Le microARN exosomal 18b-3p dérivé de cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical humain inhibe l'apparition de la prééclampsie en ciblant le LEP

Introduction

La prééclampsie (PE), caractérisée par une protéinurie et une hypertension [1], est une cause majeure de mortalité et de morbidité fœtale et maternelle pendant la grossesse humaine [2]. L'étiologie et la pathogenèse de l'EP ne sont pas claires [3], qui a été signalée comme étant associée à une invasion trophoblastique anormale entraînant un dysfonctionnement endothélial maternel, une malperfusion placentaire chronique et une hypertension avec des résultats indésirables [4]. À l'exception de l'accouchement fœtal et placentaire, il n'existe pas de traitement spécifique pour l'EP [5]. Il est donc urgent d'explorer les cibles thérapeutiques pour améliorer le pronostic de cette maladie.

Le cordon ombilical humain (huc) est une source appropriée de cellules souches mésenchymateuses (CSM) qui sécrètent une variété de facteurs trophiques et de cytokines ainsi que de fortes capacités anti-inflammatoires et immunomodulatrices [6]. Une étude a vérifié que l'EP accélère l'expression des marqueurs neurogliaux dans les CSM dérivées de la gelée de Wharton du cordon ombilical [7]. Un effet protecteur des exosomes hucMSCs (Exos) sur la morphologie placentaire et l'angiogenèse chez les rats PE a également été rapporté [8]. Les exosomes sont de petites vésicules de sécrétion (50 à 100 nm) qui assurent la communication entre les cellules du microenvironnement tumoral en encapsulant et en transmettant des facteurs cancérigènes à des sites distants ou aux cellules environnantes par la circulation [9]. Une étude a révélé les dommages des fonctions vasculaires et les complications induites par le transfert efficace de sFlt-1 et sEng dans les cellules endothéliales chez les patients atteints d'EP par les exosomes [10]. Les microARN (miARN) sont des ARN endogènes non codants d'une longueur de 18 à 25 nucléotides et régulent l'expression du gène au niveau post-transcriptionnel [11]. Les données d'une étude ont rapporté que l'expression de miR-18b affecte l'invasion cellulaire, la viabilité et la migration des cellules trophoblastiques dans la PE [12]. De plus, Wu et al. ont proposé que miR-18b atténue la prolifération dans les cellules endothéliales rétiniennes humaines induite par un taux élevé de glucose, ce qui peut offrir un nouvel aperçu pour comprendre le mécanisme de pathogenèse de la rétinopathie diabétique [13]. Cependant, le rôle de miR-18b-3p exosomal dérivé de hucMSC dans PE reste inconnu. La leptine (LEP) a des effets pléiotropes sur la différenciation/prolifération cellulaire et l'immunité des états physiologiques et a principalement émergé des adipocytes, en plus d'autres tissus, dont le placenta [14]. Une étude a vérifié que la méthylation anormale du promoteur du LEP est impliquée dans la progression de l'EP [15]. Une autre étude a suggéré que le placenta est un site principal d'expression du LEP pendant la grossesse [16]. Néanmoins, la relation de liaison entre miR-18b-3p et LEP est encore insaisissable. Par conséquent, nous avons cherché à explorer le rôle du miR-18b-3p exosomal dérivé de hucMSC dans la PE avec l'implication du LEP, et nous avons déduit que le miR-18b-3p exosomal dérivé de hucMSC peut inhiber la progression de la PE via le ciblage du LEP.

Matériaux et méthodes

Approbation éthique

L'étude a été approuvée par le comité d'examen institutionnel de l'hôpital du peuple de l'université de Wuhan. Tous les participants ont signé un document de consentement éclairé. Toutes les expérimentations animales étaient conformes au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire par les comités internationaux de l'hôpital du peuple de l'Université de Wuhan.

Isolé, Culture et Identification des HucMSCs

Le cordon ombilical fœtal délivré par un puerperant sain a été collecté et coupé en hachis et filtré avec un tamis puis mélangé avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les tissus du cordon ombilical ont été centrifugés à 1500 tr/min pendant 5 min avec 10 cm de rayon centrifuge. Les tissus ont été mis en suspension avec du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)/F12 contenant 10 % de sérum bovin foetal (FBS) et transférés dans un flacon de culture. Les liquides ont été changés après 4 jours, puis changés une fois tous les 3 jours. Les cellules ont été repiquées lorsque la confluence a atteint environ 90 %. La croissance adhérente et la morphologie des hucMSCs ont été observées au microscope optique. Les cellules ont été colorées avec une solution de coloration à l'huile rouge O (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Chine) pour détecter la différenciation ostéogénique des hucMSC et colorées avec une solution de coloration à la phosphatase alcaline (ALP) (Beyotime) pour détecter la différenciation adipogène des hucMSC. Un cytomètre en flux (Beckman Coulter Life Sciences, Brea, CA, USA) a été adopté pour tester CD73, CD166 (tous deux 1:10, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) et CD105 (1:20, AbD Serotec, Oxford, Royaume-Uni).

Extraction et identification de HucMSC-Exos

Les hucMSCs en bonne croissance ont été cultivés. Le surnageant a été collecté et centrifugé à 28 500 tr/min pendant 1 h avec un rayon de centrifugation de 10 cm. Le surnageant a été jeté et les cellules fixées avec 2% de glutaraldéhyde et 1% d'acide osmique, déshydratées avec de l'éthanol, immergées dans de l'oxyde de propylène, séchées pendant 2 h, incluses par Epon812 et tranchées. Les tranches ont été colorées à l'uranium et au plomb, respectivement. Enfin, les exosomes ont été observés au microscope électronique. Un détecteur Nanosight (Malvern Instruments, Malvern, Royaume-Uni) a été utilisé pour détecter l'imagerie du mouvement brownien des nanoparticules d'exosomes et sa taille. Les marqueurs de surface de hucMSC-Exos ont été identifiés par western blot, et les résultats ont montré que hucMSC-Exos exprimait CD9, CD81 et CD63.

Méthode d'infection par les lentivirus

HucMSC a été infecté par un lentivirus contenant une faible expression du vecteur miR-18b-3p et une faible expression du contrôle négatif du vecteur miR-18b-3p (NC) (Shanghai GenePharma Co, Ltd, Shanghai, Chine). Enfin, les hucMSC-antagomir NC et hucMSC-miR-18b-3p antagomir exprimés de manière stable ont été obtenus. Les cellules ont été cultivées pendant 48 h, et le surnageant a été collecté et centrifugé par ultracentrifugation pour obtenir les Exos-antagomir NC et Exos-miR-18b-3p antagomir correspondants.

Animaux expérimentaux

Des rats Wistar (pesant 200 à 250 g, âgés de 8 w, sans distinction de sexe) d'un niveau sain et d'une maturité sexuelle ont été sélectionnés (Centre d'expérimentation animale de l'Université de Wuhan, Wuhan, Chine). Les rats ont été nourris dans un système de barrière avec une température de 18 à 28 °C, une humidité relative de 40 à 70 % et une alimentation et de l'eau adéquates.

Mise en place de modèles de rat PE

Le modèle d'EP chez le rat a été établi par injection intrapéritonéale de 50 mg/kg d'inhibiteur de l'oxyde nitrique synthétase, l'ester méthylique de N(G)-nitro-l-arginine (L-NAME, Beyotime) en référence à un article [17]. L'établissement réussi du modèle PE était basé sur une augmentation de la pression artérielle avec 20 mmgHg et plus de 115 mmHg ainsi qu'une protéinurie améliorée.

Regroupement d'animaux

Le rat femelle et le rat mâle ont cohabité au hasard à 1:1, et les deux rats ont été maintenus dans une cage spéciale individuelle à 17h-18h. le jour d'avant. Le sperme dans les sécrétions vaginales des rats femelles a été observé par bouchon vaginal et microscope le lendemain. Si le résultat était positif en même temps, le jour était enregistré comme le 0e jour de gestation. A partir du 13 ^e jour de gestation, les rats ont été divisés en 6 groupes (10 rats dans chaque groupe) :groupe normal (la même quantité de solution saline normale a été injectée par voie intrapéritonéale du jour 13 au jour 20 de la gestation), groupe PE (L-NAME [50 mg/ kg par jour] a été injecté par voie intrapéritonéale du 13e au 20e jour de gestation, et 20 L de solution saline normale ont été injectés dans le placenta du 16e au 19e jour de gestation), groupe PE + miR-NC (L-NAME [50 mg /kg par jour] a été injecté par voie intrapéritonéale du 13e au 20e jour de gestation, et 20 μL de 4 nmol de miR-NC ont été injectés dans le placenta du 16e au 19e jour de gestation), groupe PE + miR-18b-3p agomir (L-NAME [50 mg/kg par jour] a été injecté par voie intrapéritonéale du 13e au 20e jour de gestation, et 20 μL de 4 nmol miR-18b-3p agomir ont été injectés dans le placenta du 16e au 19e jour de gestation) , groupe antagomir PE + miR-18b-3p (L-NAME [50 mg/kg par jour] a été injecté par voie intrapéritonéale du jour 13 au jour 20 de la gestation, et 20 L de 4 nmol miR-18b-3p antagomir ont été injectés dans le p lacenta du jour 16 au jour 19 de la gestation), le groupe PE + miR-18b-3p antagomir + petit ARN interférent (si)-LEP (L-NAME [50 mg/kg par jour] a été injecté par voie intrapéritonéale du jour 13 au jour 20 de gestation, et 20 L de 4 nmol miR-18b-3p antagomir et si-LEP ont été injectés dans le placenta du 16e au 19e jour de la gestation) et du groupe PE + si-LEP (L-NAME [50 mg/kg par jour] a été injecté par voie intrapéritonéale du 13e au 20e jour de gestation, et 20 μL de 4 nmol de si-LEP ont été injectés dans le placenta du 16e au 19e jour de gestation). Les rats ont été traités avec des exosomes et des exosomes porteurs de lentivirus. Les rats ont été répartis en 5 groupes (10 rats dans chaque groupe) :groupe normal (la même quantité de solution saline normale a été injectée par voie intrapéritonéale du 13e au 20e jour de gestation), groupe PE (L-NAME (50 mg/kg par jour ) a été injecté par voie intrapéritonéale du 13e au 20e jour de gestation, et 20 L de solution saline normale ont été injectés dans le placenta du 16e au 19e jour de gestation), groupe PE + Exos (L-NAME (50 mg/kg par jour) a été injecté par voie intrapéritonéale du 13e au 20e jour de gestation, et 20 L d'Exos (80 μg d'exosomes ont été mis en suspension dans 20 μL de solution saline normale) a été injecté dans le placenta du 16e au 19e jour de gestation), PE + Exos-antagomir NC (L-NAME (50 mg/kg par jour) a été injecté par voie intrapéritonéale du 13e au 20e jour de gestation, et 20 L d'Exos-antagomir NC (80 μg d'exosomes ont été mis en suspension dans 20 L de solution saline normale) a été injecté dans le placenta du jour 16 au jour 19 de la gestation) et le groupe antagomir PE + Exos-miR-18b-3p (L-NAME (50 mg/kg par jour) a été injecté par voie intrapéritonéale à partir du jour 13 au jour 20 de la gestation, et 20 L d'Exos-miR-18b-3p antagomir (80 μg d'exosomes ont été mis en suspension dans 20 L de solution saline normale) ont été injectés dans le placenta du 16e au 19e jour de gestation).

Détection de la pression artérielle systolique (SBP) et détermination de la protéinurie sur 24 h

La pression des rats a été mesurée par la mesure de la pression artérielle dans l'artère caudale des rats. La SBP de la coiffe de la queue de toutes les rates gravides a été mesurée les 10e, 13e, 16e et 19e jours de gestation à l'aide du détecteur de pression artérielle de la queue de rat (Tensys (R) Medical Inc., San Diego, CA, USA). La pression a été mesurée 3 fois en peu de temps; ensuite, la valeur moyenne a été prise comme tension artérielle.

Dans le cas du régime libre et de l'eau, les urines de 24 heures de rates gravides ont été recueillies les 10e, 13e, 16e et 19e jours de gestation, et la teneur en protéines a été détectée dans le service de néphrologie de l'Hôpital du Peuple de l'Université de Wuhan.

Collection d'échantillons

Les rates gravides ont été anesthésiées avec du pentobarbital sodique à 3 % le 21e jour de gestation. Le sang périphérique des rats a été conservé, centrifugé pour prélever le sérum et conservé au réfrigérateur à - 20°C en attente. Ensuite, le fœtus de rat et le placenta ont été prélevés par césarienne, la membrane fœtale et le cordon ombilical connecté ont été retirés et le cordon ombilical connecté au fœtus de rat a été coupé. Le placenta et le fœtus de rat ont été placés sur une gaze aseptique pour sécher le sang et le liquide amniotique, respectivement, puis placés sur la balance analytique pour peser le poids. Une partie des tissus placentaires a été fixée avec du paraformaldéhyde à 4 %, déshydratée avec de l'éthanol, clarifiée avec du xylène, incluse dans de la paraffine et découpée en continu (5 μm) pour la coloration hématoxyline-éosine (HE) et la désoxyuridine triphosphate-biotine médiée par la désoxynucléotidyl transférase terminale marquage de fin d'entaille (TUNEL) coloration. Le reste a été stocké à -80 °C pour la détection de la réaction quantitative en chaîne de la polymérase par transcription inverse (RT-qPCR), l'analyse par Western blot et le test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).

ELISA

Les teneurs en facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α), en interleukine (IL)-1β et en IL-6 dans le sérum ont été testées par ELISA. Les concentrations de TNF-α, IL-1β et IL-6 ont été déterminées en suivant les instructions du kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Les valeurs de densité optique (DO) (490 nm) ont été testées par un lecteur de microplaques (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). La courbe standard correspondante a été obtenue en utilisant la valeur de DO en abscisse et la concentration de l'échantillon standard correspondant en ordonnée. Les concentrations de TNF-α, IL-1β et IL-6 ont été calculées à partir de la courbe standard.

Coloration HE

Les échantillons de paraffine des tissus du placenta ont été nettoyés au xylène, déshydratés par un gradient d'alcool conventionnel, teints à l'hématoxyline, différenciés par 1% d'alcool chlorhydrique et rendus bleus par 1% d'eau ammoniacale. Ensuite, les tissus ont été contre-colorés avec une solution d'éosine à 1 %, déshydratés (75 %, 90 %, 95 % d'éthanol, respectivement, d'alcool éthylique absolu) et clarifiés au xylène, séchés, bloqués et observés au microscope électronique.

Coloration TUNEL

Les sections incluses en paraffine ont été systématiquement déparaffinées et déshydratées conformément aux instructions, puis l'apoptose a été détectée par le kit TUNEL (Nanjing Kejin Biotechnology Co., Ltd., Jiangsu, Chine). Le 4,6-Diamino-2-phénylindole (Shanghai Baitai Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Chine) a été utilisé pour observer les cellules TUNEL-positives à l'aide d'un microscope à fluorescence (Nikon, Tokyo, Japon) [18].

RT-qPCR

Les tissus placentaires ont été pesés. Pour 50 à 100 mg de placenta, des tissus ont été ajoutés avec 1 ml de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Californie, États-Unis) et complètement dissous. Les tissus ont été additionnés de 200 L de chloroforme et centrifugés à 4 °C, 12 000 tr/min pour extraire l'ARN total. La concentration et la pureté de l'ARN ont été déterminées par un spectrophotomètre d'acide nucléique de protéine DU-800 (Beckman). U6 et -actine ont été utilisés comme témoins de charge. Les amorces PCR ont été conçues et composées par Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd. (Shanghai, Chine). Les séquences d'amorces sont répertoriées dans le tableau 1. L'ARN a été inversé en ADNc sur la base des instructions du kit de transcription inverse d'ARN (Sangon). La PCR a été amplifiée et les produits ont été vérifiés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les données ont été calculées par 2 ^−ΔΔCt méthode.

Dosage Western Blot

La protéine totale des tissus placentaires a été extraite par dosage de radio-immunoprécipitation tampon de lyse cellulaire (Beyotime). HucMSC-Exo a été utilisé pour extraire le tampon, qui a été centrifugé à 14 000 tr/min. Le surnageant a été conservé pour tester l'expression protéique de la protéine marqueur exosomal (CD81, CD63 et CD9) dans le sérum. La concentration en protéines a été déterminée par le kit d'acide bicinchoninique (Beyotime, P0010). L'échantillon a été chargé selon les résultats quantitatifs de la protéine, traité avec une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécyl sulfate de sodium à 10 % et transféré sur membrane. La membrane a été bloquée avec du lait écrémé à 5 %, sondée avec des anticorps primaires LEP, CD63, CD81, CD9 et -actine (4 mL, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, USA), re-sondée avec 4 mL d'anticorps secondaires IgG anti-lapin de chèvre/peroxydase de raifort, exposés et développés. La β-actine a été utilisée comme référence interne. La valeur de gris a été analysée par le logiciel d'analyse graphique sur gel Image Lab.

Dosage du gène rapporteur à double luciférase

Le logiciel de prédiction en ligne https://cm.jefferson.edu/ a été adopté pour prédire la relation cible entre miR-18b-3p et LEP ainsi que le site de liaison de miR-18b-3p et LEP 3′ région non traduite (UTR ). La séquence de la région du promoteur LEP 3'UTR contenant le site de liaison miR-18b-3p a été composée. Le plasmide LEP 3'UTR de type sauvage (WT) et LEP 3'UTR de type mutant (MUT) ont été construits. Les plasmides recombinants ont été nommés LEP 3'UTR-WT et LEP 3'UTR-MUT, respectivement. Les cellules 293T cultivées ont été co-transfectées avec miR-18b-3p mimic et LEP 3′UTR-WT, miR-18b-3p mimic et LEP 3′UTR-MUT, mimic NC et LEP 3′UTR-WT, mimic NC et LEP 3′UTR-MUT pendant 30 h. Ensuite, les cellules 293T ont été collectées. L'activité luciférase de la luciole et de la renilla dans les cellules a été mesurée par des mesures de luminescence conformément au kit de détection du gène rapporteur à double luciférase (Promega, Madison, WI, États-Unis).

Test d'extraction d'ARN

Des sondes d'ARN biotinylées (Bio-miR-NC, Bio-miR-18b-3p et Bio-miR-18b-3p-Mut) ont été incubées avec le lysat de cellules 293T et extraites à l'aide de billes magnétiques conjuguées à l'antibiotique streptomycine. L'expérience a été réalisée sur la base des instructions des kits d'extraction d'ARN magnétique Pierce (Pierce, IL, USA). L'ARN a été élué et purifié en utilisant du TRIzol (Pierce). L'enrichissement du LEP en complexe ARN a été quantifié par RT-qPCR comme décrit précédemment [19].

Analyse statistique

Toutes les données ont été expliquées par le logiciel SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Les données de mesure ont été indiquées en tant que moyenne ± écart type. Les données ont été recueillies par échantillon indépendant t test pour les comparaisons de deux groupes, tandis que les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie du test post hoc de Tukey. Le critère de signification statistique a été fixé à p < 0,05.

Résultats

Morphologie et identification des HucMSC et HucMSC-Exos

Les masses tissulaires du cordon ombilical ont été observées au microscope inversé. On pouvait voir que les cellules rampaient hors de la masse tissulaire le jour 3; les cellules ont montré une forme de fuseau et un aspect filiforme et ont grandi comme une colonie à environ 5 jours. Lorsqu'elles étaient cultivées jusqu'au passage 3, la morphologie des cellules était uniforme, longue et fusiforme et similaire à la morphologie des fibroblastes, et l'arrangement était régulier (Fig. 1a). Après 2 semaines de différenciation adipogène de hucMSC, des gouttelettes lipidiques se sont formées dans le cytoplasme et les gouttelettes lipidiques ont montré une structure de Kranz au microscope inversé (Fig. 1b), suggérant que la hucMSC cultivée isolée avait la capacité de différenciation adipogène. Après 2 w de différenciation ostéogénique, un grand nombre de nodules de calcium bruns ont pu être observés au microscope inversé (Fig. 1c), indiquant que la hucMSC en culture isolée avait la capacité de différenciation ostéogénique. Un cytomètre en flux a été adopté pour tester l'immunophénotype des cellules, et les résultats comprenaient que les cellules surexprimaient les marqueurs de surface CD73, CD105 et CD166 des CSM (Fig. 1d).

Morphologie et identification des hucMSC et hucMSC-Exos. un La morphologie du hucMSC au microscope inversé, b hucMSC a été testé par coloration à l'huile rouge O. c hucMSC a été testé par coloration ALP. d La cytométrie en flux a été utilisée pour détecter l'immunophénotype. e La forme et la taille de hucMSC-Exos observées à travers un MET. f Détection de la distribution granulométrique des exosomes à l'aide de l'analyse Nanosight. g L'expression des protéines de CD9, CD81 et CD63 dans hucMSC-Exos a été détectée par un test Western Blot

La morphologie de hucMSC-Exos a été observée par le MET, et les résultats ont montré que les exosomes étaient ronds ou ovales avec une faible densité centrale et une coloration épaisse des deux côtés (Fig. 1e). L'analyse Nanosight a été utilisée pour analyser la taille des particules des exosomes, et les résultats ont montré que la taille des particules était principalement distribuée entre 40 et 100 nm, plus concentrée autour de 80 nm (Fig. 1f). Le test Western blot a révélé que tous les marqueurs de surface CD81, CD63 et CD9 étaient exprimés dans hucMSC-Exos (Fig. 1g).

La restauration de miR-18b-3p atténue les caractéristiques pathologiques des rats PE

Les résultats de la PAS et de la protéinurie sur 24 heures ont montré qu'il n'y avait pas de différence significative entre la PAS et la protéinurie sur 24 heures dans 6 groupes avant l'administration (jour 10 de la gestation). La PAS et la protéinurie sur 24 heures au 19e jour de gestation n'ont montré aucune différence évidente chez les rats normaux. Chez les rats PE ou les rats PE traités avec miR-NC, miR-18b-3p agomir, miR-18b-3p antagomir, miR-18b-3p antagomir + si-LEP, si-NC ou si-LEP, SBP et 24-h la protéinurie a commencé à augmenter au jour 13 de la gestation. Il n'y avait pas de différence distincte de SBP et de protéinurie sur 24 heures au jour 16 et au jour 19 de la gestation chez les rats PE traités avec miR-18b-3p agomir et si-LEP. Les rats PE présentaient une augmentation de la PAS et une protéinurie sur 24 heures au 19e jour de gestation ; cette augmentation a été réduite par l'élévation de miR-18b-3p mais encore renforcée par l'inhibition de miR-18b-3p; La réduction du LEP a abrogé le rôle de la régulation négative de miR-18b-3p dans la PAS et la protéinurie sur 24 h au 19e jour de gestation chez les rats PE (Fig. 2a, b).

La restauration de miR-18b-3p atténue les caractéristiques pathologiques des rats PE. un Résultats de la SBP chez le rat. b Résultats de la protéinurie de 24 heures chez le rat. c Changements de poids des rats foetaux. d Modifications du poids placentaire chez le rat. e Des modifications des facteurs inflammatoires dans le sérum ont été détectées par ELISA. n = 10, *p < 0,05 par rapport au groupe normal. ^p < 0,05 versus le groupe PE + miR-NC. ^@ p < 0,05 versus le groupe antagomir PE + miR-18b-3p. ^& p < 0,05 versus le groupe PE + si-NC. Les données de mesure ont été représentées sous forme de moyenne  ±  écart-type, et les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA à un facteur suivie du test de Tukey

Le poids du fœtus de rat et de placenta a été réduit chez les rats PE ; miR-18b-3p régulé à la hausse ou LEP régulé à la baisse a augmenté, tandis que miR-18b-3p régulé à la baisse a diminué le poids du fœtus de rat et du placenta chez les rats PE ; L'inhibition du LEP a inversé l'effet de l'inhibition de miR-18b-3p sur le poids du fœtus de rat et du placenta chez les rats PE (Fig. 2c, d).

Des facteurs inflammatoires dans le sérum de rats PE ont été détectés. Il a été constaté que les teneurs en TNF-α, IL-1β et IL-6 étaient améliorées chez les rats PE ; l'élévation de miR-18b-3p ou l'inhibition du LEP ont été supprimées, tandis que la réduction de miR-18b-3p a favorisé les teneurs en TNF-α, IL-1β et IL-6 ; l'effet du miR-18b-3p inhibé sur les teneurs en TNF-α, IL-1β et IL-6 a été abrogé par la déplétion du LEP (Fig. 2e).

MiR-18b-3p surexprimé améliore le changement histopathologique des tissus placentaires des rats PE

Chez les rats normaux, les villosités placentaires étaient riches en vaisseaux sanguins et avaient une structure claire, les syncytiotrophoblastes étaient les principaux trophoblastes dans les villosités placentaires et il y avait moins de cytotrophoblastes. Chez les rats PE ou les rats PE traités avec miR-NC, miR-18b-3p antagomir, si-NC ou miR-18b-3p antagomir + si-LEP, le nombre de villosités placentaires a diminué, la structure était floue et atrophiée, certaines villosités ont été réalisées une nécrose fibrinoïde, et le nombre de nodules syncytiotrophoblastes dans les villosités placentaires a augmenté, et la plupart des villosités étaient immatures. Le nombre de trophocytes a été réduit et les changements pathologiques ont été atténués chez les rats PE traités avec miR-18b-3p agomir et si-LEP (Fig. 3a).

Le miR-18b-3p surexprimé améliore le changement pathologique et supprime les cellules apoptotiques des tissus placentaires chez les rats PE. un La coloration HE a été utilisée pour tester les caractéristiques pathologiques des tissus placentaires. b La coloration TUNEL a été mise en œuvre pour déterminer les cellules apoptotiques des tissus placentaires chez les rats PE. c Le taux d'apoptose cellulaire a été détecté par coloration TUNEL. n = 10, *p < 0,05 par rapport au groupe normal. ^p < 0,05 par rapport au groupe miR-NC. ^@ p < 0,05 par rapport au groupe antagomir miR-18b-3p. ^& p < 0,05 par rapport au groupe si-NC. Les données de mesure ont été représentées sous forme de moyenne  ±  écart-type, et les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA à un facteur suivie du test de Tukey

La coloration TUNEL a suggéré qu'un petit nombre de cellules apoptotiques pouvaient être observées. Les rats PE avaient augmenté les cellules apoptotiques, qui ont été réduites par l'élévation de miR-18b-3p et l'extinction du LEP, et ont été encore renforcées par l'inhibition de miR-18b-3p; L'extinction du LEP a également inversé l'effet de l'inhibition de miR-18b-3p sur le nombre de cellules apoptotiques chez les rats PE (Fig. 3b, c).

Pris ensemble, les rats avec miR-18b-3p régulé à la hausse ou LEP inhibé présentaient un degré réduit de progression de la PE en histologie, et le LEP silencieux pourrait abolir l'effet thérapeutique du miR-18b-3p inhibé.

miR-18b-3p est régulé à la baisse, tandis que le LEP est régulé à la hausse dans les tissus placentaires de rat PE et miR-18b-3p cible le LEP

Sur la base des résultats ci-dessus, la régulation négative du LEP a inversé l'effet thérapeutique de la régulation négative de miR-18b-3p sur les rats PE en pathologie et histologie ; ainsi, nous avons émis l'hypothèse que miR-18b-3p pourrait être lié au LEP.

Le test Western blot et la RT-qPCR ont révélé que les rats PE avaient diminué miR-18b-3p et augmenté les niveaux d'expression de LEP; le traitement de miR-18b-3p agomir a régulé à la hausse miR-18b-3p et diminué le LEP chez les rats PE, tandis que le traitement de miR-18b-3p antagomir a augmenté l'expression du LEP; L'extinction du LEP a inversé l'effet promoteur de la réduction de miR-18b-3p sur l'expression du LEP chez les rats PE (Fig. 4a–c).

miR-18b-3p est régulé à la baisse et le LEP est régulé à la hausse dans les tissus placentaires des rats PE. un L'expression de l'ARNm de miR-18b-3p et du LEP dans les tissus placentaires a été détectée par RT-qPCR. b Bande protéique du LEP dans les tissus placentaires. c Un test Western blot a été réalisé pour détecter l'expression de la protéine LEP dans les tissus placentaires. d L'expression de l'ARNm de miR-18b-3p et du LEP dans les tissus placentaires après traitement des exosomes a été détectée par RT-qPCR. e Bande protéique du LEP dans les tissus placentaires après traitement des exosomes. f Un test Western blot a été effectué pour détecter l'expression de la protéine LEP après traitement des exosomes. g Les sites de liaison de miR-18b-3p et du LEP indiqués par un logiciel en ligne. h La relation cible entre miR-18b-3p et LEP vérifiée par dosage du gène rapporteur à double luciférase. je relation de ciblage entre miR-18b-3p et LEP vérifiée par ARN pull-down assay. n = 10, *p < 0,05 par rapport au groupe normal. ^p < 0,05 par rapport au groupe miR-NC. ^@ p < 0,05 par rapport au groupe antagomir miR-18b-3p. ^& p < 0,05 par rapport au groupe si-NC. ^# p < 0,05 par rapport au groupe PE. ^$ p < 0,05 versus le groupe PE + Exos-antagomir NC. Les données de mesure ont été représentées sous forme de moyenne  ±  écart-type, et les comparaisons entre plusieurs groupes ont été évaluées par ANOVA à un facteur suivie du test de Tukey

Le test Western blot et la RT-qPCR ont été utilisés pour explorer le rôle des exosomes chez les rats PE. Les résultats ont montré que les exosomes régulaient positivement miR-18b-3p et régulaient négativement le LEP chez les rats PE, indiquant l'effet suppressif des exosomes sur le développement de la PE. De plus, les exosomes véhiculant miR-18b-3p antagomir ont induit une régulation négative de miR-18b-3p et une régulation positive du LEP chez les rats PE (Fig. 4d–f).

La relation cible entre miR-18b-3p et LEP a été prévue par le logiciel de prédiction bioinformatique en ligne https://cm.jefferson.edu/ (Fig. 4g). Le test du gène rapporteur à double luciférase a suggéré que miR-18b-3p mimic diminuait l'activité luciférase du LEP 3′UTR-WT, tout en n'imposant aucun impact sur celle du LEP 3′UTR-MUT (Fig. 4h). De plus, l'essai d'extraction d'ARN a révélé que l'enrichissement du LEP était augmenté par le miR-18b-3p biotinylé par WT (Fig. 4i). Ces résultats ont indiqué que le LEP est un gène cible de miR-18b-3p.

hucMSC-Exos atténue les caractéristiques pathologiques des rats PE

Les résultats de SBP et 24 h ont montré qu'il n'y avait pas de différence significative de SBP et de protéinurie de 24 h dans 5 groupes avant l'administration (jour 10 de la gestation). La PAS et la protéinurie de 24 heures au 19e jour de gestation n'ont montré aucune différence distincte chez les rats normaux. In PE rats, SBP and 24-h proteinuria began to raise at day 13 of gestation. There was no distinct difference of SBP and 24-h proteinuria in day 16 and day 19 of gestation in PE rats treated with hucMSC-Exos and hucMSC-Exos transmitting antagomir NC. SBP and 24-h proteinuria heightened in day 19 of gestation in the PE rats, while the increase was reduced by injection of hucMSC-Exos. Inhibiting miR-18b-3p reversed the effect of hucMSC-Exos on SBP and 24-h proteinuria in day 19 of gestation in PE rats (Fig. 5a, b).

hucMSC-Exos attenuate pathological characteristics of PE rats. un Results of SBP in rats after exosome treatment. b Results of 24-h proteinuria in rats after exosome treatment. c Weight changes of fetal rats after exosome treatment. d Changes of placental weight in rats after exosome treatment. e Changes of inflammation factors after exosome treatment in serum were determined using ELISA. n  = 10, *p < 0.05 versus the normal group. ^# p  < 0.05 versus the PE group. ^$ p  < 0.05 versus the PE + Exos-antagomir NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey’s test

The weight of fetal rat and placenta was measured, and we found that the PE rats had decreased weight of fetal rat and placenta; miR-18b-3p downregulation abolished the role of hucMSC-Exos in the weight of fetal rat and placenta in PE rats (Fig. 5c, d).

Inflammatory factors in serum were detected using ELISA. TNF-α, IL-1β and IL-6 contents remarkably increased in PE rats. Exosomes treatment decreased TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in serum of PE rats, which were enhanced by injection of exosomes inhibiting miR-18b-3p (Fig. 5e).

Exosomes Alleviates Pathological Change and Inhibit Apoptosis of Placenta Tissues of PE Rats

In normal rats, the placental villus was abundant in blood vessels with a clear structure, syncytiotrophoblasts were the main trophoblast in placental villi, and there were fewer cytotrophoblasts. In the PE rats and PE rats treated with hucMSC-Exos-miR-18b-3p-antagomir, the number of placental villi reduced, the structure was blurred and atrophied, some villi were presented fibrinoid necrosis, and the number of syncytiotrophoblast nodules in placental villi enhanced, and most of the villi were immature. The pathological change was improved in the PE rats treated with hucMSC-Exos or hucMSC-Exos-antagomir NC versus the PE rats and PE rats treated with hucMSC-Exos-miR-18b-3p antagomir (Fig. 6a).

Exosomes alleviate pathological change and decrease apoptotic cells of placenta tissues in PE rats. un HE staining was utilized to test pathological features of placenta tissues in PE rats after exosome treatment. b TUNEL staining was implemented to determine apoptotic cells of placenta tissues in PE rats after exosome treatment. c Cell apoptosis rate was detected by TUNEL staining. n  = 10, *p < 0.05 versus the normal group. ^# p  < 0.05 versus the PE group. ^$ p  < 0.05 versus the PE + Exos-antagomir NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey’s test

TUNEL staining indicated that in normal rats, a small number of apoptotic cells could be seen. PE rats had enhanced apoptotic cells, and reduced miR-18b-3p reversed the impacts of hucMSC-Exos on the number of apoptotic cells in placenta tissues from PE rats (Fig. 6b, c).

Discussion

PE is a multisystem pregnancy disorder characterized by proteinuria and either high blood pressure or other adverse conditions and is linked to a wide range of maternal endothelial dysfunction [20]. It was reported that hucMSC-Exo improved the morphology of placental tissue in PE rats through suppressing cell apoptosis and facilitating angiogenesis in placental tissue in a dose-dependent manner [8]. A study has reported that miR-18b expression affected cell migration, viability and invasion in PE [12]. Moreover, it was verified increased maternal LEP concentration and hypomethylation of the LEP in placenta in early onset PE [21]. The current study was designed to explore the effect of exosomes and miR-18b-3p targeted LEP on the occurrence of PE. The findings in this study revealed that hucMSC-derived exosomal miR-18b-3p inhibited PE progression by reducing LEP.

Based on our findings, miR-18b-3p reduced and LEP elevated in placenta tissues of PE rats. Similar to our study, the mRNA expression of miR-18b was markedly suppressed in PE placental tissues relative to that in normal placental tissues [12]. In addition, a study revealed that miR-18b content was dramatically reduced in malignant melanoma tissues in comparison with their matched adjacent non-tumor tissues [22]. Another study has verified that placental LEP expression was raised in preterm PE compared with controls [23]. Moreover, a study showed that LEP expression was obviously heightened in preeclamptic placentas [15]. This literature provided a theoretical basis for us to explore the abnormal expression of miR-18b-3p and LEP in PE. Moreover, it was predicted using a bioinformatic software that LEP was targeted by miR-18b-3p, and this targeting relationship was further confirmed with dual-luciferase reporter gene assay in our research. A study reported that LEP is a target for all three miRNAs (miR-1301, miR-223 and miR-224) in early-onset PE [16]. Another study has displayed that LEP decreased miR-93 expression in osteoarthritis and rheumatoid arthritis [24]. However, the binding between miR-18b-3p and LEP in human diseases, especially in PE, remains scarcely studied, which is the novelty of this study. Furthermore, a result emerging from our study reported that exosomes increased miR-18b-3p and decreased LEP in placenta tissues of PE. It was formerly documented that the expression of miR-18b-5p was notably raised in colorectal cancer plasma exosomes [25], while the relationship between hucMSC-Exos and miR-18b-3p/LEP in PE needs further study.

Additionally, the finding from our investigation showed that restored miR-18b-3p reduced SBP and 24-h proteinuria of PE rats, increased the weight of placenta, declined TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in serum and placenta tissues as well as suppressed cell apoptosis. These data indicated that miR-18b-3p elevation contributes to alleviating the symptoms and pathological changes in PE. It was demonstrated that stable upregulation of miR-18b produced effective tumor inhibitor activity, such as inhibiting melanoma cell viability, inducing apoptosis and reducing tumor growth in vivo [26]. Another result in our study was that hucMSC-Exos reduced SBP and 24-h proteinuria of PE rats, increased the weight of placenta, declined TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in serum and placenta tissues as well as suppressed cell apoptosis. The findings of the current study revealed that exosomes treated PE rat models presented an increase of the number and quality of fetuses, the quality of placenta, but cell apoptosis was significantly reduced [8]. Interestingly, a previous research has demonstrated that the addition of fetal bovine exosomes declined contents of macrophage TNF-α and IL-6 [27]. A study has revealed that purified exosomes suppressed production of IL-1β in lipopolysaccharide/nigericin-stimulated macrophages [28]. Furthermore, Nong et al. have suggested that inflammatory markers, such as TNF-α and IL-6, were dramatically decreased after administration of exosomes produced through human-induced pluripotent stem cell-derived MSCs [29]. There is a article finding that the SBP was markedly elevated in the group of women who later developed PE [30, 31]. It was displayed that PE patients were positively associated with SBP and diastolic blood pressures and proteinuria [32]. Also, a recent study has provided a proof that proteinuria heightened with advancing gestation in PE women [33]. A important finding was that rats from the PE group had increased TNF-α relative to the normal pregnant group [34]. Another study has verified that serum IL-6 and IL-1β were obviously elevated in women with PE in relation to controls [35]. The above findings suggested that PE patients usually showed high SBP, proteinuria and levels of inflammatory factors. Thus, it could be inferred from our results that the hucMSC-derived exosomal miR-18b-3p had a therapeutic effect on PE.

Conclusion

In conclusion, our study provides evidence that hucMSCs-derived exosomes upregulate miR-18b-3p, which targets LEP to suppress the contents of inflammatory factors and reduce cell apoptosis rate in PE rat placenta tissues, thereby inhibiting the occurrence of PE. Thus, exosomal miR-18b-3p may be a potential candidate for treatment of PE via targeting LEP. This research identified the role of hucMSC-derived exosomal miR-18b-3p targeting LEP during PE development for the first time, which provided a novel insight for PE treatment. However, due to the limitation of known researches, the study needs to be monitored rigorously and reported appropriately in the future clinical trials.

Disponibilité des données et des matériaux

Non applicable.