Synthèse d'ADN

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Contexte

La synthèse d'acide désoxyribonucléique (ADN) est un processus par lequel des copies de brins d'acide nucléique sont produites. Dans la nature, la synthèse de l'ADN a lieu dans les cellules par un mécanisme appelé réplication de l'ADN. En utilisant le génie génétique et la chimie enzymatique, les scientifiques ont développé des méthodes artificielles pour synthétiser l'ADN. La plus importante d'entre elles est la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Développée pour la première fois au début des années 1980, la PCR est devenue une industrie de plusieurs milliards de dollars, le brevet original étant vendu pour 300 millions de dollars.

Historique

L'ADN a été découvert en 1951 par Francis Crick, James Watson et Maurice Wilkins. À l'aide des données de cristallographie aux rayons X générées par Rosalind Franklin, Watson et Crick ont ​​déterminé que la structure de l'ADN était celle d'une double hélice. Pour ce travail, Watson, Crick et Wilkins ont reçu le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1962. Au fil des ans, les scientifiques ont travaillé avec l'ADN en essayant de comprendre le "code de la vie". Ils ont découvert que l'ADN servait de code d'instruction pour les séquences de protéines. Ils ont également découvert que chaque organisme a une séquence d'ADN unique et qu'elle pourrait être utilisée à des fins de dépistage, de diagnostic et d'identification. Une chose qui s'est avérée limitante dans ces études était la quantité d'ADN disponible à partir d'une seule source.

Une fois la nature de l'ADN déterminée, les scientifiques ont pu examiner la composition des gènes cellulaires. Un gène est une séquence spécifique de paires de bases d'ADN qui fournissent le code pour la construction d'une protéine. Ces protéines déterminent les caractéristiques d'un organisme, telles que la couleur des yeux ou le groupe sanguin. Lorsqu'un certain gène était isolé, il devenait souhaitable de synthétiser des copies de cette molécule. L'une des premières façons dont une grande quantité d'un ADN spécifique a été synthétisée a été le génie génétique.

Le génie génétique commence par la combinaison d'un gène d'intérêt avec un plasmide bactérien. Un plasmide est une petite portion d'ADN que l'on trouve dans de nombreuses bactéries. L'ADN hybride résultant est appelé ADN recombinant. Ce nouveau plasmide d'ADN recombinant est ensuite injecté dans des cellules bactériennes. Les cellules sont ensuite clonées en les laissant croître et se multiplier dans une culture. Au fur et à mesure que les cellules se multiplient, les copies du gène inséré se multiplient. Lorsque la bactérie s'est suffisamment multipliée, les multiples copies du gène inséré peuvent alors être isolées. Cette méthode de synthèse d'ADN peut produire des milliards de copies d'un gène en quelques semaines.

En 1983, le temps requis pour produire des copies d'ADN a été considérablement réduit lorsque Kary Mullis a développé un procédé de synthèse d'ADN appelé réaction en chaîne par polymérase (PCR). Cette méthode est beaucoup plus rapide que les précédentes méthodes connues produisant des milliards de copies d'un brin d'ADN en quelques heures seulement. Il commence par mettre une petite section d'ADN double brin dans une solution contenant de l'ADN polymérase, des nucléotides et des amorces. La solution est chauffée pour séparer les brins d'ADN. Lorsqu'elle est refroidie, la polymérase crée une copie de chaque brin. Le processus est répété toutes les cinq minutes jusqu'à ce que la quantité désirée d'ADN soit produite. En 1993, le développement de la PCR par Mullis lui a valu le prix Nobel de chimie. Aujourd'hui, la PCR a révolutionné les domaines du diagnostic médical, de la médecine légale et de la microbiologie. On dit que c'est l'un des développements les plus importants de la recherche génétique.

Contexte

La clé pour comprendre la synthèse de l'ADN est de comprendre sa structure. L'ADN est un polymère à longue chaîne composé d'unités chimiques appelées nucléotides. Également connu sous le nom de matériel génétique, l'ADN est la molécule qui transporte les informations qui dictent la synthèse des protéines dans la plupart des organismes vivants. Typiquement, l'ADN existe sous forme de deux chaînes de nucléotides liés chimiquement. Ces liens suivent des modèles spécifiques dictés par les règles d'appariement de base. Chaque nucléotide est composé d'une molécule de sucre désoxyribose, d'un groupe phosphate et de l'une des quatre bases contenant de l'azote. Les bases comprennent les pyrimidines thymine (T) et cytosine (C) et les purines adénine (A) et guanine (G). Dans l'ADN, l'adénine se lie généralement à la thymine et la guanine à la cytosine. La molécule est disposée dans une structure appelée double hélice que l'on peut imaginer en imaginant une échelle torsadée ou un escalier en colimaçon. Les bases constituent les barreaux de l'échelle tandis que les portions de sucre et de phosphate constituent les côtés de l'échelle. L'ordre dans lequel les nucléotides sont liés, appelé séquence, est déterminé par un processus appelé séquençage de l'ADN.

Dans une cellule eucaryote, la synthèse d'ADN se produit juste avant la division cellulaire par un processus appelé réplication. Lorsque la réplication commence, les deux brins d'ADN sont séparés par une variété d'enzymes. Ainsi ouvert, chaque brin sert de gabarit pour produire de nouveaux brins. Tout ce processus est catalysé par une enzyme appelée ADN polymérase. Cette molécule aligne des nucléotides correspondants ou complémentaires avec chacun des brins d'ADN. Les nucléotides sont ensuite liés chimiquement pour former de nouveaux brins d'ADN qui sont des copies exactes du brin original. Ces copies, appelées brins filles, contiennent la moitié de la molécule d'ADN mère et la moitié d'une toute nouvelle molécule. La réplication par cette méthode est connue sous le nom de réplication semi-conservative. Le processus de réplication est important car il fournit aux cellules une méthode pour transférer une copie exacte de leur matériel génétique d'une génération de cellules à la suivante.

Matières premières

Les matières premières primaires utilisées pour la synthèse d'ADN comprennent les matières premières d'ADN, l'ADN polymérase taq, les amorces, les nucléotides et la solution tampon. Chacun d'eux joue un rôle important dans la production de millions de molécules d'ADN.

La synthèse d'ADN contrôlée commence par l'identification d'un petit segment d'ADN à copier. Il s'agit généralement d'une séquence spécifique d'ADN qui contient le code d'une protéine souhaitée. Appelé ADN matrice, ce matériau est nécessaire à des concentrations d'environ 0,1 à 1 microgramme. Il doit être hautement purifié car même des traces des composés utilisés dans la purification de l'ADN peuvent inhiber le processus de PCR. Une méthode pour purifier un brin d'ADN consiste à le traiter avec de l'éthanol à 70 %.

Alors que le processus de réplication de l'ADN était connu avant 1980, la PCR n'était pas possible car il n'y avait pas d'ADN polymérase thermostable connue. L'ADN polymérase est l'enzyme qui catalyse les réactions impliquées dans la synthèse de l'ADN. Au début des années 1980, des scientifiques ont découvert des bactéries vivant autour des évents de vapeur naturels. Il s'est avéré que ces organismes, appelés thermus aquaticus, avait une ADN polymérase qui était stable et fonctionnelle à des niveaux de chaleur extrêmes. Ce taq L'ADN polymérase est devenue la pierre angulaire des techniques modernes de synthèse d'ADN. Au cours d'un processus PCR typique, 2-3 microgrammes de taq L'ADN polymérase est nécessaire. Cependant, si on en utilise trop, des séquences d'ADN non spécifiques et indésirables peuvent en résulter.

La polymérase construit les brins d'ADN en combinant les nucléotides correspondants sur chaque brin d'ADN. D'un point de vue chimique, les nucléotides sont constitués de trois types de groupes moléculaires, notamment une structure de sucre, un groupe phosphate et une base cyclique. La portion de sucre fournit la structure primaire pour tous les nucléotides. En général, les sucres sont composés de cinq atomes de carbone avec un certain nombre de groupes hydroxy (-OH) attachés. Pour l'ADN, le sucre est le 2-désoxy-D-ribose. La partie déterminante d'un nucléotide est la base hétérocyclique qui est liée de manière covalente au sucre. Ces bases sont soit des groupes pyrimidine ou purine, et elles forment la base du code d'acide nucléique. On trouve deux types de bases puriques dont l'adénine et la guanine. Dans l'ADN, deux types de bases pyrimidiques sont présentes, la thymine et la cytosine. Un groupe phosphate constitue la partie finale d'un nucléotide. Ce groupe est dérivé de l'acide phosphorique et est lié de manière covalente à la structure du sucre sur le cinquième carbone.

La première phase de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) implique la dénaturation de l'ADN. Cette "ouverture" de la molécule d'ADN fournit la matrice pour la prochaine molécule d'ADN à partir de laquelle elle sera produite. Avec l'ADN divisé en brins séparés, la température est abaissée - l'étape d'annelage de l'amorce. Au cours de la phase suivante, l'ADN polymérase interagit avec les brins et ajoute des nucléotides complémentaires sur toute la longueur. Le temps nécessaire à cette phase est d'environ une minute pour 1 000 paires de bases.

Pour initier la synthèse d'ADN, de courtes sections d'amorce d'ADN doivent être utilisées. Ces sections d'amorce, appelées fragments d'oligo, ont une longueur d'environ 18 à 25 nucléotides et correspondent à une section sur l'ADN matrice. Ils ont typiquement une concentration en nucléotides C et G d'environ 60 % avec une distribution uniforme. Ceci fournit l'efficacité maximale dans le processus de synthèse.

La solution tampon fournit le milieu dans lequel la synthèse d'ADN peut se produire. Il s'agit d'une solution aqueuse qui contient du MgCl2, du HCI, de l'EDTA et du KCI. La concentration en MgCl2 est importante car les ions Mg2+ interagissent avec l'ADN et les amorces créant des complexes cruciaux pour la synthèse de l'ADN. La concentration recommandée est de une à quatre micromoles. Le pH de ce système est critique, il peut donc également être tamponné avec du sulfate d'ammonium. Pour dynamiser la réaction, diverses molécules d'énergie sont ajoutées telles que l'ATP, le GTP et le NTP. Ces composés sont les mêmes que ceux que les organismes vivants utilisent pour alimenter les réactions métaboliques.

D'autres matériaux qui peuvent être utilisés dans le procédé comprennent l'huile minérale ou la cire de paraffine. Une fois la synthèse de l'ADN terminée, l'ADN est généralement isolé et purifié. Certains réactifs couramment utilisés dans ce processus incluent le phénol, l'EDTA et la protéinase K.

Le processus de fabrication

La synthèse d'ADN est généralement effectuée à petite échelle dans des laboratoires. Il implique trois processus distincts, notamment la préparation des échantillons, le cycle de réaction de synthèse de l'ADN et l'isolement de l'ADN. Ces étapes de fabrication sont généralement effectuées dans des zones séparées pour éviter la contamination. En suivant ces procédures, les scientifiques sont capables de convertir quelques brins d'ADN en millions et millions de copies exactes.

Préparation des échantillons

• 1 Pour commencer la synthèse d'ADN, les différentes solutions sont préparées. Cela se fait généralement dans une armoire à flux laminaire équipée d'une lampe UV pour minimiser la contamination. Les scientifiques utilisent des gants neufs à chaque étape de la production pour des raisons similaires. Typiquement, toutes les solutions de départ, à l'exception des amorces, des polymérases et des dNTP, sont placées dans un autoclave pour tuer tout organisme contaminant. Deux solutions distinctes sont proposées. L'un contient le tampon, les amorces et la polymérase. L'autre contient le MgCl2 et l'ADN matrice. Ces solutions sont toutes mises dans de petits tubes pour commencer la réaction.

Kary Banks Muilis.

Kary Banks Muilis est né à Lenoir, Caroline du Nord, en 1944. Après avoir obtenu son diplôme de Georgia Tech en 1966 avec un B.S. en chimie, Muilis est entré dans le programme de doctorat en biochimie de l'Université de Californie à Berkeley. Gagner son doctorat en 1973, il a accepté un poste d'enseignant à la faculté de médecine de l'Université du Kansas à Kansas City. En 1977, il a assumé une bourse postdoctorale à l'Université de Californie à San Francisco.

Muilis a accepté un poste de chercheur en 1979 dans une entreprise de biotechnologie en pleine croissance, Cetus Corporation, à Emeryville, en Californie, qui synthétisait des produits chimiques utilisés par d'autres scientifiques dans le clonage génétique. Là-bas, il a conçu la réaction en chaîne par polymérase (PCR), une technique rapide et efficace pour reproduire des gènes spécifiques ou des fragments d'ADN (acide désoxyribonucléique) qui peuvent créer des milliards de copies en quelques heures. Le moyen le plus efficace de reproduire l'ADN était le clonage, mais c'était problématique. Il a fallu du temps pour convaincre les collègues de Mullis de l'importance de cette découverte, mais la PCR est rapidement devenue l'objet de recherches intensives. Les scientifiques de Cetus ont développé une version commerciale du processus et une machine appelée Thermal Cycler (avec l'ajout des blocs de construction chimiques de l'ADN [nucléotides] et d'un catalyseur biochimique [polymérase], la machine exécuterait le processus automatiquement sur une pièce cible de l'ADN).

Cetus a attribué 10 000 $ à Muilis pour le développement du brevet PCR, puis l'a vendu pour 300 millions de dollars. Quittant Cetus en 1986, Muilis est devenu consultant privé en recherche biochimique et a reçu le prix Nobel en 1993.

Cycle de synthèse d'ADN

• 2 Une fois les solutions réactives préparées, le cycle PCR est lancé. La première phase implique la dénaturation de l'ADN. L'une des étapes initiales les plus importantes est la dénaturation complète de la matrice d'ADN. La dénaturation de l'ADN signifie essentiellement la rupture du double brin lié. Cette "ouverture" de la molécule d'ADN fournit la matrice pour la prochaine molécule d'ADN à partir de laquelle elle sera produite. Une dénaturation incomplète entraînera une copie inefficace dans le premier cycle, ce qui aura un impact négatif sur chaque cycle suivant. La dénaturation initiale est effectuée en chauffant la solution de matrice d'ADN à 203 °F (95 °C) pendant une à trois minutes. Le temps total dépend de la composition du modèle. Dans les cycles répétés, l'étape de dénaturation dure environ deux minutes et consiste à chauffer la solution à 201PF (94°C). Des matériaux supplémentaires peuvent être ajoutés à la solution pour faciliter la dénaturation de l'ADN, tels que le glycérol, le DMSO ou le formamide.
• 3 Avec l'ADN divisé en brins séparés, la température est abaissée à 122-149°F (50-65°C). Ceci est connu comme l'étape de recuit d'amorce et dure environ deux minutes. À ce stade, les amorces gauche et droite correspondent et se lient chimiquement à leurs bases complémentaires sur l'ADN matrice.
• 4 La phase suivante implique l'étape d'extension. Cette partie de la réaction se produit lorsque la majeure partie du brin d'ADN est copiée. La température du système est chauffée à environ 162 °F (72 °C) et y est maintenue en fonction de la longueur de l'ADN à copier. A ce stade, l'ADN polymérase interagit avec les brins et ajoute des nucléotides complémentaires sur toute la longueur. Le temps nécessaire à cette phase est d'environ une minute pour 1 000 paires de bases.
• 5 Après ce premier cycle, le cycle de synthèse d'ADN est répété. Le nombre de cycles dépend de la quantité d'ADN initial et de la quantité d'ADN souhaitée. Si moins de 10 copies de l'ADN matrice sont disponibles, 40 cycles sont nécessaires. Avec plus d'ADN initial, 25-30 cycles suffisent.
• 6 Au cours du dernier cycle, l'échantillon est maintenu à 162 °F (72 °C) pendant environ 15 minutes. Cela permet le remplissage (avec des nucléotides) de toutes les extrémités saillantes d'un nouveau brin d'ADN. À ce stade, la polymérase ajoute des nucléotides A supplémentaires à une extrémité des brins d'ADN.

Isolement d'ADN

• 7 Lorsque les réactions sont terminées, l'ADN est isolé des matériaux de réaction PCR tels que l'ADN polymérase, MgCl2 et les amorces. Cela se fait en ajoutant des composés comme le phénol, l'EDTA et la protéinase K. La centrifugation est également utile à cet égard.

Le futur

Alors que les scientifiques utilisent régulièrement la PCR pour la synthèse d'ADN, il reste encore beaucoup de choses à comprendre sur la réplication de l'ADN. À l'avenir, la recherche devrait élucider les détails de plusieurs étapes importantes du processus, telles que les composants et les intermédiaires impliqués. De plus, des polymérases améliorées peuvent être développées, permettant de créer plus d'ADN à partir d'échantillons de départ plus petits. On espère qu'un jour la synthèse de l'ADN aidera à débloquer certains des aspects clés des organismes vivants et conduira au développement de médicaments qui guériront divers cancers, infections virales et bactériennes.