Optimisation de la nano-encapsulation sur des amas cellulaires néonatals de type îlots porcins à l'aide de polymères

Introduction

L'utilisation de la greffe d'allo-îlots dans le traitement du diabète de type 1 est limitée en raison du manque de donneurs appropriés. Au lieu de cela, il y a une augmentation progressive de l'utilisation d'îlots animaux dans la transplantation de xéno-îlots, les porcs devenant l'espèce donneuse optimale [1]. Lorsque des porcs sont utilisés comme donneurs lors de la transplantation, des îlots séparés peuvent être utilisés, en fonction de l'âge des porcs. Souvent, les amas cellulaires néonatals de type îlots porcins (NPCC) sont préférés aux îlots porcins adultes (API) en raison de leur prix abordable et de leur facilité d'isolement. De plus, les NPCC peuvent proliférer progressivement après la transplantation, prolongeant leur fonction in vivo [1, 2]. Cependant, lorsque les NPCC sont transplantés dans des veines portes humaines ou de primates non humains (NHP), des variations interspécifiques peuvent provoquer des réactions immunitaires telles qu'une réaction inflammatoire instantanée à médiation sanguine (IBMIR) ou un rejet hyperaigu, entraînant une perte précoce du greffon [3]. Pour résoudre ce problème, l'encapsulation de NPCC qui peuvent inhiber diverses réponses immunitaires est nécessaire. Il existe trois types d'encapsulation :la macro-, la micro- et la nano-encapsulation. La macro-encapsulation utilise un dispositif contenant des îlots, qui est ensuite implanté autour des vaisseaux sanguins pour libérer l'insuline à travers une membrane semi-perméable en réponse aux niveaux de glucose dans le sang. La micro-encapsulation emballe un petit nombre d'îlots dans une capsule poreuse. Bien que ces encapsulations puissent protéger les îlots du rejet immunitaire, des effets secondaires tels que l'effondrement de la membrane ou la génération de thrombus ont été rapportés dans des essais in vivo. Les îlots perturbent également le flux d'hormones, de nutriments ou d'oxygène en raison de l'augmentation de la distance de diffusion. La nano-encapsulation est la stratégie de modification de la surface cellulaire induisant l'attachement entre les cellules et les protéines exogènes, principalement le polyéthylène glycol (PEG), en transfusion sanguine [4].

La nano-encapsulation à l'aide de PEG a été largement utilisée comme méthode de modification pour améliorer l'efficacité et les propriétés physico-chimiques des protéines ou peptides cibles [5]. En particulier, la nano-encapsulation des îlots peut avoir des effets inhibiteurs en réponse à l'attaque des cellules immunitaires et à la reconnaissance des anticorps. Le PEG est largement utilisé pour le revêtement cellulaire en raison de ses propriétés biocompatibles telles que la non-immunogénicité, le masquage antigénique et l'effet de non-encrassement [6]. Parmi les nanoparticules utilisées pour la nano-encapsulation des NPCC, les « polymersomes » (PSomes) à base de PEG-bloc-poly lactide (PEG-b-PLA) sont les plus adaptées car stables et simples à modifier; ils peuvent également incorporer à la fois des réactifs hydrophiles et hydrophobes dans leur assemblage [7, 8]. La modification de surface des îlots à l'aide de polymères (contenant du PEG) est réalisée par liaison covalente ou non covalente entre la matrice extracellulaire (ECM) de l'îlot et le polymère conjugué à un groupe fonctionnel [9].

Dans des études précédentes, une solution saline équilibrée de Hank (HBSS, pH 8,0) a été utilisée comme tampon de réaction de nano-encapsulation d'îlots en raison de sa capacité à faciliter le N-hydroxysuccinimide (NHS)-NH₂ liant [10,11,12]. Cependant, pour minimiser les dommages cellulaires aux NPCC lors de la nano-encapsulation, nous avons utilisé un milieu F-10 (milieu de culture NPCC) avec un pH physiologique (pH 7,3). De plus, parce que la préservation de la quantité de NPCC après la nano-encapsulation est importante pour la transplantation de la bonne quantité de cellules, nous avons ajouté de la sérumalbumine bovine (BSA), qui recouvre le fond de la boîte de culture cellulaire avec un polymère à longue chaîne, pour augmenter la récupération taux [13]. Dans notre étude précédente, la nano-encapsulation de NPCC avec des PSomes a été réalisée via des groupes fonctionnels uniques, tels que NHS ou NH₂ , qui sont utilisés pour induire une liaison covalente ou une interaction électrostatique avec l'ECM des NPCC, respectivement. Cependant, comme l'affinité de liaison diminue avec le temps, des stratégies sont nécessaires pour augmenter l'efficacité de liaison [14]. Certains PS ayant des groupes bifonctionnels peuvent être utilisés comme candidats pour augmenter l'efficacité du revêtement en raison de leur capacité à s'agréger. Par conséquent, nous avons induit une réticulation entre les PSomes contenant des groupes bifonctionnels (NHS-/NH₂ -PSome) qui peuvent se lier non seulement à l'ECM des NPCC, mais aussi à chaque PSome par interaction covalente ou interaction électrostatique, augmentant ainsi l'efficacité de la nano-encapsulation.

Dans cette étude, nous avons étudié l'application possible de la nano-encapsulation sur les NPCC grâce à une méthode optimisée dans le domaine de la xéno-transplantation d'îlots porcins.

Matériaux et méthodes

Animaux

Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par l'Institutional Animal Care and Use Committee de l'Institute of MGENPLUS co. ltd. (#2019-1), et toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives établies par le comité. La chirurgie a été réalisée sous anesthésie générale et des efforts ont été déployés pour s'assurer que les animaux ressentent une douleur minimale. Les porcs ont été tués avant la pancréatectomie.

Isolement des amas cellulaires néonatals de type îlots porcins (NPCC)

Les NPCC ont été isolés à partir de porcelets âgés de 3 à 5 jours. En bref, les porcelets ont été anesthésiés à l'aide de kétamine (10 mg/kg, Yuhan, Séoul, Corée) et de chlorhydrate de xylazine (1 mg/kg, Rompun ; Bayer Corée, Séoul, Corée) injectés dans le muscle fémoral, puis tués par injection de chlorure de potassium ( Sigma-Aldrich, MO, USA) dans le cœur. Le pancréas a été exposé par une incision abdominale, récolté et immergé dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS, Biosesang, Gyeonggi-do, Corée) avec 8,3 mM de bicarbonate de sodium, 10 mM N-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-N′-( acide 2-éthanesulfonique) (HEPES) (Sigma-Aldrich, MO, USA) et 0,5% d'antibiotique-antimycotique (Biowest, MO, USA). Le pancréas a été coupé en 1 à 2 mm ³ fragments et digérés dans de la collagénase de type V (1 mg/ml, Sigma-Aldrich, MO, USA) dans du HBSS pendant 10 min. Du HBSS froid contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) (Biowest, MO, USA) a été ajouté au tissu pancréatique digéré pour arrêter l'activité enzymatique. Les tissus pancréatiques digérés ont été lavés dans HBSS, et après remise en suspension, les tissus ont été filtrés à travers un pluriStrainer 500 μm (pluriSelect, Leipzig, Allemagne) et lavés dans HBSS. Enfin, les NPCC ont été ensemencés et cultivés dans 5% de CO₂ à 37 °C dans du milieu F-10 (Gibco, CA, USA) additionné de 0,25% d'albumine de sérum bovin (BSA) (genDepot, TX, USA), 10 mM de nicotinamide, 10 mM de D-glucose, 2 mM de L-glutamine, 2 mM de chlorure de calcium dihydraté, 50 μM d'isobutylméthylxanthine (IBMX), 20 μg/ml de ciprofloxacine (Sigma-Aldrich, MO, USA) et 1 % d'antibiotique-antimycosique. Les NPCC ont été cultivés pendant 5 jours [15], avec 10 nM d'exendine-4 (Prospec, Ness-Ziona, Israël) ajoutés chaque jour au milieu de culture.

Évaluation in vitro des NPCC et des NPCC nano-encapsulés

Après culture, le nombre de NPCC a été compté comme équivalent d'îlots (IEQ) en utilisant un réticule oculaire dans l'oculaire. La viabilité a été évaluée par coloration à l'orange d'acridine (AO, 0,67 μM, Sigma-Aldrich, MO, États-Unis) et à l'iodure de propidium (PI, 75 μM, Sigma-Aldrich, MO, États-Unis). Pour effectuer le test de sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (GSIS), 20 à 30 NPCC ont été prélevés et pré-incubés avec une faible concentration de D-glucose (2,8 mM) dans du tampon bicarbonate de Krebs-Ringer (KRBB) pendant 1 h. Les NPCC ont ensuite été incubés avec une faible teneur en D-glucose (2,8 mM) dans du tampon KRBB pendant 1 h, suivi d'une solution à haute teneur en D-glucose (28,0 mM) dans du KRBB pendant 1 h. Les surnageants ont été collectés pour mesurer la sécrétion d'insuline sous des concentrations de glucose faibles et élevées [11]. La quantité d'insuline sécrétée par chaque échantillon a été mesurée à l'aide d'un kit ELISA Human/Canine/Porcine Insulin Quantikine (R&D systems, MN, USA). L'indice de stimulation (SI) a été calculé en divisant les quantités d'insuline à une glycémie élevée (28,0 mM) par celle à des concentrations de glucose faibles (2,8 mM).

Préparation du Polymersome (PSome)

Pour préparer des PSomes, des copolymères N-hydroxysuccinimide-poly (éthylène glycol)-bloc-poly (lactide) (10 mg/ml, NHS-PEG-b-PLA) ou amine-poly (éthylène glycol)-bloc-poly (lactide ) copolymères (10 mg/ml, NH₂ -PEG-b-PLA; Nanosoft polymers, NC, USA) ont été dissous dans 1 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO, Sigma-Aldrich, MO, USA). En plus de préparer un PSome bifonctionnel, chaque copolymère (NHS ou NH₂ -PEG-b-PLA) dissous dans du DMSO a été mélangé en proportions. De l'eau distillée (DH2O) a été ajoutée à la solution de polymère pour obtenir une concentration finale de 1 mg/ml. La solution de polymère a été soniquée dans un ultrasonicateur (Sea han ultrasonic, Séoul, Corée) pendant 5 min. Du 1,1′-Dioctadécyl-3,3,3′,3′-tétraméthylindodicarbocyanine, du sel de 4-chlorobenzènesulfonate (DiD; Biotium, CA, USA) a été ajouté à la solution de polymère pendant la sonication pour permettre la visualisation. Enfin, le mélange a été dialysé dans DH2O pendant 3 jours.

Nano-encapsulation

Le PSome a été dilué dans un tampon de réaction de nano-encapsulation (soit HBSS (pH 7,3 ou pH 8,0) ou des milieux F-10 simples sans suppléments (pH 7,3 ou pH 8,0), avec ou sans 0,25% de BSA). La nano-encapsulation a été réalisée en ajoutant le PSome aux NPCC dans des milieux de culture. Pour ce faire, 10 000 IEQ de NPCC ont été ensemencés dans une boîte de culture cellulaire à 6 puits (SPL, Gyeonggi-do, Corée), et du PSome dilué a été ajouté aux NPCC et incubé dans 5% de CO₂ à 37 °C pendant 1 h. Un groupe de contrôle négatif (NC) (NPCC non revêtus sans PSomes) a été incubé dans les mêmes conditions que le groupe expérimental. Après incubation, les NPCC nano-encapsulés ont été récoltés et cultivés dans des milieux de culture F-10.

Efficacité des NPCC nano-encapsulés

Les NPCC nano-encapsulés de PSome conjugués DiD ont été visualisés par microscopie à fluorescence (Leica, Wetzlar, Allemagne) ou par microscopie confocale à balayage laser (CLSM; Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne). L'intensité des NPCC liés au PSome conjugués à DiD a été quantifiée en calculant l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) à l'aide du logiciel ImageJ (NIH, Bethesda, États-Unis). Les noyaux dans la cellule ont été contre-colorés avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).

Dosage de perméabilité des polymères

Les NPCC nano-encapsulés NHS-PSome dans F-10 ou F-10 (0,25 % de BSA) ont été incubés avec du dextrane conjugué à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) de différents poids moléculaires (10, 20, 70 et 250 kDa) pendant 2 h . La pénétration du dextran conjugué au FITC dans les NPCC nano-encapsulés NHS-PSome a été confirmée pour chaque poids moléculaire via un microscope confocal à balayage laser.

Dosage de la viabilité cellulaire des polymères

Le NHS-PSome nano-encapsulé THP-1 (lignée cellulaire monocytaire humaine) dans RPMI 1640 (Biowest, MO, USA) a été incubé pendant 1 h. La viabilité du THP-1 nano-encapsulé NHS-PSome a été mesurée selon le protocole présenté dans le kit de test de prolifération cellulaire MTT (iNtRon Biotechnology, Seongnamsi, Corée).

Analyse statistique

Un test t non apparié a été effectué dans GraphPad Prism 6.0. La signification statistique a été exprimée sous la forme *, ** *** et **** indiquant le P valeur de ≤ 0,05, ≤ 0,01, ≤ 0,001 et ≤ 0,0001.

Résultats

Évaluation culturelle et fonctionnelle des NPCC

Les NPCC ont été cultivés pendant 5 jours et des contrôles de qualité, y compris la viabilité et le GSIS, ont été effectués. Le nombre total de NPCC était de 21 014,0 IEQ/g/pancréas. La viabilité, en utilisant la coloration AO/PI, était de 89,9 %. Le GSIS, qui a été réalisé pour confirmer la réactivité des NPCC à la concentration de glucose, a donné un indice de stimulation (SI) moyen de 2,3 (tableau 1, fichier supplémentaire 1 :Fig. S1).

Pome concentration requise pour une nano-encapsulation efficace des NPCC

Pour déterminer la concentration de PSome requise pour une nano-encapsulation efficace, nous avons ajouté des concentrations variables de NHS-PSome aux NPCC. NHS-PSome a été stocké à une concentration de 1 mg/ml en DH₂ O et dilué à 1:5, 1:10, 1:20 et 1:40 pour donner des concentrations finales allant de 0,2 à 0,025 mg/ml. L'efficacité de la nano-encapsulation a été mesurée par l'IMF de NPCC nano-encapsulés PSome chargés de DiD. La concentration finale de 0,1 mg/ml (dilution 1:10) a montré l'intensité de fluorescence la plus élevée à 2 jours après la nano-encapsulation (Fig. 1a et b) et la nano-encapsulation subséquente des NPCC a été réalisée à cette concentration.

Optimisation de la concentration de PSome pour une nano-encapsulation efficace à 0 et 2 jours. Optimisation de la concentration de PSome pour une nano-encapsulation efficace. un Le NHS-PSome chargé de DiD a été traité dans des NPCC à diverses concentrations (BF; champ clair). Les barres d'échelle représentent 200 μm. b MFI de NPCC nano-encapsulés PSome à charge DiD (n = 3) et commande CN (n = 1)

Amélioration de l'efficacité de la nano-encapsulation dans les milieux F-10 avec pH physiologique

La nano-encapsulation des îlots pancréatiques (contenant des NPCC) est souvent réalisée dans un tampon HBSS basique (pH 8,0 ou supérieur) pour améliorer l'affinité de liaison entre le NH2 dans l'ECM des îlots et le NHS conjugué dans le polymère. Cependant, la nano-encapsulation dans un tampon HBSS de base peut potentiellement endommager les NPCC. Ainsi, pour minimiser les dommages des NPCC et déterminer l'effet du pH sur le NHS-NH₂ liant, les NPCC ont été nano-encapsulés via NHS-PSome dans des tampons HBSS ou des milieux de culture F-10 simples (utilisés dans cette étude pour cultiver des NPCC) avec un pH de 7,3 (physiologique) ou un pH de 8,0 (basique), respectivement. Lorsque les NPCC ont été nano-encapsulés dans F-10, la morphologie normale des NPCC a été maintenue (Fig. 2a), et l'efficacité de la nano-encapsulation basée sur le MFI a été considérablement augmentée par rapport à celle du groupe HBSS, quel que soit le pH au jour 0. et 6 (Fig. 2b). Bien que les groupes HBSS aient montré une différence significative entre le pH 7,3 et 8,0 au jour 6, l'intensité de la nano-encapsulation était significativement diminuée par rapport à celle du groupe F-10. Ainsi, nous avons utilisé un milieu de culture physiologique F-10 (pH 7,3) comme tampon de réaction de nano-encapsulation dans des expériences ultérieures pour minimiser les dommages potentiels des NPCC.

Comparaisons de l'efficacité du revêtement de la nano-encapsulation dans divers tampons de réaction à 1 et 6 jours. Comparaisons de l'efficacité du revêtement de la nano-encapsulation dans divers tampons de réaction. un NPCC nano-encapsulés dans HBSS (pH 7,3 et pH 8,0) ou F-10 (pH 7,3 et pH 8,0) à l'aide de NHS-PSome conjugué DiD (BF; champ clair). Les barres d'échelle représentent 200 um; b MFI de NPCC nano-encapsulés dans HBSS (pH 7,3 et pH 8,0) ou F-10 (pH 7,3 et pH 8,0) en utilisant le NHS-PSome conjugué DiD (tous les groupes ; n = 3). Les données représentent la moyenne  ± S.D. *p < 0,05, ****p < 0.001 et ****p < 0,0001 par rapport aux autres groupes

Taux de récupération accru des NPCC après nano-encapsulation

Bien que les dommages cellulaires des NPCC aient été minimisés dans le F-10, la quantité de NPCC collectés après la nano-encapsulation a été nettement réduite. Pour résoudre ce problème, nous avons ajouté 0,25% de BSA au milieu F-10 pendant la culture et la nano-encapsulation de NPCC à l'aide de NHS-PSome. Nous avons initialement confirmé si l'ajout de 0,25% de BSA dans le milieu F-10 affecte l'efficacité du revêtement et la perméabilité sélective, permettant le passage de petites molécules (dextrane conjugué au FITC 10 et 20 kDa) tout en bloquant les molécules plus grosses (conjugué au FITC 70 et 250 kDa) dextrane), en tant que fonction essentielle du PSome. En conséquence, le revêtement conforme a été montré dans les images de CLSM (Fig. 3a, Mid) et la perméabilité sélective a été maintenue normalement (Fig. 3b, dextrane conjugué au FITC) dans des NPCC nano-encapsulés NHS-PSome avec du F-10 contenant 0,25 % BSA par rapport au F-10, bien que le MFI ait été légèrement réduit (Fig. 3b). Les quantités de NPCC collectées après nano-encapsulation ont montré un taux de récupération significativement plus élevé (71,9%) dans le F-10 avec 0,25% de BSA que dans le F-10 sans BSA (42,3%) (Fig. 3c). La viabilité (NC :89,5 %, NHS-PSome :90,3 %) et la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (NC :2,1, NHS-PSome :1,6) des NPCC dans F-10 avec 0,25 % de BSA ont également été maintenues après nano-encapsulation (Fig. . 4a, b, Fichier supplémentaire 1 :Fig. S2). Nos résultats indiquent que l'ajout de 0,25% de BSA peut améliorer considérablement le taux de récupération des NPCC après nano-encapsulation et n'a pas affecté l'efficacité du revêtement ou la fonction de PSome.

Comparaisons de l'efficacité du revêtement après addition de 0,25% de BSA dans des tampons de réaction de nano-encapsulation pour augmenter le taux de récupération. Comparaisons de l'efficacité du revêtement après addition de 0,25% de BSA dans des tampons de réaction de nano-encapsulation pour augmenter le taux de récupération. un Efficacité de revêtement et perméabilité sélective des NPCC nano-encapsulés avec NHS-PSome dans F-10 ou F-10 avec 0,25% de BSA (BF ; champ clair, milieu ; image moyenne utilisant le CLSM de NPCC nano-encapsulés NHS-PSome conjugués DiD, Dextrane conjugué au FITC ; image du milieu utilisant le CLSM du dextrane conjugué au FITC dans des NPCC nano-encapsulés NHS-PSome). Le bleu au milieu représente la cellule par coloration DAPI. Les barres d'échelle sont de 200 (BF et DiD) et 100 (dextrane Mid et FITC conjugué) m ; b MFI de NPCC nano-encapsulés utilisant NHS-PSome conjugué DiD ; c Taux de récupération des NPCC après nano-encapsulation dans le F-10 (n = 12) ou F-10 avec 0,25% BSA (n = 12). Les données représentent la moyenne  ± S.D. *p < 0,05 contre F-10

Viabilité et fonctionnalité des NPCC nano-encapsulés NHS-PSome utilisant F-10 avec 0,25% de BSA. Viabilité et fonctionnalité des NPCC nano-encapsulés NHS-PSome utilisant F-10 avec 0,25% de BSA. un Viabilité des NPCC nano-encapsulés NHS-PSome (n = 6) et commande CN (n = 6) ; b SI des NPCC nano-encapsulés NHS-PSome (n = 5) et commande CN (n = 5). Les données représentent la moyenne  ± S.D

Stabilité améliorée de la nano-encapsulation grâce à la réticulation des PSomes

Pour induire une nano-encapsulation plus stable des NPCC, nous avons tenté de conjuguer des PSomes ayant deux groupes fonctionnels différents. Tout d'abord, nous avons effectué une nano-encapsulation des NPCC en ajoutant simultanément différentes proportions de PSomes contenant du NHS et du NH₂ groupes bifonctionnels (NHS-/ NH₂ -PSome) dans un PSome (Schéma 1). L'efficacité de la nano-encapsulation a été confirmée par le MFI de DiD conjugué dans des NPCC nano-encapsulés PSome. Les images résultantes de la microscopie à fluorescence n'ont montré aucune différence significative entre les groupes 9:1, 5:5 et 1:9 de NPCC nano-encapsulés NHS-/NH2-PSome (9:1, 5:5, 1:9) au jour 0 et le jour (Fig. 5a). Cependant, dans les résultats CLSM, le groupe 5:5 semblait être surenduit et 1:9 présentait un revêtement insuffisant tandis que le groupe 9:1 formait un revêtement conforme, le jour 1 (Fig. 5b). Par conséquent, nous avons déterminé que le rapport optimal de NHS-/NH2 dans PSome était de 9:1. Lorsque des tests fonctionnels ont été effectués pour le groupe 9:1, nos résultats ont montré que la viabilité du groupe 9:1 était significativement diminuée par rapport à celle du contrôle NC (92,1%), mais la viabilité était maintenue à des niveaux normaux (87,8 %). La fonction SI du groupe 9:1 était normale (3.0) par rapport à celle du contrôle NC (3.7) (Fig. 5c,d).

L'illustration de l'amélioration de la stabilité de la nano-encapsulation par réticulation des PSomes

Efficacité de revêtement et fonctionnalité de NHS-/NH₂ - Certains NPCC nano-encapsulés. Efficacité de revêtement et fonctionnalité de NHS-/NH₂ - Certains NPCC nano-encapsulés. un DiD conjugué 9:1, 5:5, 1:9 de NHS-/NH₂ - Certains NPCC nano-encapsulés (9:1, 5:5, 1:9) (NC ; NPCC non revêtus). MFI montre l'intensité des NPCC nano-encapsulés PSome conjugués DiD (n = 3) et commande CN (n = 3). Les barres d'échelle représentent 200 um; b CLSM de NHS-/NH₂ conjugué DiD -PSome NPCC nano-encapsulés (milieu ; image du milieu utilisant CLSM de NHS-/NH₂ conjugué DiD - Certains NPCC nano-encapsulés). Le bleu au milieu représente la cellule par coloration DAPI. Les barres d'échelle représentent 100 um; C. Viabilité de 9:1 (n = 9) et commande CN (n = 3). Les données représentent la moyenne  ± S.D. **p < 0,01 versus NC ; D. SI de 9:1 (n = 9) et commande CN (n = 3). Les données représentent la moyenne  ± S.D

Discussion

Le diabète sucré, communément appelé diabète, est une maladie métabolique caractérisée par une glycémie élevée. Le diabète de type 1 résulte de l'incapacité des cellules bêta du pancréas à produire suffisamment d'insuline [16]. La transplantation d'îlots pancréatiques contenant des cellules β productrices d'insuline a récemment été utilisée pour guérir le diabète de type 1. Cependant, la transplantation d'allo-îlots est limitée en raison de la pénurie de donneurs; au lieu de cela, la xénotransplantation utilisant des îlots d'animaux non humains est devenue une source alternative de tissu de donneur. En raison de leurs similitudes physiologiques avec les humains, de leur facilité de reproduction en masse et de la disponibilité de la reproduction dans des installations exemptes d'agents pathogènes, les porcs sont considérés comme un modèle animal optimal pour la transplantation de xéno-îlots [1]. En particulier, les NPCC ont été utilisés aussi bien que les API. Bien que la maturité des NPCC soit inférieure à celle des API, les NPCC présentent certains avantages par rapport aux API, notamment une procédure d'isolement des îlots relativement simple et peu coûteuse, la capacité de développer une résistance aux environnements hypoxiques et la prolifération in vivo après transplantation [1,2,3] . Pour ces raisons, nous avons utilisé des porcs nouveau-nés âgés de 3 à 5 jours comme source d'îlots dans cette étude.

Malheureusement, une fois que des îlots de porc sont implantés dans des vaisseaux sanguins de primates humains ou non humains, des réactions immunitaires sévères telles que IBMIR ou un rejet hyperaigu se produisent souvent. L'IBMIR se produit généralement en raison de plusieurs facteurs tissulaires (TF) exprimés dans les îlots de porc qui médient la coagulation dans les vaisseaux sanguins humains via l'activation d'une voie extrinsèque. Les antigènes alpha-galactose ou non-gal exprimés à la surface des cellules de porc peuvent également être des cibles d'anticorps humains naturels, suivis d'une activation en cascade complémentaire appelée rejet hyperaigu. En conséquence, les greffons sont perdus suite à une hypoxie par formation de caillots à partir de la voie de coagulation et à la mort cellulaire par activation du complément chez l'hôte [3]. Pour résoudre ces problèmes, l'encapsulation, une méthode de revêtement des îlots pancréatiques avec des matériaux biocompatibles pour les protéger contre une attaque par des réactions d'anticorps ou de complément, a été essayée. Premièrement, la macro-encapsulation utilise un dispositif avec une membrane semi-perméable contenant l'îlot et est implanté à côté des vaisseaux sanguins où il libère de l'insuline dans la circulation sanguine en réponse à la glycémie [4]. Deuxièmement, la micro-encapsulation, utilisant principalement de l'alginate, a une perméabilité sélective et peut permettre à l'oxygène et aux nutriments de traverser sa surface poreuse, tout en bloquant plusieurs cytokines et l'infiltration des cellules immunitaires. Cependant, étant donné qu'ils utilisent la même taille de capsules quelle que soit la taille des îlots, il est difficile d'enrober les îlots de manière conforme. De plus, une fibrose peut survenir, enfermant le greffon après transplantation [17]. Enfin, la modification de surface des îlots (nano-encapsulation) utilise principalement du polyéthylène glycol (PEG) qui possède une propriété « effet furtif » qui bloque l'interaction des matériaux recouverts de polymère « furtif » (PEG) et des composants du sang (cellules immunitaires) dans vivo [11, 18]. Notre stratégie de nano-encapsulation NPCC utilise les copolymères PEG modifiés (PEG-b-PLA, Polymersome, PSome). De plus, le Psome possède à la fois des propriétés hydrophiles et hydrophobes et peut incorporer des immunosuppresseurs ou des facteurs impliqués dans la différenciation ou la croissance cellulaire [8].

La nano-encapsulation d'îlots à l'aide de PEG a été réalisée dans un tampon HBSS basique (pH 8,0 ou supérieur) pour améliorer l'affinité de liaison entre le NHS sur le PEG et le NH₂ sur l'ECM de l'îlot [10,11,12]. Cependant, étant donné que ces conditions ne peuvent pas fournir un environnement de culture cellulaire approprié, nous avons tenté la nano-encapsulation dans un environnement imitant les conditions de culture du NPCC. Pour résoudre les problèmes ci-dessus, nous avons testé le milieu F-10 ordinaire, le milieu de base de culture NPCC, avec un pH physiologique (sans aucun supplément) utilisé comme tampon de réaction de nano-encapsulation. La nano-encapsulation dans F-10 avec un pH physiologique a montré une efficacité de revêtement similaire et a maintenu la morphologie normale des NPCC par rapport aux conditions de culture utilisant un tampon HBSS basique (Fig. 3). Par conséquent, nous pouvons proposer une plate-forme qui minimise les dommages du NPCC lors de la nano-encapsulation dans un environnement imitant la culture du NPCC.

Bien que la méthode de nano-encapsulation pour minimiser les dommages du NPCC ait été établie, la quantité résiduelle de NPCC collectés après la nano-encapsulation a diminué lorsque la nano-encapsulation a été réalisée dans des boîtes de Pétri. Cela signifie que vous avez besoin de plus de NPCC pour la nano-encapsulation en vue de la transplantation. Selon des rapports précédents, les rendements en îlots ont été améliorés dans certaines souches de souris en utilisant de la BSA pendant l'isolement [19]. De plus, la BSA a été utilisée comme culture en suspension en pré-revêtant la surface des boîtes de culture cellulaire dans des cultures de cellules d'hépatome de rat [13]. Par conséquent, pour augmenter la quantité de NPCC après la nano-encapsulation, 0,25% de BSA a été ajouté dans le tampon de réaction de nano-encapsulation F-10, identique à la concentration de BSA utilisée pour la culture des NPCC. En conséquence, le taux de récupération du NPCC a augmenté de manière significative après la nano-encapsulation (Fig. 4). Cela signifie que le nombre correct d'îlots (contenant des NPCC) après la nano-encapsulation peut être prédit et transplanté en minimisant la perte d'îlots (contenant des NPCC). En résumé, cette étude utilisant du F-10 avec 0,25% de BSA pour la nano-encapsulation a montré que (i) la morphologie normale des NPCC était maintenue, (ii) la liaison entre le PSome conjugué au NHS et le NH2 dans l'ECM des NPCC n'était pas perturbée et (iii) le taux de récupération des NPCC après nano-encapsulation a augmenté.

Enfin, nous avons tenté d'améliorer la stabilité de la nano-encapsulation par (i) la conjugaison entre les PSomes et (ii) la liaison entre les PSomes et l'ECM des NPCC. Tout d'abord, les polymères NHS- et NH2-PEG-b-PLA ont été mélangés proportionnellement pour former le PSome bifonctionnel (NHS-/NH2-PSome) qui peut se lier à la fois au PSome et à l'ECM des NPCC. Nous avons postulé que la conjugaison pourrait être efficacement réalisée par des groupes bifonctionnels au sein d'un PSome plutôt que de conjuguer deux PSomes avec des groupes monofonctionnels en raison de l'interruption potentielle causée par la liaison entre PSomes avec le même groupe fonctionnel (NHS-NHS et NH2-NH2). Comme le montrent les résultats, le revêtement conforme des NPCC a été obtenu à une proportion de 9:1 de NPCC nano-encapsulés NHS-/NH2-PSome, et la viabilité et la fonctionnalité ont été maintenues (Fig. 5). Cependant, d'autres études sont nécessaires pour quantifier la force de la liaison PSome, pour prouver que la nano-encapsulation avec des PSomes bifonctionnels a entraîné une encapsulation plus stable que celle avec le PSome monofonctionnel. Par conséquent, nous suggérons que nos conditions de nano-encapsulation efficaces imitant l'environnement de culture du NPCC puissent être utilisées dans la stratégie de nano-encapsulation en utilisant des îlots contenant des NPCC (Fichier supplémentaire 1).

Conclusion

Cette étude a été menée pour déterminer une méthode optimale de nano-encapsulation des îlots pancréatiques (NPCC) en utilisant des polymersomes à base de PEG (PSomes). Premièrement, l'utilisation d'un milieu de culture F-10 avec un pH de 7,3 peut maintenir la morphologie normale des NPCC après nano-encapsulation par rapport à l'utilisation d'un tampon HBSS basique (pH 8,0), minimisant ainsi les dommages causés aux NPCC pendant l'encapsulation. Deuxièmement, l'ajout de 0,25% de BSA au milieu F-10 a amélioré le rendement des NPCC d'environ 1,7 fois après la nano-encapsulation. Enfin, nous avons induit une nano-encapsulation plus stable grâce à la conjugaison de PSomes bifonctionnels (NHS-/NH2-PSomes). Les méthodes de nano-encapsulation présentées dans cet article peuvent être applicables à la nano-encapsulation d'îlots pancréatiques à l'aide de nanoparticules à base de PEG.

Disponibilité des données et des matériaux

Non applicable.

Abréviations

DiD:

1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt

AO:

Acridine orange

APIs:

Adult porcine islets

BSA :

Sérum albumine bovine

BF:

Bright field

CLSM :

Confocal laser scanning microscopy

DAPI :

4′,6-Diamidino-2- phenylindole

DMSO :

Diméthylsulfoxyde

DH2O:

Distilled water

ELISA :

Dosage immuno-enzymatique

FBS :

Sérum fœtal bovin

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

GSIS:

Glucose-stimulated insulin secretion

HBSS:

Hank’s balanced salt solution

IBMIR:

Instant blood-mediated inflammatory reaction

IEQ:

Islet equivalent

IBMX:

Isobutylmethylxanthine

KRBB:

Krebs–Ringer bicarbonate buffer

MFI:

Mean fluorescence intensity

HEPES:

N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)

NC :

Contrôle négatif

NPCCs:

Neonatal porcine islet like cell clusters

NHS:

N-hydroxysuccinimide

NHP:

Non-human primate

PLA:

Poly lactide

PEG :

Polyéthylène glycol

PSomes:

Polymersomes

IP :

Propidium iodide

SI :

Stimulation index

TF:

Tissue factor