Un nanobiocapteur d'or basé sur la résonance plasmonique de surface localisée est capable de diagnostiquer la brucellose humaine, introduisant une méthode rapide et abordable

Introduction

Les brucelles sont des coccobacilles à croissance lente à Gram négatif appartenant à la famille des brucellacées [1]. Les brucelles comprennent des bactéries intracellulaires facultatives qui infectent une variété d'animaux domestiques et sauvages [2]. La découverte de nouveaux types de brucelles ces dernières années a considérablement élargi le genre. Il existe actuellement douze espèces du genre, dont quatre comprennent Brucella. melitensis , B. avorter , B. suis , et B. canis sont les principales causes de la maladie chez l'homme [3]. B. melitensis est considérée comme l'espèce la plus virulente chez l'homme [3]. Même si la brucellose ne cause pas la mort chez l'homme et n'est qu'un cas exceptionnel de transmission interhumaine, l'épidémie incessante de brucellose humaine dans le monde entraîne de graves problèmes de santé publique et des dommages économiques en raison de la perte de productivité des animaux. Il est important de noter que le potentiel d'affaiblissement de la brucellose chez l'homme et le protocole de traitement compliqué de la maladie ont fait de ces bactéries des agents candidats de la guerre biologique [4, 5].

La brucellose chez l'homme est qualifiée de « maladie des erreurs » [6] parce que sa présentation clinique est non spécifique et chevauche un large éventail d'autres maladies ; par conséquent, la corroboration du diagnostic en laboratoire est essentielle pour le traitement correct d'un patient [7, 8]. Bien que la culture, les tests sérologiques et les tests d'amplification des acides nucléiques puissent permettre le diagnostic de brucellose, ces méthodes ont de nombreuses limites. Dans la culture, en tant qu'étalon-or, la principale limitation qui retarde le diagnostic et le traitement appropriés du patient est le long temps d'incubation. Les systèmes d'hémoculture automatisés avancés (par exemple, les systèmes Bactec et BacTAlert) peuvent détecter les cas aigus de brucellose, mais ils nécessitent 5 à 7 jours d'incubation, et même l'incubation et la performance des sous-cultures en aveugle pour les échantillons prolongés doivent être prolongées [9]. Le manque de spécificité et les résultats faussement positifs, en particulier chez les individus exposés à plusieurs reprises à des germes Brucella, sont les principales limites des tests sérologiques [9, 10]. Bien qu'elles aient une excellente sensibilité, spécificité, sécurité et diagnostic rapide de la maladie par des tests d'amplification d'acide nucléique, l'importance clinique de ces méthodes et leurs implications thérapeutiques limitées ne sont pas claires en raison de la persévérance à long terme des résultats positifs des tests biomoléculaires chez les patients. qui ont complètement récupéré [9, 11]. Par conséquent, il est nécessaire de concevoir une méthode capable de surmonter toutes les limitations de test mentionnées ci-dessus, et en même temps, d'améliorer leurs avantages.

L'amélioration des dispositifs de biodétection avec de faibles limites de détection est devenue une composante importante des recherches sur la détection de biomarqueurs car au cours de la dernière décennie, un grand nombre d'études ont été consacrées à la recherche de procédures appropriées pour améliorer la sensibilité de différentes plates-formes de détection en biodétection [12, 13] . Les biocapteurs sont utilisés pour détecter et quantifier un analyte en générant un signal à partir d'interactions qui incluent des composants biologiques. Récemment, la sensibilité accrue des transducteurs optiques combinée à la spécificité incomparable des interactions biomoléculaires a conduit au développement de nombreux biocapteurs optiques différents [14]. En raison de la facilité d'application, de la sensibilité aux basses températures et de la génération de signal fiable, comme en témoigne un décalage vers le rouge de la bande d'absorption en réponse aux interactions biologiques, les tests basés sur les propriétés optiques uniques des nanoparticules sont rentables pour la détection de marqueurs biologiques [ 15,16,17]. Ces méthodes de détection utilisent les caractéristiques biophysiques de molécules telles que le poids moléculaire, la charge et l'indice de réfraction pour surveiller l'activité d'une molécule particulière. La résonance plasmonique de surface est un phénomène causé par l'oscillation collective des électrons de surface après exposition à la lumière incidente qui a été utilisée pour détecter rapidement et facilement les biomolécules liées à la surface [18, 19]. La SPR se compose de deux méthodes principales, localisée (LSPR) ou propagée (PSPR) [20, 21]. Parmi eux, les biocapteurs optiques basés sur des plasmons de surface localisés se sont remarquablement développés en raison de leur potentiel applicatif important [12, 22]. Cette technique provient de l'interaction entre les électrons de surface des nanoparticules conductrices, qui sont plus courtes que la longueur d'onde de la lumière incidente, et l'onde lumineuse se produisant lorsque dans la bande de conduction la lumière incidente interagit avec les électrons de surface [23, 24]. Par rapport à d'autres plates-formes similaires, les biocapteurs localisés basés sur la résonance plasmonique de surface présentent plusieurs avantages (par exemple, la résonance plasmonique de surface), tels qu'une longueur de décroissance du champ électromagnétique plus courte, une insensibilité aux altérations de l'indice de réfraction en vrac causées par les variations de température ou les composants du milieu environnant et capacité d'être excité par la lumière se propageant librement [12]. Par conséquent, dans la technologie des nanobiocapteurs, les nanobiocapteurs à base de LSPR sont considérés comme l'un des outils les plus puissants pour détecter les biomolécules.

Bref, d'une part, les stratégies de laboratoire restent la base principale du diagnostic de la brucellose. D'autre part, les méthodes cliniques actuelles sont confrontées à de nombreuses limitations. Par conséquent, proposer une nouvelle méthode alternative qui peut surmonter les lacunes des techniques existantes est considéré comme l'une des principales composantes des protocoles de traitement. Par conséquent, cette étude visait à introduire un nanobiocapteur à base de LSPR rapide, pratique, peu coûteux, sûr et sensible pour détecter les anticorps anti-Brucella dans des échantillons biologiques pour le diagnostic de la brucellose. À cette fin, les lipopolysaccharides (LPS) de B. melitensis et B. abortus ont été recouverts de nanoparticules d'or (PNB) et la spécificité, la sensibilité, la valeur prédictive positive (VPP) et la valeur prédictive négative (VPN) de la technique ont été évaluées. en comparant les résultats obtenus par rapport au dosage de la culture sérique. En outre, la présente étude a effectué un test immuno-enzymatique pour mesurer les anticorps anti-Brucellae (à la fois IgM et IgG) et un test d'agglutination en tube standard pour évaluer la capacité de la technologie actuellement conçue à détecter la brucellose par opposition aux méthodes conventionnelles.

Méthodes

Culture bactérienne et extraction de LPS

Les souches lisses de B. melitensis et B. avorter ont été cultivés à Luria-Bertani [3] gélose. Dans l'étape suivante, les bactéries ont été récoltées et les LPS ont été extraits à l'aide d'une méthode modifiée à l'eau de phénol chaud [25]. Pour confirmer la qualité du LPS extrait, une électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) avec coloration au nitrate d'argent a été appliquée. La quantification du LPS a été réalisée en utilisant du bleu de 1,9-diméthyl méthylène (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) en utilisant Salmonella typhimurium comme norme. Pour évaluer la contamination par les protéines et les acides nucléiques, la méthode de Bradford et l'absorbance à 260 nm ont été utilisées.

Synthèse de nanoparticules d'or sphériques

Une réduction chimique du sel d'or (HAuCl₄ ) a été utilisé pour synthétiser les nanoparticules d'or qui est une procédure de synthèse rapide, peu coûteuse et verte pour les nanoparticules d'Au à température ambiante [26]. Selon la méthode décrite, 15 mg de citrate de sodium (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) ont été dissous dans 50 ml d'eau distillée déminéralisée et ont été conservés dans un bain de glace et mélangés sur un agitateur magnétique (150 tr/min) . En même temps, 600 µl de solution de sel d'or (17,3 mM) ont été ajoutés. Ensuite, 1,2 ml de solution de borohydrure de sodium (20 mM) a été ajouté. La solution a été mélangée pendant 2 h dans des conditions similaires, puis maintenue à 4 °C pour une application ultérieure. Selon des études antérieures, dans ce type de synthèse, le citrate de sodium agit simultanément comme agent réducteur (conduisant la réduction de AuIII en Au0), agent de coiffage (stabilisant électrostatiquement la solution colloïdale de nanoparticules d'or) et médiateur du pH (modifiant la réactivité de Au espèces impliquées dans la réaction). Dans cet essai, la production d'une solution de couleur rouge à partir d'une solution de couleur jaune de HAuCl4 montre la formation d'or dans un état d'oxydation zéro.

La microscopie électronique à balayage (MEB) a été utilisée pour étudier la morphologie des nanoparticules d'or, et Zetasizer NanoZS90 (Malvern Instruments Ltd, Malvern, Worcestershire, Royaume-Uni) a été utilisé pour évaluer la distribution des tailles. La diffusion dynamique de la lumière (DLS), à un angle de diffusion de 90º, a été utilisée comme principe de base pour mesurer la taille des particules. Zetasizer Nano a utilisé un laser avec une longueur d'onde de 633 nm. Avec cette technique, la propagation des particules causée par le mouvement brownien est mesurée et convertie en distribution de taille par la relation de Stokes-Einstein [27]. Le potentiel Zeta a également été appliqué pour déterminer la charge électrique de surface des nanoparticules. Les spectres d'absorption des nanoparticules ont été enregistrés par un spectrophotomètre Cary 500 UVeviseNIR (ultra-violet-visible proche infrarouge) (Varian, Australie).

Construction de Nanosonde (Biocapteur)

Carboxylation des nanoparticules d'or

Des nanoparticules d'or ont été recouvertes de lieurs d'acide thioglycolique pour préparer la surface des PNB pour le chargement du LPS. En bref, 1 ml de solution de TGA (1 mM) a été mélangé avec 1 ml de solution de nanoparticules d'or et maintenu à température ambiante pendant 24 h. Pour l'isolement des nanoparticules d'or enrobées, la solution a été centrifugée à 12 000 g pendant 15 min. Après cela, deux étapes de lavage par de l'eau désionisée bidistillée ont été utilisées pour éliminer l'excès de TGA. Enfin, la spectrophotométrie a été utilisée pour évaluer le revêtement d'acide thioglycolique à la surface des PNB.

Optimisation du revêtement d'acide thioglycolique sur des nanoparticules d'or

Le revêtement de TGA a été effectué à différents moments, y compris 12, 18, 24, 36 et 48 h pour optimiser le rapport de revêtement de TGA sur les nanoparticules d'or. Par la suite, la densité optique a été mesurée et représentée graphiquement pour obtenir le meilleur temps d'incubation.

Fixation covalente de LPS aux nanoparticules d'or modifiées par TGA

Pour stimuler la fixation covalente entre le groupe carboxyle du TGA et le groupe amine du LPS, les groupes carboxyle ont été activés par les molécules d'EDC (l'agent de réticulation de longueur zéro le plus populaire pour les conjugaisons biochimiques) et de N-hydroxysuccinimide (NHS) [28]. Des nanoparticules d'or sédimentées ont été mises en suspension dans une solution EDC/NHS 0,1 mM et incubées pendant 30 min à température ambiante. Dans l'étape suivante, 2 ml de tampon phosphate salin (PBS) contenant 0,05 % de Tween-20 (PBST) (pH 7,4) ont été ajoutés. Après un vortex vigoureux, les nanoparticules ont été centrifugées à 12 000 tr/min pendant 15 min. Après centrifugation, la solution de LPS a été ajoutée après élimination du surnageant. Par la suite, le mélange a été incubé dans un bain à ultrasons pendant 10 min suivi d'une incubation de 3 h à température ambiante. Après cela, 2 ml de PBST ont été ajoutés et vortexés vigoureusement, suivis d'une centrifugation pendant 15 minutes à 12 000 tr/min, et le surnageant a été retiré. Enfin, les nanosondes ont ensuite été remises en suspension dans 500 µl de PBS et les spectres LSPR ont été mesurés au spectrophotomètre. Après la confirmation de l'attachement du LPS aux nanoparticules d'or, la solution a été maintenue à 4 °C pour des études ultérieures. La figure 1 montre les équations d'interaction chimique de la synthèse de nanoparticules d'or modifiées par TGA et de la fixation du LPS.

Interactions chimiques de l'attachement du LPS aux nanoparticules d'or. Un Molécule TGA, B Interaction EDC + NHS, et C Attachement covalent du LPS à des nanoparticules d'or modifiées par TGA. Numéro 1 :nanoparticules; numéro 2 :LPS

Optimisation de la concentration en LPS

Pour maximiser la liaison du LPS aux groupes carboxyle TGA activés, l'optimisation du rapport nanoparticule LPS/Au a été réalisée en évaluant le décalage de pic dans les spectres LSPR en fonction des concentrations de LPS (100, 150, 200, 300 et 560 µg /ml) dans une quantité fixe de nanoparticules Au.

Détection d'anticorps anti-LPS par Nanoprobe

100 ul des échantillons dilués (1 : 50 dans du PBS) ont été mélangés avec 200 ul du biocapteur et mélangés par pipetage. Dans l'étape suivante, les biocapteurs ont été centrifugés à 12 000 g pendant 15 min après 30 min d'incubation à température ambiante. Enfin, les biocapteurs ont été suspendus dans 200 ul de PBS, et l'absorbance a été mesurée comme décrit précédemment. Pour valider la fonction du nanobiocapteur, des contrôles positifs et négatifs ont également été fournis à partir d'un kit ELISA disponible dans le commerce (Pishtazteb Zaman, Iran).

Déclaration d'éthique

L'utilisation de sérums humains a été approuvée par les comités d'éthique de l'Université des sciences médicales de Fasa, en Iran (IR.FUMS.1396.324). Les identités des donneurs de sérums ont été codées et n'ont été révélées à personne impliquée dans cette étude. De plus, toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives éthiques conformément aux réglementations nationales. De plus, tous les échantillons provenaient de sujets qui avaient signé le consentement éclairé écrit.

Évaluer la fonction de la méthode conçue

Quarante échantillons contenant 20 cas (vrais positifs) et 20 témoins (vrais négatifs) ont été fournis pour évaluer la fonctionnalité de la méthode conçue. Pour cette raison, les performances de la méthode conçue dans la présente étude ont été comparées aux résultats de la culture. De plus, des kits commerciaux disponibles (Pishtaz Teb, Téhéran, Iran) ont été utilisés pour évaluer les taux sériques d'anticorps IgM et IgG. La préparation des échantillons et l'évaluation des anticorps ont été réalisées selon le protocole du fabricant (Spécificité :99,85 %, Sensibilité :99,4 %). De plus, le test d'agglutination en tube standard a été effectué sur tous les échantillons de sérum pour comparer et valider les performances de la méthode basée sur la LSPR. Pour évaluer les performances de la méthode conçue, les résultats obtenus à partir de la méthode LSPR ont été comparés aux tests conventionnels mentionnés avec le calcul de la sensibilité, de la spécificité, de la valeur prédictive positive et de la valeur prédictive négative sur la base de la formule commune suivante :

Analyse statistique

Cette étude a été analysée comme une expérience de performance diagnostique classique en évaluant la concordance d'un test proposé, le LSPR-nanosensor, et d'un test standard de référence, la culture, et de certains tests conventionnels dont ELISA et SAT pour déterminer leur capacité à identifier une condition cible. . Les valeurs seuil ont été calculées par la moyenne des sérums témoins (vraiment négatifs) plus des valeurs d'écart type à deux temps (2SD). Le test de Kolmogorov-Smirnov a été réalisé pour déterminer la normalité et évaluer la distribution des données. Sur la base des résultats de normalité, qui ont révélé la distribution paramétrique, le test ANOVA a été utilisé pour comparer les groupes. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism pour Windows version 8 et SPSS pour Windows version 9.

Résultats

Analyse d'extraction de lipopolysaccharides

SDS-PAGE a montré que le rendement de l'extraction du LPS était d'environ 1 pour cent du poids humide des bactéries utilisées. De plus, la concentration en acide nucléique était 0,2 % de la concentration en LPS. Fait important, la méthode de Bradford a démontré l'absence de toute contamination protéique.

Caractérisation des nanoparticules d'or

La distribution de taille des nanoparticules détermine la qualité d'un biocapteur. Selon les études précédentes, les nanoparticules doivent posséder une taille spécifique. À cet égard, la petite taille appropriée des nanoparticules entraîne une stabilité colloïdale appropriée, des rapports surface-volume élevés et un mouvement rapide pour des taux de liaison élevés entraîne une affinité élevée, une sensibilité élevée et une sélectivité élevée en interaction avec des cibles biologiques. De plus, les nanoparticules doivent être aussi grandes que possible pour permettre la présence de divers ligands à la surface de la particule et obtenir également des interactions multivalentes [29,30,31]. Comme Gu et al. rapporté, la comparabilité de la taille des nanoparticules avec la taille des cibles biologiques est particulièrement importante dans l'interaction des protéines [32]. Selon la taille des anticorps anti-Brucella, qui est de 2 à 5 nm [33], cette étude a préparé des nanoparticules d'or d'une taille moyenne de 10 nm et a effectué la détermination de la distribution de la taille des nanoparticules par un instrument Zetasizer NanoZS90, qui utilise un laser avec une longueur d'onde de 633 nm. Cette technique bénéficie de l'équation de Stokes-Einstein qui peut convertir la diffusion des particules, causée par le mouvement brownien en une distribution de taille. Selon la figure 2, les PNB étaient uniformément distribués à une échelle de 10 nm. Les valeurs du potentiel Zeta ont révélé des détails sur la charge de surface et la stabilité des PNB. Les particules étaient chargées négativement et leur potentiel zêta était d'environ - 28 mV. De plus, le tableau 1 montre la longueur d'onde d'absorbance maximale des PNB. Les longueurs d'onde visuelles et ultraviolettes ont été mesurées par spectrophotomètre et l'absorbance maximale était de 530 nm. Nous avons utilisé la méthode Turkevich pour produire des nanoparticules d'or. Les avantages de cette méthode sont la production de nanoparticules d'or, notamment un processus de production facile et peu coûteux, la capacité de contrôler la taille des nanoparticules et une bonne stabilité colloïdale [34].

Structure de nanoparticules d'or sous MEB. La répartition égale des nanoparticules d'or est bien reflétée dans la figure

Caractérisation de la Nano-bio-Sonde

Comme mentionné ci-dessus, cette étude a utilisé des molécules de TGA pour connecter les nanoparticules d'or au LPS, ce qui a entraîné une légère diminution de 4,55 % du pic LSPR à 530 nm. En outre, la présente étude a effectué plusieurs temps d'incubation pour déterminer l'adhérence maximale du TGA aux nanoparticules d'or. D'après les résultats présentés sur la figure 3, 24 h d'incubation de TGA avec des GNP ont entraîné le revêtement maximal de TGA à la surface des nanoparticules d'or.

Optimisation du revêtement d'acide thioglycolique sur des nanoparticules d'or. Comme le montre la figure, il n'y a pas d'altération significative de l'absorbance après 24 h d'incubation malgré l'allongement du temps adjacent. Par conséquent, 24 h a été sélectionné comme temps optimisé pour le revêtement d'acide thioglycolique sur les PNB. Le Y -L'axe montre l'intensité d'absorbance à 530 nm (absorbance maximale des nanoparticules). Les expériences ont été faites en triple. Les données sont présentées sous forme de moyenne  ± SEM. a.u. :unité d'absorbance

En ce qui concerne la détermination de la concentration optimisée de LPS, la présente étude a étudié des concentrations comprenant 100, 150, 200, 300 et 560 ug/ml. Comme le montre la figure 4, à mesure que la concentration augmente, l'absorbance diminue. Selon les résultats, la présente étude a sélectionné une concentration de 300 ug/ml de LPS pour recouvrir la surface des PNB modifiés par TGA, car il n'y a pas eu de diminution notable de l'intensité du pic d'absorption en augmentant la concentration de LPS.

Optimisation de la concentration en LPS. Au fur et à mesure que la concentration de LPS augmentait, l'absorbance diminuait de manière significative. Cependant, lors de l'augmentation des concentrations de LPS de plus de 300 mg/ml, il n'y a pas eu de réduction significative de l'absorbance du LSPR. Par conséquent, la concentration mentionnée a été sélectionnée comme concentration optimisée. Le Y -L'axe montre l'intensité d'absorbance à 530 nm (absorbance maximale des nanoparticules). Les expériences ont été faites en triple. Les données sont présentées sous forme de moyenne  ± SEM. a.u. :unité d'absorbance

Évaluation des fonctions de la nano-bio-sonde

Comme la technique LSPR est une méthode optique sensible à la surface, elle peut détecter l'interaction entre les anticorps anti-LPS et les antigènes à la surface des nanoparticules d'or à travers l'image des altérations du pic d'absorption LSPR qui est causée par l'interaction électrostatique entre l'anticorps et antigène. Pour confirmer le bon fonctionnement du biocapteur, cette étude a préparé un contrôle positif composé d'anticorps anti-Brucella LPS avec un titre de 1:80 et un contrôle négatif, et a enregistré le spectre LSPR du biocapteur après incubation avec les contrôles. Comme le montre la figure 5, l'incubation avec un contrôle négatif n'a pas affecté l'absorbance du LSPR. Cependant, l'incubation avec un contrôle positif a provoqué un décalage de l'absorbance maximale du LSPR, anciennement connue sous le nom de décalage vers le rouge. Par conséquent, la liaison des anticorps anti-Brucella aux antigènes LPS limite l'incidence de la lumière frappante à la surface des nanosondes.

Pic de la nanosonde LSPR en présence de contrôles positifs et négatifs. Les contrôles ont été fournis à partir de kits ELISA disponibles dans le commerce

Détermination de la valeur seuil

A cet effet, cette étude a obtenu 40 sérums de vrais sujets positifs et négatifs sur la base de la culture et des observations cliniques. Comme le montre la Fig. 6, la moyenne du décalage vers le rouge dans les échantillons vrais négatifs (contrôles) était de 1,70 nm, ce qui était significativement différent des vrais patients positifs (P valeur < 0,001). De plus, les résultats ont indiqué que le décalage vers le rouge de 4,38 nm devrait être utilisé comme valeur de coupure. Fait intéressant, seulement 5 % des témoins présentaient un décalage vers le rouge au-dessus de la valeur seuil, et le décalage vers le rouge chez tous les patients était supérieur à la valeur seuil, ce qui indique que les performances de la méthode sont acceptables et que la détermination de la valeur seuil est fiable.

Le décalage vers le rouge du pic LSPR dans les sérums de vrais patients et de sujets témoins. Lors de l'interaction entre les anticorps, qui se sont présentés dans les sérums d'individus infectés, un décalage vers le rouge s'est produit qui était significativement différent par rapport aux témoins. De plus, la figure montre les valeurs SD et 2SD qui sont précieuses pour la définition du point de coupure. Les expériences ont été réalisées en triple pour chaque échantillon. P valeur < 0,05 a été considérée comme significative

Validation de la fonction du biocapteur

Dans les étapes précédentes, cette étude a introduit une méthode rapide et peu coûteuse pour identifier les anticorps anti-Brucella dans les échantillons. Cependant, la vérification de la fonctionnalité d'une nouvelle méthode est nécessaire. À cette fin, cette étude a mené une série de sous-études comprenant un test d'agglutination en tube standard, les niveaux d'anti-IgG et d'anti-IgM dans les sérums d'échantillons négatifs et positifs sur la base des résultats de la culture. Comme le montre le tableau 2, la sensibilité de la méthode actuelle était inférieure à celle de la SAT seule. Il est important de noter que la spécificité de la méthode basée sur le LSPR a montré le résultat le plus acceptable qui était de 100 %. Semblable à la spécificité, la valeur prédictive positive de la méthode actuelle était plus élevée que d'autres tests conventionnels (100 %). En fin de compte, la VPN des méthodes SAT, IgG, IgM et LSPR était de 90 %, 90 %, 81 % et 86 %, respectivement.

Discussion

La brucellose est probablement considérée comme la première infection humaine après la domestication des bovins, ovins et caprins [35]. La brucellose est la zoonose bactérienne la plus répandue au monde avec 500 000 nouveaux cas humains de la maladie diagnostiqués dans le monde chaque année [9, 36]. Les symptômes de la brucellose humaine ne sont pas pathognomoniques car l'infection peut affecter n'importe quel organe du corps [37]. Bien que les résultats de laboratoire soient toujours un facteur fiable dans la détection de la maladie, les stratégies actuelles comprenant la culture, la sérologie et les tests d'amplification d'acide nucléique ont montré de sérieux défauts [9, 38, 39, 40]. Par conséquent, cette étude tente d'introduire une nouvelle méthode de diagnostic basée sur le LSPR pour éliminer les limitations.

Ces dernières années, la résonance plasmonique de surface localisée a été utilisée comme base pour le développement de biocapteurs. Les avantages de la recherche actuelle sur les nanoparticules d'or et les progrès de la nanotechnologie ont été considérés comme les principaux facteurs d'amélioration des performances diagnostiques. La couleur et les propriétés optiques uniques des PNB, en raison de leurs effets plasmoniques et ajustables, sont deux caractéristiques exceptionnelles et bénéfiques de ces particules par rapport à d'autres particules [12, 41].

Dans cette étude, un décalage vers le rouge du pic LSPR a été utilisé comme indicateur d'interaction entre les antigènes LPS et les anticorps anti-Brucella. En d'autres termes, par rapport aux échantillons témoins, la présence d'anticorps dans le sérum des échantillons de cas a provoqué un décalage vers le rouge significatif du pic d'absorption de LSPR qui peut être supposé être un indicateur de brucellose. Bien qu'il existe une différence significative de décalage vers le rouge entre les échantillons de contrôle et les échantillons de cas, cette différence ne peut pas quantifier la concentration d'anticorps dans le sérum, ce qui peut être considéré comme l'une des sérieuses limites de cette méthode. Cependant, nous devons nous rappeler que certaines méthodes courantes, telles que les stratégies liées à ELISA, sont généralement considérées comme un point de coupure [42, 43].

Surtout, cette étude a validé les performances de la technique basée sur le LSPR en comparant les résultats obtenus avec d'autres méthodes actuelles en évaluant divers paramètres. Le premier paramètre analysé était la sensibilité qui détermine la probabilité d'un test de brucellose positif chez un patient [44]. Comme Yagupsky et al. avait discuté [9], la sensibilité de l'hémoculture, qui est considérée comme l'étalon-or actuel, est réduite en particulier dans les maladies chroniques et les infections focales. In addition, this method also faced other serious limitations, such as laboratory safety problems, the slow-growth of bacteria, and a positive result is indisputable evidence of the disease [45, 46]. This LSPR-based technique represented a reliable and competitive result compared to the conventional methods in sensitivity such as culture, SAT, and ELISA-dependent kits. At the same time, specificity, that is the probability of a negative test if the patient is not infected, was evaluated [45, 47]. As results showed, compared to the other diagnostic strategy, the designed LSPR-based technique had the most significant outcome in terms of specificity. It is an important characteristic of this method because the previous studies had questioned the validity and specificity of serodiagnostic methods of human brucellosis since asymptomatic and self-limiting episodes of this infection occur in zoonosis endemicity areas [48,49,50]. However, like antibody-related methods, the current method resists the possible long-term persistence of anti-Brucella antibodies within the serum, even after complete recovery from brucellosis.

Similar to previous studies, positive predictive value was defined as the ratio of the true positive results to the sum of all positive results [51]. Similarly, the NPV was described as the ratio of the true negative results to the sum of all negative results [51]. Compared to conventional diagnostic strategies, the current designed method represented the most wonderful PPV outcomes, demonstrating its ability to distinguish between infected and non-infected individuals. In addition, the evaluation of the NPV results revealed the promising potential of the LSPR-based method to exclude non-patients from real patients.

Conclusion

This study introduced a rapid, simple, low cost, reliable, and economical method for diagnosing brucellosis. Although there are some minor limitations, including the qualitative outcomes and the possibility of being positive in recovered individuals, the advantages discussed show that it has good capabilities compared to the current laboratory-based diagnostic procedures.

Availability of data and materials

The datasets used and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Abbreviations

LPS:

Lipopolysaccharides

GNPs:

Gold nanoparticles

DLS:

Dynamic light scattering

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

SAT:

Standard tube agglutination test

ELISA:

Enzyme-linked immunosorbent assay

PPV:

Positive predictive value

NPV:

Negative predictive value

PSPR:

Propagating surface plasmon resonance

SDS-PAGE:

Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis

SEM:

Scanning electron microscopy

TGA:

Thioglycolic acid

NHS:

N-hydroxysuccinimide

EDC:

N -(3-dimethylaminopropyl)-N ′-ethylcarbodiimide hydrochloride

PBS:

Phosphate buffer saline