Immunodosage ultra-sensible sans étiquette utilisant biosenseurs plasmoniques hybrides nanoparticules d'or–oxyde de graphène

Contexte

Les nanomatériaux carbonés — graphène, nanotubes de carbone, oxyde de graphène (GO) — sont devenus incontournables en biosensing grâce à leurs propriétés électriques, optiques et de chimie de surface exceptionnelles. La structure bidimensionnelle du GO et ses groupes fonctionnels riches en oxygène (époxydes, hydroxyles, carboxyls) confèrent une forte affinité protéique et permettent le couplage covalent, en faisant un substrat attractif pour capteurs électrochimiques, fluorescence, SPR et LSPR. Les nanoparticules d'or (AuNP) apportent une absorption plasmonique ajustable, biocompatibilité et chimie de surface aisée, leur permettant d'agir comme amplificateurs de signal ou étiquettes optiques. Lorsque les AuNP sont décorées sur GO, l'hybride hérite de la liaison rapide du GO et du LSPR intense des AuNP, menant à une sensibilité accrue dans les immunoessais, détection d'ADN et essais enzymatiques. Malgré de nombreuses études électrochimiques et SERS, aucun immunoessai colorimétrique rapide ou sans étiquette basé sur hybrides AuNP‑GO nus n'a été rapporté à ce jour. Cette étude comble cette lacune en développant un immunoessai basé sur chimisorption, LSPR-amélioré, opérant en tampon aqueux et tolérant les interférents courants.

Méthodes/Expérimental

Matériaux

Graphite (Graphene Supermarket), GO (méthode Hummer modifiée, flocons 0,1–1 µm, 1,1 nm épais), cystamine dihydrochlorure (Cys, 96 %), HAuCl₄·3H₂O (99,99 %), citrate de sodium, BSA, anti‑BSA (IgG lapin), NHS, EDC tous obtenus de Sigma‑Aldrich ou Alfa Aesar. Tous réactifs utilisés sans purification supplémentaire.

Synthèse des AuNP

Les AuNP ont été synthétisés par réduction au citrate : 15 mL de HAuCl₄ 1 mM refluxés à 550 °C, 1100 tr/min ; 1,8 mL de citrate de sodium 38,8 mM ajouté. Après 5 min, le mélange bouilli à 400 °C, 900 tr/min pendant 30 min et refroidi à température ambiante. Cette procédure donne des AuNP sphériques ~15 nm ; utiliser 0,8 mL citrate produit ~60 nm particules. La réaction : HAuCl₄ + C₆H₅O₇Na₃ → Au(s) + CO₂ + HCOOH.

Préparation de l'antigène cible GO‑BSA

Les feuillets GO (0,1 g L⁻¹) ont été activés avec EDC (400 µM) et NHS (100 µM) (rapport volumique 1:1). BSA (20 µL, 100 µg mL⁻¹) a été couplé covalentement via formation liaison amide et purifié par centrifugations répétées. La figure 1 illustre le flux de travail de conjugaison GO‑BSA.

Interaction GO‑BSA. Le groupe carboxyle des feuillets GO peut être activé par réaction EDC/NHS et préparation de l'antigène cible basé sur GO pour GO‑BSA

Préparation de la sonde AuNP‑antiBSA

Les AuNP ont été fonctionnalisés avec Cys (10 mM, 2 h, RT) pour introduire groupes –NH₂ exposés. Anti‑BSA (20 µL, 100 µg mL⁻¹) a été couplé via liaisons amide sans activation additionnelle, suivi de centrifugation pour anticorps non liés. Dilutions sérielles de 100 µg mL⁻¹ à 1 pg mL⁻¹ ont produit une gamme de sondes AuNP‑antiBSA (Fig. 2a). Les composites AuNP‑GO‑antiBSA ont été assemblés par activation EDC/NHS des carboxylates GO et attachement covalent d'AuNP modifiés Cys, puis couplage anticorps (Fig. 2b).

Interactions AuNP‑antiBSA et AuNP‑GO‑antiBSA. Préparation de la sonde a AuNPs et b AuNP‑GO basée sur anticorps

Techniques de caractérisation

La caractérisation structurale et optique a employé ME-TEM, HR‑TEM, MEB (JEOL JSM‑7800F), spectroscopie UV‑vis (U‑2900, Hitachi), microscopie Raman (MRI, Protrustech), FTIR (Bruker Vertex 80v ATR), et XPS (Centre National de Radiations Synchrotron). La taille, distribution et chimie de surface des AuNP ont été confirmées sur tous échantillons.

Résultats et discussion

Morphologie et composition

MEB et MET ont révélé des AuNP uniformes 60 nm répartis uniformément sur feuillets GO froissés (Fig. 3). XPS a confirmé la présence de groupes fonctionnels C–C (sp²), C–C (sp³), C–O, C=O, O–C=O sur GO, tandis que les pics Au 4f vérifiaient l'intégration AuNP.

Analyse morphologie du nanocomposite. a Images MEB d'un feuillet GO et b image MET de composite AuNP‑GO. c Image MET du film ERGO AuNP‑GO

Caractérisation spectroscopique du GO

Les spectres XPS haute résolution C 1s, Raman, et ATR‑FTIR confirment les groupes fonctionnels oxygénés caractéristiques du GO (C sp², époxydes, hydroxyles, carbonyls, carboxyls). Les pics Raman à 1355 cm⁻¹ (D), 1614 cm⁻¹ (G), et 2714 cm⁻¹ (2D) corroborent la structure en couches (Fig. 4).

Analyse spectrale des feuillets GO. a XPS haute résolution région C1s, b Raman, et c FTIR

Interaction protéique et réponse LSPR

Les spectres UV‑vis des AuNP (15 nm et 60 nm) montrent des pics LSPR à 520 nm et 540 nm respectivement. GO seul affiche absorption π–π* à 230 nm et n–π* à 300 nm. Après fonctionnalisation, les conjugués AuNP‑Cys‑antiBSA exhibent des pics doubles à 540 nm (AuNP) et 755 nm (AuNP‑Cys‑antiBSA) avec décalage concentration-dépendant (Fig. 5). Courbes d'étalonnage (y = 2,43 + 0,25 x, R² = 0,91 pour 540 nm ; y = 2,56 + 0,31 x, R² = 0,96 pour 760 nm) confirment linéarité sur 1,45 nM à 145 fM anti‑BSA.

Analyse spectres UV‑vis absorption pour réponse interaction AuNP avec antiBSA. a Spectres absorption SP des AuNP, b GO‑BSA lié, c sonde AuNP‑anti‑BSA, et d Courbes étalonnage pour réponse interaction AuNP avec antiBSA à dilutions différentes concentrations antiBSA 1,45 nM ~ 145 fM

Les hybrides AuNP‑GO‑antiBSA amplifient davantage le signal LSPR. Lors de l'addition de cibles GO‑BSA, le pic 540 nm décale linéairement avec la concentration anti‑BSA (1,45 nM–145 fM), donnant une LOD de 145 fM (Fig. 6). L'étalonnage pour la sonde AuNP‑GO (f(x) = 0,918 + 0,124 x, R² = 0,94) et pour GO seul (f(x) = 0,791 + 0,057 x, R² = 0,954) démontrent la sensibilité supérieure du système hybride.

Analyse spectres UV‑vis absorption pour réponse immune. a AuNP‑GO lié et GO‑BSA lié, b AuNPs et GO‑anti‑BSA lié, c sonde AuNP‑GO‑antiBSA, et d sonde AuNP‑GO‑antiBSA et cible GO‑BSA pour réponse immune

Des études d'interférence avec 10 ng ml⁻¹ hCG ont montré une réactivité croisée minimale (R² = 0,89 pour AuNP‑GO ; 0,73 pour GO seul), confirmant la robustesse de l'essai. Le capteur a conservé sa performance après quatre cycles de régénération, indiquant une haute stabilité de surface.

Conclusions

Nous avons conçu un hybride AuNP‑GO biocompatible exploitant le LSPR pour atteindre une détection sans étiquette d'anti‑BSA à 145 fM. Le nanocomposite exhibe une haute bioaffinité, réponse rapide, et résilience aux interférents courants, en faisant une plateforme convaincante pour immunoessais au point de soin. Les travaux futurs exploreront la détection multiplexée, l'intégration en dispositifs microfluidiques, et l'adaptation à biomarqueurs cliniquement pertinents.

Abréviations

Ag :

Argent

AntiBSA :

Anticorps albumine sérique bovine

Au :

Or

AuNP :

Nanoparticule d'or

BSA :

Albumine sérique bovine

Cys :

Cystamine

EDC :

1‑Ethyl‑3‑(3‑dimethylaminopropyl)carbodiimide

FEG‑TEM :

Microscope électronique à transmission à canon à émission de champ

FTIR :

Spectromètre infrarouge à transformée de Fourier

GO :

Feuillet oxyde de graphène

HR‑TEM :

Microscope électronique à transmission haute résolution

LOD :

Limite de détection

LSPR :

Résonance de plasmon de surface localisée

MOA :

Acide 8-mercaptooctanoïque

NHS :

N‑Hydroxysuccinimide

Pd :

Palladium

POCT :

Test au point de soin

Pt :

Platine

RGO :

Oxyde de graphène réduit

SAMs :

Monocouches auto-assemblées

SERS :

Diffusion Raman amplifiée de surface

UV‑vis :

Ultraviolet‑visible

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X

ZnO :

Oxyde de zinc