rGO Modifié par HBP Hydrophile Permet une Libération DOX Double Déclencheur pH/NIR pour Chimiothérapie-Photothermie Synergique

Résumé

Nous rapportons une voie aisée pour synthétiser de l'oxyde de graphène réduit hydrophile (NrGO) en réduisant l'oxyde de graphène (GO) avec un polymère hyperbranché amino-terminé (NHBP). Le NrGO présente une excellente dispersibilité aqueuse, une forte absorption proche infrarouge (NIR), une conversion photothermique efficace, et une stabilité chimique. Le chargement de l'agent chimiothérapeutique doxorubicine (DOX) sur NrGO produit un vecteur de médicament double-réactif libérant le DOX plus rapidement sous conditions acides tumorales ou sous irradiation laser NIR. Des études in vitro confirment que le NrGO est biocompatible, et DOX@NrGO obtient une inhibition supérieure des cellules tumorales comparé au DOX libre, démontrant une synergie chimiothérapie-photothermie efficace. Ces résultats mettent en avant DOX@NrGO comme plateforme prometteuse pour la thérapie cancéreuse combinée et autres applications biomédicales.

Introduction

La thérapie photothermique (PTT) proche infrarouge (NIR) a émergé comme stratégie peu invasive pour le traitement du cancer car la lumière NIR (700–1100 nm) pénètre les tissus avec faible absorption, épargnant les cellules saines tout en permettant un chauffage localisé. Pour la PTT, l'agent thérapeutique doit combiner haute efficacité de conversion photothermique, bonne biocompatibilité, et stabilité colloïdale en milieu aqueux.

Les matériaux à base de graphène ont attiré l'attention comme agents PTT grâce à leur structure bidimensionnelle, grande surface, et propriétés optiques réglables. Cependant, le rGO conventionnel produit par méthodes chimiques ou hydrothermales conserve souvent un caractère hydrophobe, limitant son applicabilité en systèmes biologiques.

Nous avons adressé cette limitation en employant un polymère hyperbranché amino-terminé hydrosoluble et réducteur (NHBP) pour convertir le GO en rGO hydrophile et stable (NrGO). Des travaux antérieurs ont démontré la capacité du NHBP à fonctionnaliser des nanoparticules métalliques tout en préservant la dispersibilité.

De plus, le chargement de médicaments cytotoxiques sur des vecteurs photothermiques peut synergiser chimiothérapie et PTT, la chaleur n'ablant pas seulement les cellules tumorales mais accélérant aussi la libération du médicament. Ici, nous décrivons la synthèse du rGO modifié NHBP, ses propriétés photothermiques, le chargement de DOX, la libération de médicament déclenchée pH/NIR, et l'efficacité chimiothérapie-photothermie résultante contre les cellules HeLa.

Matériaux et Méthodes

Matériaux

L'oxyde de graphène (GO, 0,8–1,2 nm épais, 0,5–5 µm large) provenait de XFNANO Co., Ltd. La doxorubicine (DOX) était achetée chez HuaFeng United Technology Co., Ltd. Le milieu DMEM, sérum bovin fœtal (FBS), trypsine, pénicilline (100 U/mL), streptomycine (100 µg/mL) étaient fournis par Thermo Fisher Scientific. MTT, DAPI, et réactifs PI de Beyotime Biotechnology. Tous autres réactifs grade analytique de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.

Préparation du Polymère Hyperbranché Amino-Terminé (NHBP)

Le polymère hyperbranché amino-terminé (NHBP) était synthétisé suivant notre protocole antérieur. En bref, tétraéthylènepentamine (94 mL, 0,5 mol) était agitée sous azote dans un ballon trois cols 250 mL. Une solution de méthacrylate de méthyle dans le méthanol (43 mL, 0,5 mol) était ajoutée goutte à goutte, puis le mélange était chauffé et refroidi alternativement, suivi de 4 h d'agitation à température ambiante. Le produit était isolé par évaporation rotative à 150 °C, donnant un polymère visqueux jaunâtre de poids moléculaire moyen ~7759.

Préparation du NrGO Réduit par NHBP

Le GO était dispersé dans l'eau déionisée et ultrasons avec NHBP à ratios massiques 1:10, 1:20, et 1:30 pendant 10 min, puis agité à 90 °C pendant 1 h. Les suspensions résultantes (NrGO-10, NrGO-20, NrGO-30) étaient centrifugées et lavées trois fois à l'eau.

Préparation du DOX Chargé sur NrGO (DOX@NrGO)

La suspension NrGO était mélangée avec solution DOX à ratio massique 1:1 et agitée à température ambiante pendant 24 h. Le composite était collecté par centrifugation et lavé pour obtenir DOX@NrGO.

Caractérisation et Mesures

La microscopie électronique en transmission (MET, JEOL JEM-2100) examinait la morphologie. Les spectres infrarouge à transformée de Fourier (FTIR, Nicolet iS10) étaient enregistrés sur 400–4000 cm⁻¹ (résolution 4 cm⁻¹). Potentiel zêta et taille hydrodynamique mesurés par NanoBrook 90plus Zeta analyzer. Absorption UV-vis-NIR (400–900 nm, résolution 1 cm⁻¹) sur Thermo Fisher Evolution 300. Performance photothermique évaluée avec laser 808 nm (SFOLT Co.) et thermomètre thermocouple (DT-8891E). L'échantillon (0,2 mL) sur spot 0,25 cm² irradié à 1 W cm⁻² pendant 5 min, variations de température enregistrées en temps réel.

Essai de Libération de Médicament

DOX@NrGO placé dans sac dialyse (COPM 8000) contenant PBS (pH 7,4 ou 4,0) incubé à 37 °C avec agitation 100 tr/min. Pour groupe NIR, le sac irradié 5 min après chaque point de prélèvement. À chaque intervalle, 10 mL de PBS prélevé, remplacé par tampon frais, et concentration DOX déterminée par spectrophotométrie UV-vis.

Cytotoxicité Cellulaire et Évaluation Chimiothérapie-Photothermie

Cellules HeLa ensemencées à 5×10³ cellules/puits en plaques 96 puits, incubées jusqu'à ~80 % confluence. Cellules traitées avec NrGO (3,125–50 µg mL⁻¹) pendant 24 et 48 h, viabilité mesurée par essai MTT selon Équation (1). Après 4 h incubation avec DOX@NrGO (3,125–50 µg mL⁻¹), cellules HeLa irradiées laser 808 nm (0,5 W cm⁻²) 5 min et cultivées 20 h supplémentaires. Viabilité évaluée par MTT, morphologie cellulaire examinée par coloration DAPI et PI en microscopie confocale.

Viabilité cellulaire (%) = (OD_échantillon / OD_témoin) × 100%.

Résultats et Discussion

Caractérisation Physico-Chimique

La réduction du GO par NHBP a transformé la suspension brune en solution noire dispersible dans l'eau, confirmant la conversion réussie. Les images MET (Fig. 2) montrent que NrGO-30 conserve une structure monocouche sans agrégation, indiquant que NHBP ne perturbe pas la morphologie du graphène. Les spectres FTIR (Fig. 3) révèlent la disparition du pic 1725 cm⁻¹ C=O du GO et l'apparition d'un signal amide C–N à 1633 cm⁻¹, confirmant l'attachement covalent du NHBP. Les mesures de potentiel zêta (Fig. 4) démontrent un passage de valeurs négatives (GO) à positives (NrGO), soutenant davantage la fonctionnalisation de surface. Les spectres UV-vis-NIR (Fig. 5) montrent une forte absorption sur la fenêtre NIR pour tous échantillons NrGO, alors que GO et NHBP seuls montrent une réponse NIR négligeable. La taille hydrodynamique (Fig. 6) reste constante selon les ratios NHBP, indiquant une stabilité de taille.

Propriétés Photothermiques

Sous irradiation 808 nm, l'eau montrait un chauffage négligeable, tandis que GO élevait <5 °C. En contraste, les échantillons NrGO atteignaient 40–45 °C à 200 µg mL⁻¹, avec ratios NHBP plus élevés produisant des élévations de température supérieures (Fig. 7). La température augmentait proportionnellement à la concentration NrGO et à la puissance laser, atteignant la fenêtre thérapeutique (~41–43 °C) sans endommager les cellules normales. Le cyclage photothermique (Fig. 7d) et l'UV-vis post-irradiation (Fig. 8) confirment une excellente stabilité et rétention des propriétés optiques.

Comportement de Livraison de Médicament

La libération de DOX depuis DOX@NrGO était nettement améliorée en conditions acides (pH 4,0) et sous irradiation NIR (Fig. 9). Le pH acide ionise les groupes amines du NHBP, réduisant la liaison électrostatique au DOX et favorisant la libération. Le chauffage NIR accélère le mouvement moléculaire, accélérant davantage la diffusion du médicament. Ainsi, DOX@NrGO offre une double réactivité adaptée aux microenvironnements tumoraux.

Cytotoxicité du NrGO

Les essais MTT (Fig. 10a) indiquent >80 % viabilité cellulaire à 50 µg mL⁻¹ après 24 h, confirmant une faible toxicité intrinsèque et l'adéquation comme vecteur de médicament.

Inhibition Synergique des Cellules Tumorales

Le traitement par DOX@NrGO seul réduisait la viabilité HeLa de manière dose-dépendante (Fig. 10b). Combiné à l'irradiation NIR (0,5 W cm⁻², 5 min), la viabilité cellulaire diminuait significativement plus, prouvant la synergie chimiothérapie-photothermie. Les images confocales (Fig. 11) montrent des noyaux dispersés avec DOX@NrGO, tandis que l'irradiation induit un décollement cellulaire extensif. La coloration PI (Fig. 12) révèle une augmentation des cellules mortes après thérapie combinée, corroborant l'effet cytotoxique accru.

Conclusions

En résumé, nous avons développé un NrGO modifié NHBP hydrosoluble, simple, avec conversion photothermique robuste et stabilité colloïdale. Le chargement de DOX confère une libération déclenchée pH et NIR, et le système DOX@NrGO atteint une inhibition supérieure des cellules tumorales par chimiothérapie-photothermie in vitro. Ces résultats démontrent la promesse de DOX@NrGO comme plateforme versatile pour la thérapie du cancer et autres applications biomédicales.

Abréviations

CLSM

Microscopie confocale à balayage laser

DAPI

4′,6-diamidino-2-phénylindole

DOX

Doxorubicine

DOX@NrGO

DOX chargé sur NrGO

FTIR

Infrarouge à transformée de Fourier

GO

Oxyde de graphène

HBP

Polymère hyperbranché

MTT

Thiazolyl bleu tétrazolium

NHBP

HBP amino-terminé

NIR

Proche infrarouge

NrGO

Oxyde de graphène réduit par polymère hyperbranché amino-terminé

PI

Iodure de propidium

PTT

Thérapie photothermique

rGO

Oxyde de graphène réduit

MEB

Microscopie électronique à balayage

MET

Microscope électronique en transmission