Ats) inhibait définitivement la croissance des cellules tumorales et induisait en outre des effets anticancéreux significatifs dans les cellules tumorales [2,3,4]. Certaines expériences ont indiqué que l'Ats provoquait différents degrés d'apoptose et d'oncose dans les cellules tumorales après 48 h, et que les degrés d'apoptose et d'oncose dépendaient de la dose d'Ats. À de faibles concentrations, l'Ats n'a pas induit d'apoptose évidente dans les cellules tumorales et la mort cellulaire induite par l'Ats s'est accompagnée d'une mort de type oncose [5,6,7,8]. Afin d'obtenir des effets anti-tumoraux plus importants, une dose plus élevée d'Ats a été appliquée, mais cela a encore confirmé sa toxicité grave et sa suppression de la moelle osseuse. Par conséquent, il est nécessaire de trouver un traitement efficace pour réduire le dosage efficace d'Ats afin d'améliorer son efficacité anti-tumorale [9,10,11]. Il a été découvert que les mitochondries jouaient un rôle important dans la régulation des effets apoptotiques et oncotiques de l'Ats. Les mitochondries étaient également impliquées dans la régulation du processus de transduction d'une grande variété de signaux apoptotiques [12,13,14,15,16,17]. Lorsque les mitochondries étaient attaquées par des médicaments, sa perméabilité était améliorée et le potentiel membranaire diminué, entraînant ainsi un gonflement endométrial de la membrane mitochondriale et la libération rapide du cytochrome C des mitochondries dans le cytoplasme [18,19,20]. De plus, certaines protéines de la famille des caspases ont été activées, et la réaction en cascade d'apoptose cellulaire a été induite.

Pour améliorer les effets anti-tumoraux de l'Ats, de nombreuses nouvelles techniques ont été tentées pour augmenter la distribution du médicament dans les cellules tumorales ou pour améliorer l'administration ciblée de médicaments dans les organites cellulaires pour induire la mort cellulaire [21,22,23]. Les nanoparticules (NP) en tant qu'outil clé dans le traitement ciblé du cancer ont été largement étudiées et elles ont montré un potentiel prometteur. Comme les NP présentaient une taille de particule plus petite et une surface élevée, elles pouvaient entrer dans la circulation sanguine via les capillaires et traverser l'espace des cellules endothéliales et migrer vers le site de la tumeur, réalisant ainsi une distribution ciblée du médicament et améliorant la biodisponibilité du médicament . De plus, les NP pourraient contrôler la libération du médicament par la dégradation du biomatériau selon un schéma long et régulier, prolongeant finalement la demi-vie éliminatoire, améliorant la concentration sanguine efficace et réduisant la fréquence d'administration. Surtout, les NP chargées de médicaments pourraient être délivrées à des emplacements spécifiques dans les cellules, améliorant ainsi l'efficacité du traitement [24,25,26].

Pour renforcer les effets antitumoraux de l'Ats à de faibles concentrations, nous avons essayé de concevoir de nouvelles NP d'albumine sérique bovine (BSA) chargées d'Ats. En raison du faible pH dans les cellules tumorales, de l'accumulation d'un grand nombre de protons d'hydrogène présents sur la membrane mitochondriale externe ou dans l'espace intermembranaire, à l'inverse, la membrane inter mitochondriale est riche en charge négative en raison de sa composition chimique et de sa matrice mitochondriale. sécrétion, qui fait un potentiel transmembranaire extérieur électropositif et négatif intérieur qui peut favoriser la délivrance de BSA. Ensuite, l'accumulation massive d'Ats dans les mitochondries pourrait déclencher efficacement l'apoptose médiée par les mitochondries. Les résultats ont montré que, par rapport à la mort oncotique typique induite par les Ats libres, les Ats étaient spécifiquement transférés dans les mitochondries avec la médiation des NPs BSA et favorisaient l'activation médiée par les mitochondries des protéines caspases liées à l'apoptose. Cela a déclenché une apoptose cellulaire importante, mettant ainsi en évidence la cytotoxicité plus élevée.

Méthodes

Matériaux

BSA a été acheté auprès de Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, États-Unis) et Ats a été acheté auprès de Guilin Pharmaceutical Corporation (Guilin, République populaire de Chine). Les cellules SMMC-7721 et les cellules Plc ont été achetées auprès de l'Institut de biochimie et de biologie cellulaire de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, République populaire de Chine). Tous les autres produits chimiques achetés étaient de qualité analytique ; ils ont été obtenus auprès de divers fournisseurs.

Préparation et caractérisation des NPs BSA chargées par Ats

Selon la littérature précédemment rapportée [27], les NPs de BSA chargées en Ats ont été préparées via une méthode de désolvatation. En bref, les NP de BSA chargées d'Ats ont été préparées en laissant tomber rapidement 1,0 mL d'alcool anhydre contenant une certaine quantité d'Ats dans 0,5 mL de solution de BSA à 37 °C jusqu'à l'opalescence. Avec l'élimination de l'éthanol par évaporation rotative, les NP de BSA chargées d'Ats ont été davantage précipitées du milieu, puis du glutaraldéhyde à 8 % dans de l'eau (0,5 μL/mg de BSA) a été ajouté pour induire la réticulation des particules sous agitation de la suspension sur une période de 24 h. Enfin, les NP ont été collectées et lavées trois fois avec de l'eau déminéralisée pour analyser davantage leurs caractérisations physiques, y compris leur diamètre hydrodynamique, leur indice de polydispersité (PDI), leur potentiel zêta et leur morphologie à l'aide d'un Brookhaven Zetasizer (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, États-Unis). et un microscope électronique à transmission (JEM-1200EX; JEOL, Tokyo, Japon). La détermination de l'efficacité d'encapsulation d'Ats dans les NP de BSA a été estimée à l'aide d'une méthode précédemment rapportée [27].

Dosage MTT

Deux types de lignées cellulaires tumorales, des cellules SMMC-7721 et des cellules Plc, ont été incubées séparément avec 20 % de sérum bovin foetal (FBS). La densité de croissance cellulaire a été ajustée à l × l0 ⁶ cellules/mL par numération cellulaire, puis les suspensions cellulaires ont été diluées à l × l0 ⁵ cellules/mL. Les suspensions diluées ont ensuite été ajoutées séparément dans une plaque à 96 puits (100 μL par puits, environ 1 × 10 ⁴ cellules/puits) pour une incubation continue pendant 24 h à 37 °C dans des conditions de 5 % de CO₂ et 95% O₂ . Le milieu a été remplacé par un milieu sans sérum en présence d'Ats libres ou de NP de BSA chargées d'Ats présentant différentes concentrations d'Ats, et il a ensuite été incubé pendant 24 h. Un total de 50 μL de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) (5 mg/mL) a été ajouté à chaque puits et incubé pendant 4 h pour terminer la culture. Lorsque le colorant tétrazolium MTT a été réduit en son formazan insoluble, des plaques à 96 puits ont été centrifugées à 1000 tr/min pendant 5 min, et le surnageant a été décanté de chaque puits, suivi de l'ajout de 150 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO), qui a complètement dissous les cristaux. L'absorbance de la solution a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Syneray-2 ; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) à 490 nm.

Distribution intracellulaire du groupe BSA NP dans les cellules

Des cellules SMMC-7721 et des cellules Plc en phase logarithmique ont été sélectionnées et traitées par digestion à la trypsine; la concentration cellulaire a été ajustée à l × l0 ⁶ cellules/mL. Ensuite, les cellules cultivées ont été ajoutées dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits pour l'adhérence, et le milieu de culture a été retiré, suivi de l'ajout de BSA NP marqués à la rhodamine B. Le noyau a été coloré au Hoechst (bleu) pendant 15 min à 37 °C, et les mitochondries ont été colorées au Mitotracker Green FM. L'emplacement des NP de BSA dans les cellules a été suivi à l'intérieur des cellules à l'aide d'une microscopie confocale à balayage laser (FluoView FV10i ; Olympus Corporation, Tokyo, Japon).

Changement potentiel de la membrane mitochondriale

JC-1 peut être utilisé pour déterminer les changements dans le potentiel de la membrane mitochondriale. Lorsque le potentiel de la membrane mitochondriale était élevé, JC-1 était capable de traverser librement la membrane cellulaire et formait des agrégats dans les mitochondries, présentant une fluorescence rouge (longueur d'onde d'excitation, 525 nm ; longueur d'onde d'émission, 590 nm); lorsque le potentiel de membrane mitochondriale diminuait, JC-1 était transféré de la matrice mitochondriale au cytoplasme cellulaire pour former un monomère fluorescent vert (longueur d'onde d'excitation, 490 nm; longueur d'onde d'émission, 530 nm). Des cellules SMMC-7721 et des cellules Plc ont été respectivement ensemencées dans des boites confocales pour atteindre une densité de l × l0 ⁶ cellules/mL pour une incubation continue pendant 12 h. Ensuite, le milieu de culture a été jeté et un milieu de culture sans sérum contenant la dispersion d'Ats ou de BSA NP chargées d'Ats a été ajouté dans la boîte. Après 9 h, le milieu a été jeté et les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS, suivi de l'ajout de 2 mL de JC-1 à une concentration de 2 μmol/L ; les cellules ont ensuite été incubées pendant 30 minutes à 37 °C dans des conditions d'obscurité. Un microscope confocal à balayage laser (FluoView FV10i; Olympus Corporation) a été utilisé pour observer les changements d'imagerie dans la membrane mitochondriale.

Mesure de la production de ROS et coloration du réticulum endoplasmique (RE)

Les cellules ont été incubées avec 20% de FBS et la densité de croissance cellulaire a été ajustée à l × l0 ⁶ cellules/mL par nombre de cellules ; puis les suspensions cellulaires ont été diluées à l × l0 ⁵ cellules/mL. Les suspensions diluées ont ensuite été ajoutées dans des plaques à 96 puits (100 μL par puits, environ 1 × 10 ⁴ cellules/puits) pour une incubation continue pendant 24 h à 37 °C sous 5% de CO₂ et 95% O₂ . Deuxièmement, des NP de BSA libres et chargées d'Ats ont été incubées avec les cellules pendant 6, 12 et 24 h, suivies d'une incubation continue avec 10 μM de diacétate de 2,7-dichlorofluorescéine (DCFH-DA ; Sigma-Aldrich Co.) pendant environ 30 min. Un tampon PBS glacé a été utilisé pour laver les cellules trois fois afin d'éliminer les NP non intériorisées. L'intensité de la fluorescence DCF intracellulaire, qui est excitée à 485 nm et émise à 530 nm, a été détectée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Synergy-2 ; BioTek Instruments) pour étudier l'étendue du stress oxydatif. Les groupes de test ont été traités avec des cellules SMMC-7721 et des cellules Plc pendant 24 h, et la sonde ER-Tracker Blue-White DPX (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) a été ajoutée dans les cellules pour une incubation de 30 min. Après avoir jeté la solution de chargement et lavé les cellules avec du PBS, le changement de morphologie du RE a été observé par microscopie confocale à balayage laser.

Évaluation de l'oncose cellulaire et de l'apoptose par cytométrie en flux

Selon le protocole de notre étude précédente [28], un test de coloration à l'annexine V–fluorescéine isothiocyanate (FITC)/iodure de propidium (PI) a été utilisé pour évaluer l'oncose cellulaire et l'apoptose induites par les NPs de BSA libres et chargées en Ats. Les cellules ont été lysées avec de la typsine et ensemencées dans des plaques à six puits à une concentration de l × l0 ⁶ cellules/mL pendant 24 h d'incubation continue. Ensuite, le milieu de culture a été retiré et un milieu sans sérum contenant des NP de BSA libres et chargés en Ats a été ajouté dans les puits. Après traitement, les cellules ont été collectées et mises en suspension dans du tampon Nicoletti (Beijing 4A Biotech Co., Ltd., Pékin, République populaire de Chine) contenant de l'Annexine V marquée au PI et FITC (AV-FITC). Le changement morphologique des cellules a été observé par microscopie confocale à balayage laser. Pour vérifier les taux d'apoptose et d'oncose cellulaire induits par les NP chargées en Ats, les pourcentages de cellules apoptotiques précoces (Q4), oncotiques (Q2), nécrotiques (Q1) et vivantes (Q3) ont été quantifiés par cytométrie en flux.

Analyse Western Blot des protéines liées à l'apoptose et du cytochrome C dans les cellules

Un test western blot a été effectué pour déterminer les niveaux de protéines relatives lorsque des NP libres d'Ats ou chargées d'Ats ont été incubées avec des cellules SMMC-7721 pendant 24 h. Les cellules ont été lysées avec un tampon d'essai de radio-immunoprécipitation (RIPA) glacé contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéase et des inhibiteurs de phosphatase (Roche, Bâle, Suisse). Les concentrations de protéines ont été déterminées à l'aide d'un kit de test BSA modifié (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) et normalisées avant le chargement sur une électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium (SDS)-polyacrylamide (PAGE) à 10 %. Les niveaux des protéines ciblées ont été photographiés et analysés à l'aide d'un système d'analyse sur gel UVP (iBox Scientia 600 ; UVP, LLC., Upland, CA, USA).

Résultats

Caractéristiques des NP BSA chargées par Ats et étude de viabilité cellulaire

Il a été observé sur les figures 1a, b que les NP de BSA chargées en Ats présentaient une forme sphérique et qu'elles étaient dispersées de manière homogène avec un PDI inférieur à 0,016. La taille moyenne des particules des NP de BSA chargées en Ats était d'environ 99,9 ± 2,3 nm et le potentiel zêta était négatif et évalué à environ -25,6 ± 4,3 mV. Le profil de libération a montré une libération douce et soutenue qui a été montrée sur la figure 1c. Par rapport à la libération rapide d'Ats libres dans le milieu in vitro, les Ats piégés dans le noyau des NPs de BSA ont été lentement diffusés de l'intérieur des NPs dans le milieu et ont montré un modèle de libération régulière et soutenue, en raison de la dégradation continue de la BSA. Plus de 85 % des Ats libres ont été complètement libérés au cours des 6 premières heures, tandis que la quantité totale accumulée de médicament libérée par les NP dans les médias au cours d'une période de 48 h était de 78,9 %. Cela indiquait que les NP pouvaient contrôler la libération du médicament via la dégradation des biomatériaux selon un schéma long et régulier, prolongeant ainsi la demi-vie d'élimination, améliorant la concentration sanguine efficace et réduisant la fréquence d'administration.

Caractérisation des NPs BSA chargées en Ats. un Image MET des NPs BSA chargées en Ats. b Analyse de diffusion dynamique de la lumière (DLS) des NP de BSA chargées en Ats. c Le profil de libération in vitro des NP de BSA chargées en Ats dans une solution saline tamponnée au phosphate avec un pH de 7,4 à 37 °C pendant 48 h. Viabilité des cellules SMMC-7721 (d ) et les cellules Plc (e ) après incubation avec différentes quantités de NP de BSA libres et chargées en Ats pendant 24 h. Les données sont présentées comme la moyenne  ± SD (n = 3). ^# P < 0,05 par rapport aux Ats gratuits correspondants

Le MTT a été utilisé pour examiner les effets inhibiteurs des NP de BSA libres d'Ats et d'Ats dans les cellules SMMC-7721 et les cellules Plc à différents intervalles de temps. Les résultats (Fig. 1d, e) ont montré que la cytotoxicité de l'Ats libre augmentait avec l'augmentation de la concentration du médicament, et les NP de BSA chargées en Ats ont montré une cytotoxicité améliorée progressivement. Cela a prouvé que les NP de BSA chargées d'Ats et d'Ats inhibaient la croissance des cellules tumorales et que le taux d'inhibition dépendait de la dose d'Ats. Par rapport aux Ats libres, les NP de BSA chargées d'Ats ont démontré une cytotoxicité et une sensibilité plus élevées dans les deux cellules, et elles ont entraîné une plus grande inhibition cellulaire. Comme le montre la figure 1d, e, le traitement des deux cellules avec des NP de BSA chargées en Ats a entraîné une diminution significative de la viabilité cellulaire à 24 h par rapport à celle des Ats libres. Les valeurs de concentration inhibitrice maximale (IC50) à 50 % pour les cellules SMMC-7721 et les cellules Plc traitées avec des NP de BSA chargées en Ats étaient respectivement de 50,1 et 44,9 μg/mL à 24 h, ce qui est comparé aux valeurs obtenues de 69,2 et 74,9 μg/mL à 24 h dans les cellules traitées avec de l'Ats libre. Cela indiquait que lorsque Ats était chargé dans les NP BSA, il pouvait changer son emplacement intracellulaire, tel que médié par les NP, et finalement tuer plus de cellules.

Captation cellulaire in vitro des NP BSA

La distribution intracellulaire et la localisation des NP de BSA dans les deux types de cellules tumorales ont été observées par microscopie confocale à balayage laser, comme le montre la Fig. 2. Après que les NP marquées à la rhodamine B ont été co-cultivées avec des cellules pendant 3 h, une fluorescence rouge a été clairement observée. dans le cytoplasme; avec le passage du temps, la majorité des NP de BSA ont été intériorisées de manière intracellulaire et diffusées dans le cytoplasme, affichant une fluorescence rouge accrue dépendante du temps. Il a également été observé que les NP de BSA situées dans le cytoplasme avaient été co-localisées avec les mitochondries, comme en témoigne l'apparition d'une fluorescence jaune, qui a servi à indiquer que la fluorescence rouge inhérente des NP marquées à la rhodamine B et la fluorescence verte émise par l'indicateur mitochondrial MitoTracker® green FM avait été fusionné. Cela a prouvé que les NP de BSA intériorisés pouvaient être spécifiquement accumulés dans les mitochondries, soulignant la possibilité que les Ats puissent être délivrés aux mitochondries avec la médiation des NP de BSA.

La distribution cellulaire in vitro des NPs de BSA après avoir été incubées avec différentes cellules tumorales. Image fluorescente des cellules SMMC-7721 (a ) et les cellules Plc (b ). Barre d'échelle , 100 μm

Analyse du potentiel de la membrane mitochondriale

Pour clarifier si les NP de BSA chargées d'Ats interféraient avec la fonction mitochondriale après la livraison d'Ats dans les mitochondries, des changements dans le potentiel de membrane mitochondriale ont été déterminés. La figure 3 a démontré qu'après la coloration JC-1, la majorité des mitochondries dans les cellules tumorales traitées avec des Ats libres présentaient une forte fluorescence rouge et une faible intensité de fluorescence verte. Cela suggérait que la majorité de JC-1 existait dans un état agrégé, renforçant l'intégrité de la membrane mitochondriale et un potentiel plus élevé. Au contraire, lorsque JC-1 a coloré les cellules traitées avec des BSA NP chargées d'Ats, les mitochondries des deux cellules tumorales présentaient une fluorescence verte plus forte, indiquant que la membrane mitochondriale était gravement endommagée et que son potentiel était significativement diminué. Dans l'ensemble, cela a prouvé que l'Ats a été délivré avec succès aux mitochondries avec la médiation des NP de BSA, entraînant une dépolarisation de la membrane mitochondriale.

Modification de l'imagerie du potentiel membranaire mitochondrial après incubation de NPs de BSA libres Ats et Ats avec des cellules SMMC-7721 et des cellules Plc. Barre d'échelle , 100 μm

Mesure de la production de ROS et coloration du RE

Il a été largement confirmé que la génération d'un grand nombre de ROS peut provoquer une peroxydation des phospholipides dans la membrane mitochondriale interne et qu'elle peut également induire une diminution du potentiel de la membrane mitochondriale, entraînant ainsi la libération rapide du cytochrome C. Nous avons utilisé DCFH- DA comme sonde fluorescente pour détecter le changement de ROS. Le DCFH-DA est passé librement à travers la membrane cellulaire dans la cellule et a été transformé en DCFH par hydrolyse d'estérase. Le DCFH généré ne peut pas traverser la membrane cellulaire et peut être facilement chargé dans les cellules. Les ROS intracellulaires ont oxydé le DCFH non fluorescent en DCF de couleur verte fluorescente. Par conséquent, la détection par fluorescence DCF peut indiquer le niveau de ROS intracellulaire.

Lorsque les deux cellules ont été traitées avec des NP de BSA libres et chargées d'Ats pendant une certaine période de temps, la quantité de ROS intracellulaires avait également augmenté, montrant une relation dépendante du temps. Par rapport aux Ats libres, la génération de ROS dans les cellules SMMC-7721 et les cellules Plc traitées avec des BSA NP chargées d'Ats a été considérablement améliorée. Les figures 4a ont démontré que les niveaux de ROS dans les cellules SMMC-7721 et les cellules Plc exposées à des NP de BSA chargées en Ats pendant 48 h avaient été respectivement multipliés par 1,53 et 1,28, par rapport aux cellules SMMC-7721 et aux cellules Plc traitées. avec Ats gratuit. Cela soutenait l'idée que les NP accéléraient la production de ROS intracellulaires. Par rapport au groupe témoin et aux Ats libres, et après avoir été traité avec des NP de BSA chargées en Ats, l'intensité de la coloration de fluorescence du ER-Tracker Blue-White DPX en tant que colorant spécifique au RE a été significativement augmentée, ce qui suggère que le stress du RE a également été déclenché. dans les cellules traitées avec des NP chargées d'Ats avec une augmentation correspondante du niveau de ROS. Cette découverte a mis en évidence que l'Ats était spécifiquement localisé dans les mitochondries, tel que médié par les NP de BSA ; cela a conduit à une augmentation significative du niveau de radicaux libres d'oxygène dans les cellules, déclenchant ainsi l'induction du stress du RE et activant la voie mitochondriale pour induire l'apoptose cellulaire dépendante de la caspase.

Quantification de la génération de ROS dans les cellules traitées avec des NP de BSA libres d'Ats et chargés d'Ats à différents moments (a ). Coloration ER avec la sonde ER-Tracker Blue–White DPX (b ). Barre d'échelle , 100 μm. Les données sont présentées comme la moyenne  ± SD (n = 3). ⁺ P < 0,05 versus le groupe témoin à 12 h, *P < 0,05 par rapport au groupe témoin à 24 h, ^# P < 0,05 versus le groupe témoin à 24 h

Évaluation de l'apoptose et de la nécrose cellulaires

Les cellules ont été traitées par un test de coloration à l'Annexine V-FITC/PI. Les cellules vivantes ne se sont pas liées à l'Annexine V-FITC/PI, donc aucune fluorescence n'est apparue. Les cellules apoptotiques ne se sont pas liées au PI, mais elles ont été colorées avec l'Annexine V-FITC, produisant une fluorescence verte. Au contraire, pour les cellules oncotiques, leurs membranes cellulaires ont été endommagées dans une certaine mesure, et les noyaux cellulaires ont été dilatés pour se briser en morceaux, montrant ainsi à la fois une fluorescence verte et rouge. Comme le montre la figure 5a, par rapport au groupe témoin, lorsque les NP libres d'Ats et chargées d'Ats ont été incubées avec des cellules pendant 24 h, une forte fluorescence verte et rouge a été observée dans les cellules, indiquant que les NP de BSA libres d'Ats et chargées d'Ats induit l'oncose et l'apoptose des cellules tumorales. Surtout après avoir été traité avec des NPs de BSA chargées en Ats, les intensités de fluorescence de coloration obtenues à partir de l'Annexine V-FITC et PI avaient été significativement augmentées, suggérant que les degrés d'oncose et d'apoptose étaient significativement améliorés dans les cellules traitées avec les NPs chargées en Ats.

Morphologie des changements ultrastructuraux des cellules traitées avec des NP de BSA libres et chargées d'Ats en utilisant le test de coloration à l'Annexine V-FITC/PI (a ). Barre d'échelle , 100 μm. Analyse par cytomètre de flux de l'apoptose et de l'oncose cellulaires après 24 h d'incubation avec les NP de BSA libres et chargées en Ats, respectivement (b )

Les pourcentages de cellules apoptotiques précoces (Q4), oncotiques (Q2), nécrotiques (Q1) et vivantes (Q3) ont été présentés sur la figure 5b. Cette découverte a démontré que lorsque les cellules étaient traitées avec des Ats libres, les taux oncotiques étaient progressivement augmentés à 24,4 et 4,6 %, et le taux d'apoptose restait à 4,9 et 7,1 % dans les cellules SMMC-7721 et les cellules Plc, respectivement, suggérant que les Ats libres déclenchaient l'apparition d'oncose et d'apoptose pour conduire à la mort cellulaire. Au contraire, les NP de BSA chargées en Ats ont amélioré de manière significative le taux d'apoptose et d'oncose cellulaire. Les rapports apoptotiques ont été significativement augmentés à 10,9 % dans les cellules SMMC-7721 et à 11,5 % dans les cellules Plc. Les rapports oncotiques ont été augmentés à 29,0 % dans les cellules SMMC-7721 et à 21,6 % dans les cellules Plc. Cela indiquait que la livraison mitochondriale d'Ats avec la médiation des NP de BSA accélérait la mort des cellules tumorales en améliorant les effets oncotiques et apoptotiques. Les NP de BSA chargées en Ats ont déclenché le processus de transduction du signal apoptotique et favorisé la réaction en cascade de l'apoptose cellulaire à médiation mitochondriale.

Analyse Western Blot

Pour explorer la dépendance de la mort cellulaire vis-à-vis de l'apoptose induite par les NP libres d'Ats et chargées d'Ats, un test de western blot a été réalisé pour détecter l'expression des protéines d'apoptose. Il a été constaté que dans les cellules SMMC-7721 traitées avec des NPs chargées en Ats, le niveau d'expression intracellulaire de la protéine Bax était significativement augmenté (Fig. 6). Cette découverte suggère qu'avec l'aide des NPs BSA, l'Ats s'accumule dans les mitochondries et provoque un dysfonctionnement mitochondrial. La protéine monomère cytoplasmique Bax a été transférée à la membrane externe des mitochondries et a subi une oligomérisation, formant un canal protéique dans la membrane externe des mitochondries, entraînant ainsi une augmentation de la perméabilité membranaire. Le niveau d'expression du cytochrome C dans le cytoplasme était également particulièrement et significativement amélioré, et les expressions de la caspase-3 et de la caspase-9 se sont avérées montrer une tendance à la hausse. Par conséquent, en raison de la perméabilité membranaire plus élevée des mitochondries, le cytochrome C a été rapidement libéré dans le cytoplasme, activant les protéines de signalisation de la mort cellulaire (caspases) et favorisant la réaction en cascade de l'apoptose cellulaire. En revanche, les Ats libres n'avaient pas de différence significative sur l'expression des protéines liées à l'apoptose et du cytochrome C, suggérant que les Ats libres ne déclenchaient pas l'apoptose cellulaire médiée par les mitochondries et qu'elles reposaient principalement sur l'oncose pour conduire à la mort cellulaire. Les NP de BSA ont amélioré l'accumulation du médicament dans les mitochondries et activé les effets apoptotiques à médiation mitochondriale, conduisant ainsi à une apoptose significative et augmentant les expressions des protéines primaires pertinentes pour l'apoptose, comme le montrent nos analyses de transfert de Western.

Analyses Western blot des niveaux d'expression de la caspase-3 clivée, de la caspase-9, de Bax et du cytochrome C dans les cellules SMMC-7721. *P <0,05 par rapport à l'expression de la protéine Bax du groupe témoin ; ^# P <0,05 par rapport à l'expression de la caspase-3 clivée du groupe témoin ; ⁺ P <0,05 par rapport à l'expression de la protéine caspase-9 du groupe témoin ; ^x P <0,05 par rapport à l'expression de la protéine cytochrome C du groupe témoin. Les données ont été présentées comme la moyenne  ± SD (n = 3)

Discussion

L'oncose et l'apoptose représentent les deux manières différentes dont les cellules subissent la mort. L'apoptose est un processus actif de mort cellulaire programmée qui se produit dans les organismes multicellulaires. L'oncose, quant à elle, décrit une mort cellulaire indépendante de la caspase qui se caractérise par un gonflement, une perméabilité accrue et une rupture de la membrane, souvent appelée nécrose. On pense que cette forme de mort cellulaire est accidentelle et incontrôlée. Sur la base de notre enquête, nous avons constaté que l'Ats inhibait la croissance des cellules tumorales et que le taux d'inhibition dépendait de la dose d'Ats. Les ats dépendaient principalement du degré d'oncose et conduisaient à la mort cellulaire; il a également activé la mort cellulaire indépendante de la caspase sous forme d'oncose. À l'inverse, et indépendamment de la survenue d'une mort évidente semblable à une oncose, lorsque les cellules tumorales ont été traitées avec des NP de BSA chargées en Ats, les NP de BSA chargées en Ats ont été internalisées dans le cytoplasme et ont été rapidement localisées dans les mitochondries pour libérer Ats, comme médié par les NP. Les ats dans les mitochondries ont généré des ROS et déclenché un stress du RE ; il a en outre activé la voie apoptotique des cellules dépendantes de la caspase médiée par les mitochondries en réduisant le potentiel de la membrane mitochondriale, en libérant le cytochrome C et en favorisant les expressions protéiques de Bax, de la caspase 3 clivée et de la caspase 9. Pris ensemble, les NP de BSA chargées en Ats ont augmenté le l'administration mitochondriale d'Ats et a amélioré le degré d'oncose et d'apoptose pour induire la mort cellulaire, augmentant ainsi la cytotoxicité du médicament et induisant une mort cellulaire significative.

Conclusions

En bref, nous avons clarifié que les Ats libres dans les cellules tumorales dépendaient fortement du degré d'oncose pour inhiber la prolifération des cellules tumorales sous la forme d'une mort semblable à une oncose ; ainsi, la cytotoxicité du médicament était limitée et indésirable. En revanche, les NP de BSA chargées en Ats ont activé la voie apoptotique mitochondriale et déclenché simultanément des effets oncotiques; ensemble, ils ont amélioré l'efficacité anti-tumorale synergique d'Ats. The results of this study highlighted the significance of Ats-loaded BSA NPs in the enhancement of the cytotoxic and apoptotic effects of Ats, and they further signify the role of BSA NPs in diversifying the pathways of cell death induced by Ats. Compared with free Ats, Ats-loaded BSA NPs induced greater cytotoxicity and significant cell apoptosis effects in tumor cells.