Thérapie ciblée du gliome : Tétraèdres d'ADN modifiés par Gint4.T délivrent la doxorubicine pour inhiber la prolifération cellulaire pilotée par PDGFRβ

Résumé

Le gliome est l'une des tumeurs cérébrales intrinsèques les plus mortelles en raison de sa croissance invasive. L'effet du traitement du gliome est médiocre en raison de la présence de la barrière hémato-encéphalique et de la barrière hémato-tumorale et d'un ciblage médicamenteux insuffisant. Les tétraèdres d'ADN (TDN) montrent un grand potentiel pour la délivrance de médicaments et peuvent être une nouvelle stratégie thérapeutique pour le gliome. Dans cette étude, nous avons utilisé les TDN pour délivrer la doxorubicine (DOX) pour la thérapie du gliome. Gint4.T, un aptamère qui pourrait reconnaître le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes β sur la cellule tumorale, a été utilisé pour modifier les TDN (Apt-TDN) pour la délivrance ciblée de médicaments. Les TDN ont été auto-assemblés par synthèse en une étape, ce qui a montré une petite taille (10 nm) et une charge négative. Le test de sérum fœtal bovin a montré sa stabilité en tant que véhicule de délivrance de médicaments. L'Apt-TDN pouvait être efficacement internalisé par les cellules U87MG. Comparé à la DOX et à la DOX@TDN (TDN chargé de DOX), le DOX@Apt-TDN (TDN modifié par Gint4.T chargé de DOX) a montré un taux d'apoptose précoce plus élevé, un arrêt du cycle cellulaire plus important et une plus grande cytotoxicité envers les cellules U87MG. En conclusion, nos résultats indiquent que le DOX@Apt-TDN fournit une nouvelle thérapie avec une application clinique prometteuse pour les patients atteints de gliomes.

Introduction

Le gliome, une tumeur dérivée du neuroépithélium, est la malignité intracrânienne la plus courante. Près d'1/3 de toutes les tumeurs cérébrales sont des gliomes, et environ 4/5 des tumeurs cérébrales primitives malignes sont des gliomes [1-4]. Actuellement, le traitement le plus efficace pour le gliome est la résection chirurgicale et la chimioradiothérapie concomitante postopératoire, mais malheureusement, le pronostic pour les patients reste médiocre. La chimiothérapie traditionnelle pour le gliome ne montre pas un bon résultat en raison d'un ciblage tumoral médiocre, de complications dues à la barrière hémato-encéphalique (BHE) et à la barrière hémato-tumorale (BHT), et d'un ciblage médicamenteux insuffisant. La BHE est le facteur le plus important qui empêche la délivrance de presque toutes les macromolécules (y compris les médicaments et les gènes) au parenchyme cérébral et leur fonction propre. Les médicaments qui ne peuvent pas franchir la BHE doivent être administrés à des doses suffisamment élevées pour atteindre une concentration de traitement efficace dans la zone d'intérêt. Cependant, un excès de médicaments peut causer des effets secondaires systémiques sévères et une accumulation de médicaments non désirée dans les tissus non affectés. De plus, les médicaments anti-gliome conventionnels existants ont des capacités de ciblage insuffisantes [3, 4]. Les nanoparticules ont émergé comme l'outil de transport de médicaments le plus prometteur. En raison de leur avantage de taille, les nanoparticules peuvent franchir la BHE et exercer un effet antitumoral. Kafa et al. [5] ont conçu des nanotubes de carbone multi-parois chimiquement fonctionnalisés (f-MWNTs) ciblant ANG et ont confirmé leur capacité à franchir la BHE par des expériences in vivo et in vitro. Cependant, ces nanomatériaux peuvent être distribués à divers organes dans tout le corps ou même entrer dans le système nerveux central (SNC), où ils peuvent causer une neurotoxicité [6].

L'ADN est un matériau idéal pour la construction de nanostructures car son assemblage peut être contrôlé avec précision par l'appariement de bases Watson-Crick [7]. À ce jour, un certain nombre de nanostructures d'ADN bidimensionnelles (2D) et tridimensionnelles (3D) ont été conçues et démontrées [8-10]. Les nanostructures tétraédriques d'ADN (TDN) ont attiré une attention significative en raison de leur biocompatibilité, stabilité, sites de modification fonctionnalisée abondants et faible immunogénicité [11-13]. Turberfield et al. ont synthétisé des nanostructures tétraédriques d'ADN avec un haut rendement en utilisant une méthode de synthèse en une étape [14]. Walsh et al. ont trouvé qu'une sonde d'acide nucléique contenant un tétraèdre d'ADN pouvait entrer dans les cellules mammifères sans avoir besoin de réactif de transfection [15]. Lee et al. ont démontré que des nanoparticules tétraédriques auto-assemblées peuvent être utilisées pour la délivrance ciblée de siRNA in vivo [16]. Les TDN ont montré d'excellentes perspectives d'application en diagnostics moléculaires, délivrance moléculaire et thérapie médicamenteuse ciblée. Elles sont également largement utilisées dans la recherche sur les tumeurs dans divers organes, comme le cancer du sein [17]. De même, les TDN ont également été utilisées dans l'étude des maladies du système nerveux. Tian et al. [18] ont utilisé les tétraèdres d'ADN comme base et les ont modifiés avec l'angiopep-2 (ANG) pour construire avec succès la nanopsonde ANG-TDN, qui pouvait cibler la protéine 1 liée au récepteur des lipoprotéines de basse densité (LRP-1) pour l'imagerie ciblée. La recherche a montré que ANG-TDN peut franchir la BHE. Ma et al. [19] ont suggéré que les nanostructures tétraédriques d'ADN peuvent entrer dans les cellules souches neurales (CSN) sans avoir besoin d'agents de transfection, où elles favorisent la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches neurales [20], et ont un grand potentiel pour la réparation et la régénération des tissus neuronaux. Par conséquent, nous avons étudié la possibilité d'utiliser les TDN dans la thérapie du gliome et d'améliorer leur capacité de ciblage.

Le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes β (PDGFRβ) est un membre important de la famille des tyrosine protéines kinases qui est impliqué dans la prolifération cellulaire, la migration et l'angiogenèse. Plusieurs études ont montré que PDGFβ est une cible prometteuse pour les thérapies antitumrales en raison de son rôle dans l'angiogenèse [21, 22]. Les aptamères sont de courts oligonucléotides d'ADN ou d'ARN simple brin produits par la méthode d'évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel (SELEX). Les aptamères sont similaires aux anticorps, qui ont une haute affinité et spécificité envers leurs cibles [23]. En raison de leurs propriétés uniques, les aptamères jouent un rôle important dans la délivrance ciblée d'agents chimiothérapeutiques, de siRNAs et de nanoparticules chargées de médicaments. Gint4.T, un aptamère d'ARN qui peut se lier spécifiquement à PDGFRβ, est aussi un antagoniste spécifique de PDGFRβ [24]. Monaco et al. [25] ont suggéré que les aptamères Gint4.T peuvent franchir la barrière hémato-encéphalique (BHE) et reconnaître spécifiquement PDGFRβ. Les nanoparticules polymériques (PNPs) conjuguées à Gint4.T peuvent être facilement internalisées par les cellules de glioblastome (GBM). Dans cette étude, nous rapportons un nouveau système de délivrance de médicaments qui combine l'aptamère Gint4.T et les TDN. Le TDN modifié par Gint4.T (Apt-TDN) chargé de DOX (DOX@Apt-TDN) a exhibé une internalisation cellulaire spécifique améliorée et une cytotoxicité contre les cellules U87MG.

Méthodes

Matériaux

Tous les oligonucléotides d'ADN et les oligonucléotides d'ARN 2'F-Py ont été achetés chez Sangon Biotech (Shanghai, Chine), et toutes les séquences d'oligonucléotides sont listées dans le Tableau 1. La solution de colorant GelRed pour gel d'ADN a été achetée chez Sangon Biotech. Le sérum fœtal bovin (FBS) et le milieu de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) ont été achetés chez Thermo Fisher (New York, USA). La doxorubicine (DOX) a été achetée chez Mengbio Technology (Chongqing, Chine). Les cellules U87MG ont été achetées chez Shanghai Life Academy of Sciences Cell Library (Shanghai, Chine). Le DAPI a été acheté chez Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Beijing, Chine).

Préparation des nanostructures d'ADN

Pour assembler le tétraèdre d'ADN (Tableau 1), 2 μL de chaque oligonucléotide (S1, S2, S3 et S4) a été ajouté à 42 μL de tampon TM (10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, pH = 8). La solution d'ADN a ensuite été chauffée à 95 °C pendant 5 min et ensuite refroidie à 4 °C pendant 2 min en utilisant une machine PCR Bio-Rad (Californie, USA) [26, 27]. La concentration finale de TDN était de 2 μM. TDN' a été préparé de la même manière sauf que S1 a été remplacé par S1'. Pour synthétiser l'Apt-TDN, l'aptamère Gint4.T a été ajouté aux TDN à un rapport molaire égal, et le mélange a été incubé à 37 °C pendant 60 min. Avant la synthèse, l'aptamère a été soumis à une étape courte de dénaturation-rénaturation (85 °C pendant 5 min, refroidissement rapide sur 2 min et réchauffement subséquent à 37 °C sur 10 min) [25].

Électrophorèse sur gel d'agarose

Un gel d'agarose (3 %) a été couru dans un tampon 0,5× TEB à 100 V pendant 30 min. La température de l'appareil d'électrophorèse a été maintenue à 0 °C en plaçant l'appareil dans un bain de glace. Avant l'électrophorèse, GelRed a été ajouté au gel d'agarose pour colorer les brins d'ADN. Quand le processus était fini, un scanner de fluorescence Bio-Rad (Californie, USA) a été utilisé pour capturer une image du gel.

Diffusion dynamique de la lumière

Un Malvern Zetasizer ZS90 (Malvern, UK) a été utilisé pour mesurer la taille hydrodynamique et le potentiel zêta des TDN. Un total de 1 mL de TDN (100 nM) a été soumis à l'analyse de diffusion dynamique de la lumière (DLS).

Imagerie par microscopie à force atomique

Les TDN ont été dilués à 100 nM avec le tampon TM (tampon Tris-HCl contenant MgCl₂). Ensuite, 10 μL de chaque échantillon TDN a été ajouté sur de la mica fraîchement clivée et incubé pendant 10 min. Les échantillons ont été ensuite imager sur un instrument de microscopie à force atomique (AFM) en mode AC (Agilent 5500, USA).

Mesure de la capacité de chargement du médicament des TDN préparés

La doxorubicine a été dissoute dans de l'eau déionisée pour faire une solution de stockage de 500 μM. La doxorubicine à différentes concentrations (1 à 20 μM) a été mélangée avec les TDN (100 nM) ou Apt-TDN (100 nM) pendant 6 h à température ambiante (24-26 °C). Les solutions mélangées ont ensuite été centrifugées à 12 000×g pendant 10 min pour obtenir les TDN chargés de médicament. Ensuite, 50 μL des surnageants ont été retirés et mélangés avec PBS à un rapport 1:1. Un lecteur de microplaques Varioskan LUX (Californie, USA) a été utilisé pour mesurer l'intensité de fluorescence de la doxorubicine (λ_ex = 480 nm et λ_em = 590 nm) pour déterminer la quantité de doxorubicine dans les surnageants [28]. La concentration de doxorubicine chargée dans les TDN a été calculée par la courbe standard et l'intensité de fluorescence. Nous avons également mélangé la doxorubicine avec les TDN à des rapports molaires croissants.

Stabilité du TDN dans le sérum in vitro

Les TDN ont été mélangés avec le milieu complet et incubés à 37 °C pendant 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 ou 24 h. Les solutions de TDN ont été mélangées avec le FBS à un rapport 1:1 et incubées à 37 °C pendant 1, 3, 5 ou 7 h. Après incubation, les mélanges ont été courus sur un gel d'agarose à 3 %.

Cytotoxicité du TDN in vitro

Pour déterminer la cytotoxicité de la nanostructure, les cellules U87MG à une concentration de 1 × 10⁴ cellules/puits ont été ensemencées sur une plaque à 96 puits. Le milieu de culture cellulaire a été retiré, et des milieux frais contenant 0-500 nM TDN ont été ajoutés et incubés pendant 24 h et 48 h supplémentaires après incubation nocturne. Ensuite, 10 μL de solution CCK-8 a été ajouté à chaque puits, et le mélange a été incubé pendant 1 h. L'absorbance à 450 nm a ensuite été mesurée en utilisant un lecteur de microplaques.

Imagerie de fluorescence

L'internalisation cellulaire de DOX et TDN a été étudiée par microscopie de fluorescence (Olympus, Tokyo, Japon). Les cellules U87MG ont été ensemencées sur des lamelles dans des plaques à 24 puits avec un milieu contenant 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline et streptomycine et cultivées pendant au moins 1 jour à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO₂ jusqu'à ce que les cellules atteignent au moins 75 % de confluence. Après incubation, les milieux de culture ont été retirés. Des milieux complets contenant 100 nM Cy3-TDN et Cy3-Apt-TDN ont été ajoutés et incubés pendant 3 h. Les TDN et Apt-TDN ont été marqués avec Cy3 pour détecter l'internalisation intracellulaire des nanoparticules. Pour évaluer l'internalisation cellulaire de DOX, DOX (DOX 2 μM), DOX@TDN (DOX 2 μM) et DOX@Apt-TDN (DOX 2 μM) ont été ajoutés aux cellules U87MG et incubés pendant 3 h. Après 3 h de traitement, les cellules ont été fixées avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 20 min dans l'obscurité et ensuite colorées avec 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 min. Les cellules ont été lavées avec PBS trois fois et observées sous un microscope à fluorescence.

Cytométrie de flux

Un total de 1 × 10⁶ cellules U87MG ont été implantées dans des plaques à 6 puits. Après incubation nocturne, les milieux de culture ont été retirés, et des milieux supplémentés avec 100 nM Cy3-TDN, 100 nM Cy3-Apt-TDN ou 100 nM Cy3-Apt-TDN + 1 μM Apt libre ont été ajoutés et incubés pendant 3 h. Ensuite, les cellules ont été fixées avec 4 % de paraformaldéhyde pendant 20 min, et la cytométrie de flux a été utilisée pour analyser les pourcentages de cellules positives au Cy-3.

Cycle cellulaire et apoptose

Après traitement avec DOX, DOX@TDN ou DOX@Apt-TDN pendant 24 h, 5 × 10⁵ cellules ont été collectées et fixées dans 75 % d'éthanol froid pendant la nuit. Ensuite, les cellules ont été incubées avec de la RNase et de l'iodure de propidium pendant 30 min à 37 °C dans l'obscurité. Le cycle cellulaire a été investigué par cytométrie de flux. De plus, après les différents traitements, les cellules ont été colorées avec Annexin V-FITC/DAPI, et l'apoptose précoce a été explorée.

Essais CCK-8

Pour déterminer la viabilité cellulaire, les cellules U87MG (5 × 10³) ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits avec 100 μL de milieu et cultivées pendant la nuit à 37 °C sous une atmosphère contenant 5 % de CO₂. Le milieu a été ensuite retiré, et un milieu frais contenant DOX, DOX-TDN ou DOX-Apt-TDN a été ajouté. Après 24 h d'incubation, 10 μL de solution CCK-8 a été ajouté, et les cellules ont été cultivées pendant 1 h supplémentaire. Un lecteur de microplaques a été utilisé pour mesurer l'absorbance à 450 nm.

Analyse statistique

Toutes les expériences dans cette étude ont été effectuées en triplicat, et toutes les données sont présentées comme la valeur moyenne avec son écart-type (moyenne ± ET). L'analyse statistique a été effectuée en utilisant le programme SPSS 24.0 (IBM, USA). Les différences significatives ont été déterminées en utilisant le test t de Student, avec P < 0,05 indiquant des différences significatives entre les groupes.

Résultats

Synthèse et caractérisation des TDN et Apt-TDN

Le TDN a été auto-assemblé à partir de quatre oligonucléotides (Tableau 1) via une synthèse en une étape comme rapporté précédemment [18, 29]. L'aptamère ciblant la tumeur Gint4.T a été utilisé pour modifier les TDN via l'appariement de bases Watson-Crick. Le tétraèdre d'ADN contient quatre faces, chaque face étant formée par un oligonucléotide. Ainsi, quatre oligonucléotides se sont hybridés entre eux pour former un tétraèdre d'ADN (Fig. 1a). L'analyse d'électrophorèse sur gel a montré une bande unique proéminente dans les puits 4 et 5, suggérant que les TDN et Apt-TDN ont été construits avec succès. La mobilité de l'Apt-TDN était diminuée par rapport à celle des TDN, suggérant que l'aptamère Gint4.T a modifié avec succès les TDN.

a Synthèse du tétraèdre d'ADN et Gint4.T-TDN. Puits 1 : S1 ; puits 2 : S1+S2 ; puits 3 : S1+S2+S3 ; puits 4 : S1+S2+S3+S4 (TDN) ; puits 5 : TDN mélangé avec Apt-tail (Gint4.T) ; Apt-TDN. Le puits 1 n'était pas visible car les colorants d'acides nucléiques ne peuvent pas correctement colorer l'ADN simple brin. b Les images AFM montraient que les hauteurs des TDN et Apt-TDN étaient ~ 2 nm. c Détermination de la taille des particules et du potentiel zêta des TDN et Apt-TDN par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Les tailles moyennes des particules des TDN et Apt-TDN étaient de 10,10 nm (A) et 13,54 nm (B), respectivement. Les potentiels zêta moyens des TDN et Apt-TDN étaient de − 5,69 mV (C) et − 7,3 mV (D), respectivement.

Les tailles des TDN et Apt-TDN ont été déterminées par DLS et AFM. Les TDN et Apt-TDN ont montré des tailles de particules de 10,1 nm et 13,5 nm, respectivement, reflétant l'addition du ligand Gint4.T (Fig. 1c (A), (B)). Comme le diamètre hydrodynamique inclut les molécules d'eau, les particules étaient plus grandes que leurs tailles théoriques. Les hauteurs des TDN et Apt-TDN déterminées par les images AFM étaient ~ 2 nm (Fig. 1b), indiquant que la modification par aptamère n'a pas changé la structure 3D. Les potentiels zêta moyens des TDN et Apt-TDN étaient de − 5,69 mV (C) et − 7,3 mV (D), respectivement (Fig. 1c (C) (D)). Basé sur ces paramètres, nous avons conclu que les TDN et Apt-TDN avaient été assemblés avec succès.

Stabilité et cytotoxicité des TDN in vitro

L'analyse d'électrophorèse sur gel a montré que les TDN restaient intacts quand incubés dans le milieu complet pendant 24 h à 37 °C (Fig. 2a (A)). De plus, quand la concentration de sérum fœtal bovin était augmentée à 50 %, les TDN restaient stables pendant au moins 7 h (Fig. 2a (B)), ce qui est cohérent avec les rapports précédents [18, 26]. Pour déterminer la cytotoxicité de la nanostructure, l'essai CCK-8 a été utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire des cellules U87MG après traitement avec les TDN à un certain nombre de concentrations. Comme montré dans la Fig. 2b, aucune cytotoxicité significative n'a été observée dans les cellules U87MG traitées avec les TDN à 0-500 nM pendant 24 h et 48 h. Donc, les nanoparticules d'ADN peuvent être utilisées comme transporteurs stables et biosûrs pour la délivrance de médicaments.

a L'électrophorèse sur gel montrait que les TDN restaient stables pendant 24 h dans le milieu complet à 37 °C (A) ; les TDN restaient stables pendant 7 h quand la concentration de sérum fœtal bovin était augmentée à 50 % (B). b Les cellules U87MG étaient co-cultivées avec les TDN à différentes concentrations (10-500 nM) pendant 24 h et 48 h. L'essai CCK-8 montrait que l'activité des cellules U87MG n'était pas affectée, ce qui indiquait la biosécurité des TDN.

Capacité de chargement du médicament des TDN et Apt-TDN

La doxorubicine est un médicament chimiothérapeutique à large spectre qui peut s'intercaler dans les brins doubles d'ADN. Nous avons calculé une courbe standard de doxorubicine (Fig. 3a) et puis investigué l'intercalation de la doxorubicine dans les TDN. La quantité de doxorubicine intercalée dans les TDN et Apt-TDN a augmenté graduellement avec l'augmentation de la concentration de doxorubicine. Quand la concentration de doxorubicine était de 14 μM, la quantité de doxorubicine intercalée dans les TDN et Apt-TDN a culminé à 5,5 μM et 6,0 μM, respectivement, et a ensuite atteint un plateau (Fig. 3b), indiquant que les brins d'ADN étaient pleinement occupés. Pendant ce temps, nous avons mélangé la doxorubicine avec les TDN à des rapports molaires croissants. Le spectre de fluorescence de la doxorubicine a été scanné pour analyse. Comme montré dans la Fig. 3c, le spectre de fluorescence de la doxorubicine était éteint avec la doxorubicine à un rapport molaire de 0,05. Basé sur ces résultats, nous avons conclu qu'environ 55 molécules de doxorubicine étaient contenues dans un seul TDN, tandis que 60 molécules étaient contenues dans un seul Apt-TDN.

a Une courbe standard des concentrations de DOX dans le tampon PBS ; λex = 480 nm et λem = 590 nm. La quantité de DOX transportée par les TDN et Apt-TDN. b DOX intercalé dans l'ADN double brin des TDN et Apt-TDN. Quand la concentration de DOX a atteint 14 μM et la concentration de DOX intercalée dans les TDN et Apt-TDN a culminé à 5,5 μM et 6,0 μM, respectivement, un seul tétraèdre d'ADN pouvait transporter 55 molécules de Dox, tandis qu'un seul tétraèdre d'ADN modifié par aptamère transportait 60 molécules de DOX. c Spectres de fluorescence de DOX dans le surnageant. La doxorubicine a été mélangée avec les TDN à des rapports molaires croissants (0, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01 et 0,05 de haut en bas). Quand le rapport molaire était 1:20, la fluorescence était éteinte.

Internalisation cellulaire ciblée de l'Apt-TDN

L'ADN est une macromolécule chargée négativement, ce qui rend son entrée dans la membrane cellulaire chargée négativement difficile. Typiquement, les molécules d'ADN individuelles doivent accéder aux cellules avec l'aide de réactifs de transfection. Ici, nous avons marqué les TDN et Apt-TDN avec Cy3 pour surveiller l'internalisation intracellulaire des nanoparticules. Après incubation avec les cellules U87MG pendant 3 h, un signal de fluorescence rouge Cy3 est apparu dans le cytoplasme cellulaire, indiquant que les TDN se liaient à la cytomembrane et étaient internalisés dans la cellule sans l'aide d'agents de transfection (Fig. 4a). L'Apt-TDN montrait une fluorescence rouge plus élevée, ce qui suggère que la présence de l'aptamère Gint4.T augmentait significativement l'internalisation du tétraèdre d'ADN par les cellules U87MG. Cependant, quand l'aptamère libre était ajouté, la fluorescence Cy3 diminuait au niveau observé pour les TDN seuls. En raison de l'inhibition compétitive par l'aptamère libre, nous déduisons que l'aptamère sur les TDN ne pouvait pas faciliter l'internalisation des TDN. Basé sur cette inhibition compétitive, nous avons prouvé que l'Apt-TDN peut cibler les cellules U87MG. La cytométrie de flux a prouvé davantage que le pourcentage de cellules U87MG positives au Cy3 était plus élevé dans le groupe Apt-TDN que dans le groupe TDN. L'Apt libre a diminué le pourcentage de cellules U87MG positives au Cy3 dans le groupe Apt-TDN (Fig. 4b).

a Internalisation des TDN et Apt-TDN (TDN-Gint4.T) par les cellules U87MG. Les TDN entraient directement dans les cellules U87MG sans agents de transfection, et l'internalisation de l'Apt-TDN (lié à l'aptamère Gint4.T) était significativement augmentée et inhibée compétitivement par l'Apt libre (Gint4.T), indiquant que l'aptamère Gint4.T joue un rôle significatif dans le ciblage cellulaire. La barre d'échelle représente 50 μm. b Courbes de cytométrie de flux montrant l'internalisation intracellulaire des TDN, Apt-TDN et Apt-TDN+Apt après incubation pendant 3 h.

Internalisation cellulaire du DOX@TDN et DOX@Apt-TDN

Nous avons utilisé le spectre de fluorescence caractéristique de la doxorubicine pour évaluer l'efficacité d'internalisation du médicament. Après 3 h de traitement, la doxorubicine intracellulaire a été imagée par microscopie de fluorescence (Fig. 5a). La doxorubicine libre pouvait entrer dans les cellules U87MG et était localisée dans le noyau. Avec l'addition de DOX@TDN, la fluorescence était plus élevée que celle de la doxorubicine libre. Ce résultat suggérait que les nanoparticules d'ADN amélioraient l'internalisation cellulaire de la doxorubicine. Quand DOX@Apt-TDN était ajouté, le signal rouge dans le noyau était encore plus élevé que celui des cellules auxquelles DOX@TDN avait été ajouté. L'analyse semi-quantitative de l'internalisation intracellulaire de DOX a confirmé davantage que l'Apt-TDN facilitait une augmentation de plus de deux fois de l'internalisation intracellulaire de DOX par rapport au médicament seul. Nous déduisons que cela est dû à la liaison spécifique de Gin4.T aux récepteurs, suite à laquelle plus de nanoparticules peuvent entrer dans la cellule. Après digestion dans les lysosomes, la doxorubicine peut être libérée dans le cytoplasme et fonctionne davantage dans le noyau.

a Internalisation cellulaire de DOX, DOX@TDN et DOX@Apt-TDN. Modifié avec l'aptamère Gint4.T, l'Apt-TDN pouvait délivrer plus de doxorubicine aux cellules U87MG que les TDN. De plus, les TDN pouvaient transporter plus de médicament vers les cellules que le médicament seul. Les barres d'échelle indiquent 50 μm. b Analyse semi-quantitative de l'intensité de fluorescence de la doxorubicine avec traitement PBS, DOX, DOX@TDN et DOX@Apt-TDN (comparé au blanc : *p < 0,05, **p < 0,01).

Cytotoxicité de DOX, DOX@TDN et DOX@Apt-TDN

Pour l'étude de cytotoxicité, trois groupes de cellules U87MG ont été traités avec différentes concentrations de doxorubicine (Fig. 6a). Les valeurs IC₅₀ pour la doxorubicine étaient de 13,39 μM pour le traitement DOX, 7,826 μM pour le traitement DOX@TDN et 4,205 μM pour le traitement DOX@Apt-TDN. Parmi les trois traitements, le DOX@Apt-TDN a montré la cytotoxicité la plus élevée à 24 h, ce qui indiquait la spécificité de l'Apt-TDN pour les cellules U87MG. Après 24 h, les cellules dans les groupes DOX, DOX@TDN et DOX@Apt-TDN ont été collectées et utilisées pour explorer l'apoptose précoce. Nos données ont démontré que le taux d'apoptose précoce était plus élevé dans le groupe DOX@Apt-TDN que dans les deux autres groupes (Fig. 6b). De plus, la proportion de cellules en phase G0/G1 était augmentée dans le groupe DOX-Apt-TDN par rapport aux groupes DOX et DOX-TDN (p < 0,01), et le rapport de cellules en phase S était diminué dans le groupe DOX-Apt-TDN (p < 0,01) (Fig. 6c). Le pourcentage de cellules en phase G2 n'a pas changé (données non montrées).

a Cytotoxicité de DOX, DOX@TDN et DOX@Apt-TDN à diverses concentrations. Le taux d'inhibition des cellules U87MG a été significativement augmenté avec l'augmentation de la concentration de DOX, mais les groupes DOX@TDN et DOX@Apt-TDN exhibaient une cytotoxicité significativement augmentée par rapport au groupe DOX. Le taux d'inhibition cellulaire du groupe DOX@Apt-TDN était aussi significativement plus élevé que celui du groupe DOX@TDN (comparé à DOX, **p < 0,05 ; comparé à DOX, ***p < 0,01 ; comparé à DOX@Apt-TDN, #p < 0,05). b Apoptose des cellules U87MG après incubation avec PBS, DOX, DOX@TDN et DOX@Apt-TDN pendant 24 h. c Histogrammes de cytométrie de flux du cycle cellulaire des cellules U87MG après incubation avec PBS, DOX, DOX@TDN et DOX@Apt-TDN pendant 24 h (comparé au contrôle, **p < 0,05 ; comparé au contrôle, ***p < 0,01 ; comparé à DOX@Apt-TDN, #p < 0,01).

Discussion

Que ce soit via des expériences in vitro ou in vivo, la stabilité d'un médicament et de son transporteur doit être déterminée. Après l'assemblage des TDN, leur stabilité a d'abord été déterminée in vitro. Cette étude a montré que la structure 3D des nanoparticules d'ADN peut améliorer leur stabilité dans le sérum en inhibant la liaison enzymatique. La sécurité biologique de la nanostructure concernée est la exigence la plus importante pour son application. Aucune cytotoxicité significative n'a été observée dans les cellules U87MG co-cultivées avec diverses concentrations des TDN pendant 24 h ou 48 h. Aucune des séquences d'ADN utilisées dans cette étude n'encode aucune information génétique, et aucun effet secondaire n'a été rapporté dans le test de cytotoxicité. Par conséquent, les TDN peuvent servir de transporteurs de médicaments sûrs et stables.

L'efficacité de ciblage d'une nanostructure modifiée par aptamère est cruciale pour la délivrance sélective de médicaments aux cellules cancéreuses. Contrairement aux anticorps, les aptamères sont chimiquement stables, peu coûteux et peuvent être produits en masse. De plus, contrairement à d'autres matériaux, les aptamères peuvent facilement se lier à un tétraèdre d'ADN en utilisant le principe de complémentarité de base. Ainsi, la combinaison d'aptamères et de tétraèdres d'ADN pose les bases pour la délivrance ciblée de médicaments et les traitements de prochaine génération. Nos résultats ont montré que les TDN pouvaient entrer dans les cellules sans agents de transfection, ce qui est similaire aux résultats de Walsh et al. et Ma et al. [15, 19]. Comparé à celui des TDN, l'internalisation de l'Apt-TDN par les cellules U87MG était significativement augmentée. Après l'addition d'aptamère libre, cette augmentation disparaissait. Ce résultat suggère que Gint4.T est un antagoniste spécifique de PDGFRβ [25]. Notre étude a démontré que l'aptamère Gint4.T pouvait cibler les cellules U87MG en raison de la forte expression de PDGGRβ à la surface des cellules de gliome. Camorani et al. [24] ont également montré que l'aptamère Gint4.T pouvait cibler les cellules tumorales en interagissant spécifiquement avec le domaine extracellulaire de PDGFRβ. Les avantages du ciblage par l'aptamère Gint4.T ont été démontrés dans une certaine mesure via des études in vitro, mais des tests in vivo supplémentaires sont requis pour confirmer ces résultats. Cette étude a également confirmé que le DOX@Apt-TDN est plus cytotoxique que DOX ou DOX@TDN, ce qui provient probablement de deux facteurs. Premièrement, l'aptamère Gint4.T peut se lier spécifiquement aux domaines extracellulaires de PDGFR, bloquant la prolifération des cellules tumorales et inhibant la croissance des cellules tumorales [24]. Cela est cohérent avec nos résultats expérimentaux. Comparé au groupe contrôle, les changements du cycle cellulaire U87MG après traitement avec DOX, DOX@TDN et DOX@Apt-TDN ont augmenté significativement dans les cellules tumorales en phase G0/G1, diminué dans les cellules en phase S, et bloqué les cellules tumorales en phase G0/G1, indiquant qu'ils peuvent inhiber le cycle cellulaire des cellules U87MG et inhiber leur prolifération. Comparé aux groupes DOX et DOX@TDN, le groupe DOX@Apt-TDN avait une capacité significativement plus forte à inhiber la prolifération des cellules U87MG. De plus, Gint4.T se lie spécifiquement aux cellules tumorales et améliore le ciblage cellulaire du complexe DOX@Apt-TDN. Ainsi, nous pouvons augmenter l'efficacité de ciblage du médicament et réduire la dose d'administration systémique des médicaments antitumoreaux pour prévenir leurs effets secondaires systémiques.

Conclusions

La modification avec Gint4.T a augmenté la spécificité et l'efficacité des TDN dans le traitement du gliome en ciblant le PDGFRβ qui est exprimé en grandes quantités sur les cellules de gliome. De plus, quand chargé avec Apt-TDN, il pouvait significativement promouvoir les effets anti-gliome de DOX. Par conséquent, DOX@Apt-TDN peut servir de stratégie thérapeutique prometteuse contre le gliome pour les patients. La déficience de cette étude est qu'elle a seulement été vérifiée in vitro. Dans l'étude ultérieure, nous explorerons davantage dans des modèles animaux.

Disponibilité des données et matériaux

Les données pertinentes sont incluses dans l'article.

Abréviations

BHE :

Barrière hémato-encéphalique

BHT :

Barrière hémato-tumorale

TDN :

Nanostructures tétraédriques d'ADN / Tétraèdres d'ADN

DOX :

Doxorubicine

PDGFRβ :

Récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes β

Apt-TDN :

TDN modifié par Gint4.T

DOX@TDN :

TDN chargé de DOX

DOX@Apt-TDN :

TDN modifié par Gint4.T chargé de DOX

SNC :

Système nerveux central

ANG :

Angiopep-2

LRP-1 :

Protéine 1 liée au récepteur des lipoprotéines de basse densité

SELEX :

Enrichissement exponentiel

PNPs :

Nanoparticules polymériques

GBM :

Glioblastome

FBS :

Sérum fœtal bovin

DMEM :

Milieu de Dulbecco modifié Eagle

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

AFM :

Microscopie à force atomique

CCK-8 :

Kit de comptage cellulaire-8

Cy3 :

Sulfo-Cyanine3

DAPI :

4′,6-Diamidino-2-phénylindole