Biocompatibilité améliorée dans les matrices Anodic TaO x Nanotube

Contexte

Le tantale (Ta) est un métal rare, dur, très résistant à la corrosion et bio-inerte [1,2,3]. L'oxydation du matériau tantale, en formant un film d'oxyde très fin et impénétrable à sa surface, contribue à sa biocompatibilité. La grande flexibilité et la biocompatibilité du tantale rendent ses applications cliniques, telles que les implants dentaires, les implants orthopédiques et la reconstruction osseuse [4,5,6]. Récemment, le tantale s'est avéré avoir une meilleure biocompatibilité que le titane, telle qu'une formation de matrice extracellulaire plus abondante, une excellente adhérence et croissance cellulaire et une densité de cellules vivantes beaucoup plus élevée à la surface [7,8,9]. D'autre part, plusieurs études ont prouvé que la propriété physico-chimique distinctive de la géométrie de surface nanostructurée est le principal facteur influençant le comportement cellulaire [10,11,12]. La surface idéale du biomatériau devrait être en mesure de fournir l'environnement optimal pour la croissance cellulaire. Ruckh et al. ont démontré que les nanotubes de Ta anodisés fournissent un substrat pour une meilleure ostéointégration par rapport à une surface plane [13]. Un matériau de tantale poreux récemment développé, imitant les propriétés de l'os, permet la croissance des tissus mous et de l'os qui fournit une bonne fixation biologique [14,15,16,17]. La stabilité élevée et le potentiel de guérison du tantale poreux aident à fusionner les espaces entre les structures osseuses pendant la chirurgie reconstructive. Le tantale poreux a ainsi retrouvé beaucoup d'intérêt dans le domaine des biomatériaux en raison de ses nombreux avantages par rapport aux autres greffes, tels que l'absence de morbidité du site donneur, une stabilité élevée, d'excellentes propriétés ostéointégratives et la prévention du risque potentiel de transmission de maladies infectieuses [18,19,20 ,21]. Une revue clinique récente a montré que les patients ayant reçu des cupules acétabulaires en tantale poreuses présentaient un degré de fixation de l'implant plus élevé que ceux des cupules en titane (Ti) recouvertes d'hydroxyapatite [22,23,24,25].

Récemment, nous avons développé TiO₂ auto-organisé nanotubes de différents diamètres en utilisant une méthode d'anodisation électrochimique [26, 27]. Nous avons constaté que les cellules fibroblastiques humaines présentent un comportement spécifique au diamètre plus évident sur le CO₂ supercritique. (ScCO₂ )-traités que ceux des nanotubes bruts anodisés [27]. Nous avons ensuite fabriqué du TiO₂ décoré à l'Ag nanotubes par la méthode d'évaporation par faisceau d'électrons et ont trouvé le plus petit diamètre (25 nm de diamètre) Les nanotubes décorés d'Ag présentaient l'activité biologique la plus évidente en favorisant l'adhésion et la prolifération des fibroblastes humains ainsi que des cellules épithéliales nasales humaines [26]. Dans cette étude, nous avons fabriqué TaO _x nanotubes de diamètres différents par le même procédé d'anodisation électrochimique. Le comportement cellulaire, y compris l'adhésion cellulaire et la prolifération, en réponse au diamètre de TaO _x les nanotubes ont été étudiés. L'objectif de cette recherche est d'étudier la biocompatibilité des TaO _{x auto-organisés} réseaux de nanotubes avec différents diamètres de nanotubes fabriqués par anodisation électrochimique.

Méthodes

Préparation du TaO _x Nanotubes

Les feuilles de Ta ont été achetées auprès d'ECHO Chemical (épaisseur de 0,127 mm, pureté de 99,7 %, n° CAS 7440-25-7). Avant le processus d'anodisation, les feuilles de Ta ont été nettoyées par ultrasons dans de l'acétone, de l'isopropanol, de l'éthanol et de l'eau. Toutes les expériences d'anodisation ont été réalisées à 20 °C dans une solution d'acide sulfurique contenant 4,9 % en poids de HF, qui a été préparée à partir de produits chimiques de qualité réactif et d'eau déminéralisée. Une cellule électrochimique à deux électrodes avec Ta comme anode et Pt comme contre-électrode a été utilisée. Les tensions ont été ajustées de 10 à 40 V pour aboutir à TaO _x diamètres de nanotubes allant de 20 à 90 nm. Rayonnement UV de faible intensité (environ 2 mW/cm ² ) avec des ampoules fluorescentes à lumière noire sur TaO _x des échantillons de nanotubes pendant 8 h ont été effectués avant les tests biocompatibles.

Caractérisation des matériaux

La morphologie de la surface, le diamètre intérieur et extérieur, l'épaisseur de paroi et la longueur de TaO _x les nanotubes ont été caractérisés par microscopie électronique à balayage (MEB). La diffraction des rayons X (XRD) et la microscopie électronique à transmission (MET) équipées d'un spectromètre à dispersion d'énergie (EDS) ont été utilisées pour examiner la structure cristalline du TaO _x réseaux de nanotubes. Des mesures d'angle de contact ont été effectuées pour évaluer la mouillabilité de surface du TaO _x échantillons de nanotubes par la méthode d'extension à l'aide d'un microscope horizontal avec oculaire rapporteur. L'eau et le milieu de culture ont été utilisés comme liquides de test pour les mesures.

Culture de cellules de fibroblastes humains

Des fibroblastes humains MRC-5 (BRCC, Bioresource Collection and Research Center, Hsinchu, Taiwan, BCRC No. 60023) ont été étalés dans une plaque de culture tissulaire de 10 cm et cultivés avec du milieu essentiel minimum d'Eagle (Gibco) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ), 2 mM de l-glutamine, 1,5 g/L de bicarbonate de sodium, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels et 1,0 mM de pyruvate de sodium et dans 5 % de CO₂ à 37 °C. Les cellules ont ensuite été ensemencées sur le TaO _{x autoclavé} feuilles placées au fond d'une plaque de culture à 12 puits (Falcon) pour une étude plus approfondie.

Test d'adhérence cellulaire

Les cellules ont été ensemencées sur chaque TaO _x feuille à une densité de 2,5 × 10 ³ cellules/cm ² et incubé dans 5% de CO₂ à 37 °C pendant 3 jours et rincé deux fois avec du PBS. Les cellules adhérentes sur le substrat ont été fixées pendant 1 h dans du paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante, suivies de deux lavages dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et d'une perméabilisation avec 0,1 % de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) dans du PBS pendant 15 min à 4 °C. Après lavage avec du PBS, le filament d'actine a été marqué par incubation avec de la rhodamine phalloïdine (Life Technologies) à température ambiante pendant 15 min. Ensuite, les noyaux cellulaires ont été colorés par incubation avec du diamidino-2-phénylindole (DAPI) (Thermo FisherScientific) pendant 5 min. Les cellules ont été analysées sous un microscope à fluorescence (AX80, Olympus) pour examiner la morphologie de l'adhésion cellulaire et l'arrangement du cytosquelette. Pour l'observation SEM, les cellules ont été fixées avec une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % (Merck) pendant 1 h à température ambiante, puis rincées deux fois dans une solution de PBS, déshydratées dans une série d'éthanol (40, 50, 60, 70, 80, 90 et 100 %) et point critique séché avec un sécheur à point critique (CPD 030, Leica). Un mince film de platine a été appliqué sur les échantillons avant l'observation au SEM.

Test de prolifération cellulaire

Les cellules ont été ensemencées sur chaque TO _x substrats à densité de 1 × 10 ⁴ cellules/cm ² et cultivé pendant 1 semaine. Après 1 semaine, les échantillons ont été rincés deux fois avec du PBS et la prolifération cellulaire a été estimée en utilisant le kit de réactifs WST-1 (Roche, Penzberg, Allemagne). Le milieu contenant 10 % de réactif de prolifération cellulaire WST-1 a été ajouté à chaque échantillon et incubé dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO₂ à 37 °C pendant 2 h. La solution de chaque puits a été transférée dans une plaque à 96 puits. L'absorbance de la solution a été mesurée à 450 nm à l'aide du spectrophotomètre (Spectral Max250).

Analyse statistique

Toutes les expériences ont été réalisées en triple et au moins trois expériences indépendantes ont été réalisées. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart type (SD) et analysées par analyse des variances (ANOVA) en utilisant le logiciel SPSS 12.0 (SPSS Inc.). Un p une valeur de < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats et discussion

La figure 1a–e montre les images SEM de la feuille de Ta plate et du TaO _{x anodisé.} des réseaux de nanotubes avec un diamètre moyen de nanotubes de 20, 35, 65 et 90 nm, respectivement. Tous les TaO _{x anodisés} les nanotubes présentent une structure nanotubulaire bien définie, et leurs diamètres de nanotubes étaient presque proportionnels aux tensions appliquées. Parmi ces échantillons, les nanotubes de 20 nm de diamètre présentent une surface nanotubulaire relativement peu claire, comme le montre la zone agrandie tirée de la figure 1b. Cette observation peut être attribuée à l'intensité de champ plus faible en fonctionnement à basse tension dans le processus d'anodisation. La figure 2 montre en outre la session croisée de tous les TaO _x nanotubes et leurs longueurs nanotubulaires correspondantes. Des analyses XRD et MET ont été utilisées pour identifier davantage le TaO _x cristallinité des nanotubes. Comme le montrent les spectres XRD de la figure 3a, seuls les pics liés à la feuille de Ta sont observés (JCPDS Card n° 04-0788), suggérant que TaO _{x tel qu'anodisé} les nanotubes sont éventuellement en phase amorphe. La figure 3b montre une image MET représentative prise à partir d'un TaO _{x de 90 nm de diamètre} nanotube décollé de l'échantillon anodisé, révélant une structure nanotubulaire bien définie. Le motif de diffraction impeccable dans l'encart confirme que le TaO _x les nanotubes ne sont pas cristallins.

Images SEM montrant le a Surface en feuille de Ta et TaO _{x auto-organisé} nanotubes de diamètre b 20, c 35, d 65, et e 90 nm, respectivement

Images SEM montrant les sections transversales de TaO _x nanotubes de diamètre a 20, b 35, c 65, et d 90 nm, respectivement

un Spectres XRD de TaO _{x anodisé} nanotubes de différents diamètres et b Image TEM prise à partir d'un TaO _{x anodisé} nanotube d'un diamètre de 90 nm. L'encart montre également le motif de diffraction correspondant

L'étude précédente a rapporté que l'attachement cellulaire, la propagation et l'organisation du cytosquelette sont significativement meilleurs sur les surfaces hydrophiles par rapport aux surfaces hydrophobes [28]. Das et al. a en outre indiqué qu'un faible angle de contact implique une énergie de surface élevée, qui est également un facteur crucial qui contribue à une meilleure fixation cellulaire [29]. Il est donc essentiel de comprendre l'influence de TaO _x topographie des nanotubes sur la mouillabilité de la surface. Comme le montre la figure 4, tous les TaO _{x anodisés} les nanotubes sont très hydrophiles car leurs angles de contact sont bien inférieurs à 90°. De plus, leurs angles de contact diminuent de manière monotone avec la diminution du diamètre des nanotubes jusqu'à 35 nm, puis augmentent inversement lorsque le diamètre diminue jusqu'à 20 nm. Nous constatons également que le TaO _x les échantillons de nanotubes montrent la même tendance lors de l'utilisation d'eau ou de milieu de culture comme liquides de test. Nous tentons d'expliquer le comportement de mouillabilité observé sur la base de la loi de Wenzel, qui décrit le petit angle de contact sur les matériaux hydrophiles [30]. Dans le modèle de Wenzel, une augmentation de la rugosité de la surface du matériau hydrophile entraînera un angle de contact plus petit et l'eau remplira les rainures sous la gouttelette. Ici, nous utilisons le facteur de rugosité, c'est-à-dire la surface physique des nanotubes par unité de surface projetée, pour évaluer la rugosité géométrique de TaO _x échantillons de nanotubes [31]. Comme le montre la Fig. 5, avec un diamètre intérieur D , épaisseur de paroi W , et la longueur du nanotube L , le facteur de rugosité purement géométrique G peut être calculé comme [4πL {D + W }/ {√3(D + 2 W) ² }] + 1. Ce calcul suppose que toutes les surfaces des nanotubes sont parfaitement lisses. Les facteurs de rugosité calculés pour tous les échantillons de nanotubes sont résumés dans le tableau de la figure 5. À l'exception de l'échantillon de 20 nm de diamètre, les nanotubes de plus petit diamètre ont la plus grande rugosité géométrique et sont donc censés présenter une meilleure hydrophilie selon le modèle de Wenzel. Cette inférence est cohérente avec notre résultat selon lequel l'angle de contact diminue avec la diminution du diamètre du nanotube jusqu'à 35 nm. Cela explique également bien que les nanotubes de 20 nm de diamètre qui présentent une surface nanotubulaire relativement peu claire présentent une rugosité géométrique plus petite et une hydrophilie plus faible que les autres.

un –j Images optiques montrant des gouttelettes d'eau et de milieu de culture sur a ,f Surface en feuille de Ta et TaO_x auto-organisé nanotubes de diamètres b ,g 20, c ,h 35, d,i 65, et e ,j 90 nm, respectivement. Les angles de contact sont indiqués dans les images

Diagramme schématique d'une structure nanotubulaire idéalisée avec un diamètre interne D , épaisseur de paroi W , et la longueur du nanotube L . Les facteurs de rugosité calculés pour tous les échantillons de nanotubes de cette étude sont résumés dans le tableau

Le comportement des fibroblastes humains en réponse à la feuille plate de Ta et TaO _x les réseaux de nanotubes ont été étudiés plus avant. Pour évaluer l'attachement des fibroblastes sur le TaO _x nanotubes, l'actine du cytosquelette a été colorée avec de la rhodamine phalloïdine pour exprimer la fluorescence rouge et les noyaux colorés avec du DAPI pour exprimer la fluorescence bleue. L'immunocoloration de l'actine montre une morphologie de contact cellule-matériau distincte pour la feuille de Ta plate et TaO _x nanotubes de différents diamètres (voir Fig. 6). Il est bien connu que les cellules doivent d'abord adhérer à la surface du matériau, puis se propager pour une division cellulaire ultérieure. Une meilleure adhésion cellulaire peut provoquer une activation accrue des cascades de signalisation intracellulaire par l'intégrine couplée au cytosquelette d'actine [32,33,34]. FE-SEM a été utilisé pour l'observation détaillée de l'adhésion cellulaire (voir Fig. 7). Les fibroblastes sur le diamètre de 35 nm révèlent une excellente adhérence cellulaire avec une morphologie allongée aplatie. D'autre part, ces fibroblastes sur la feuille de Ta et TaO _{x de 90 nm de diamètre} les nanotubes montrent moins de cellules attachées et un manque de propagation cellulaire dans une certaine mesure. La zone de couverture des cellules sur les nanotubes a été en outre estimée à l'aide du logiciel ImageJ et notée dans ces images SEM. Semblable à la tendance des angles de contact, la zone de couverture diminue de manière monotone avec la diminution du diamètre du nanotube à 35 nm, puis augmente inversement à mesure que le diamètre diminue jusqu'à 20 nm. Le TaO _{x de 35 nm de diamètre} le nanotube présente en effet la plus grande zone de couverture cellulaire. Il est connu que les cellules reconnaissent les caractéristiques de surface lorsqu'un site approprié pour l'adhésion a été détecté. On suppose que les cellules peuvent stabiliser leurs contacts sur le TaO _x nanotubes en formant des adhérences focales et des fibres d'actine matures, puis en recrutant des microtubules de tubuline [35]. Le cytosquelette d'actine est lié à des intégrines qui sont situées au sein des adhérences. Nos résultats suggèrent que le cytosquelette sur les nanotubes de 35 nm de diamètre pourrait être mieux formé que ceux sur la feuille plate de Ta ou d'autres TaO _x réseaux de nanotubes.

Images de microscopie à fluorescence de la fixation des fibroblastes sur le a Ta foil et TaO _{x auto-organisé} nanotubes de diamètres b 20, c 35, d 65, et e 90 nm, respectivement. La fluorescence rouge indique le filament d'actine de la protéine du cytosquelette et la fluorescence bleue indique les noyaux

un –e Images SEM montrant l'adhésion cellulaire et la prolifération des cellules fibroblastiques humaines sur le a Surface en feuille de Ta et TaO_x auto-organisé nanotubes de diamètre b 20, c 35, d 65, et e 90 nm, respectivement. Les zones de couverture des cellules sur les échantillons estimées par le logiciel ImageJ sont notées dans les images

Le test WST-1 a été utilisé pour évaluer davantage la prolifération des fibroblastes sur le TaO _x nanotubes de différents diamètres. La figure 8 montre la comparaison des densités optiques mesurées à partir des résultats du test WST-1. Nous constatons que la prolifération cellulaire est la plus élevée pour le TaO _{x de 35 nm de diamètre} échantillon de nanotubes. Cependant, il n'y a pas de différence significative entre le groupe Ta et TaO _x réseaux de nanotubes. De plus, la prolifération cellulaire et la mouillabilité de surface présentent une tendance presque similaire avec le TaO _x diamètres des nanotubes. Cette observation suggère que non seulement le diamètre des nanotubes mais aussi la mouillabilité de la surface influencent fortement l'adhésion cellulaire et l'étalement qui s'ensuit. En d'autres termes, par rapport aux nanotubes de 35 nm de diamètre, ceux de 20 nm de diamètre peuvent donner plus de points focaux pour les cellules fibroblastiques, mais sa plus faible hydrophilie élimine certains contacts focaux efficaces et entrave ainsi l'attachement cellulaire. Finalement, le TaO _{x de 35 nm de diamètre} les nanotubes révèlent la biocompatibilité la plus élevée parmi tous les échantillons.

Densités optiques (QD) mesurées après la culture de cellules fibroblastiques humaines sur feuille de Ta et TaO _{x auto-organisé} nanotubes de différents diamètres. Les valeurs OD avec leurs écarts types sont répertoriées dans un tableau joint

Conclusions

En conclusion, ce travail étudie la biocompatibilité du TaO _{x anodisé} nanotubes avec différents diamètres de nanotubes. Tout TaO _{x anodisé} les nanotubes ont été identifiés comme étant principalement en phase amorphe. Nous discutons de la transition de la mouillabilité de surface avec TaO _x diamètres des nanotubes basés sur le modèle de Wenzel. L'évaluation de la biocompatibilité in vitro indique en outre que les cellules fibroblastiques présentent un comportement dépendant de la mouillabilité évident sur le TaO _x réseaux de nanotubes. Le TaO _{x de 35 nm de diamètre} les matrices de nanotubes révèlent la meilleure biocompatibilité parmi tous les échantillons de nanotubes. Cette amélioration pourrait être attribuée aux points focaux très denses fournis par TaO _x nanotubes en raison d'une plus grande hydrophilie de surface. Cette étude démontre que la biocompatibilité dans Ta peut être améliorée en formant TaO _x réseaux de nanotubes avec un diamètre de nanotube et une rugosité géométrique appropriés.