Nanoplateformes de silice mésoporeuse creuse coiffées de chitosane pour l'administration de médicaments spécifiques au côlon

Introduction

Récemment, les systèmes d'administration de médicaments (DDS) sensibles aux stimuli ont attiré une attention considérable pour le chargement efficace et la libération sélective de médicaments dans les tissus malades ciblés [1]. Les systèmes conçus répondant aux stimuli peuvent être administrés aux sites malades et réaliser une libération de médicament à la demande pour améliorer les effets thérapeutiques et empêcher les effets secondaires prématurés induits par les fuites. Tous les stimuli internes et externes, tels que le potentiel redox [2], le pH [1], les enzymes [3] et la température et la lumière [4, 5], ont été utilisés pour concevoir des DDS sensibles aux stimuli. Parmi ces stimuli, les enzymes, en tant que stimuli internes, ont attiré une large attention en raison de leurs concentrations distinctes dans différents tissus [6].

Au cours des deux dernières décennies, des sphères de silice mésoporeuses (MSS) avec des mésopores de taille comprise entre 2 et 50  nm ont été établies en tant que vecteurs de médicaments sensibles aux stimuli [7, 8] puisque les MSS ont un volume de pores remarquablement capacité de charge médicamenteuse, structure de pores bien organisée, surface facilement fonctionnalisée et bonne biocompatibilité [9]. De plus, les nanoparticules de sphère de silice mésoporeuse creuse (HMSS) avec une structure de coquille mésoporeuse et une cavité creuse sont supérieures aux MSS conventionnelles car la structure creuse peut contenir efficacement plus de médicaments avec une capacité de stockage plus élevée que les porteurs de MSS [10, 11]. Toutes sortes de nanoporteurs sensibles aux stimuli basés sur les MSS ont été développés pour héberger des molécules médicamenteuses à l'aide de divers gardiens, tels que des polymères [12], des nanoparticules inorganiques [13], des dendrimères, des biomacromolécules [14], des peptides de composés macrocycliques [15] et des lipides [ 16]. Bien que de nombreux DDS basés sur des MSS avec coiffage fonctionnel puissent réaliser une libération en réponse à divers stimuli externes ou internes, peu d'entre eux ont été utilisés dans l'administration de médicaments ciblés spécifiques au côlon.

Il est bien connu que l'administration orale de médicaments est la manière préférée et simple d'administrer des médicaments. L'administration ciblée de médicaments spécifiques au côlon est très fascinante pour le traitement des maladies du côlon, notamment la maladie de Crohn, le cancer colorectal et la colite ulcéreuse. Cependant, l'administration de médicaments spécifiques au côlon peut rencontrer plusieurs problèmes, notamment une teneur en eau moindre et une surface relativement moins grande pour l'adsorption orale que sur d'autres sites du tractus gastro-intestinal (GI) [17,18,19]. De plus, les DDS oraux rencontrent également un environnement acide fort dans l'estomac, ce qui pourrait accélérer la dégradation des médicaments chargés dans le tractus gastro-intestinal, supprimant ainsi la capacité de réaliser une administration ciblée dans le côlon [19]. Pour cette raison, plusieurs DDS dépendant du pH ont été conçus pour réaliser une libération de médicament déclenchée par le pH à des valeurs de pH presque neutres (6 à 7) du tractus gastro-intestinal, résistant aux conditions très acides de la région de l'estomac [20,21,22 ,23]. Seule une légère différence d'acidité entre les régions intestinale (pH 6,8) et colique (pH 7,4) existe; par conséquent, ces DDS sensibles au pH ont du mal à réaliser une libération spécifique du côlon.

Le chitosan (CS), un polysaccharide cationique et biodégradable naturellement présent, est constitué d'unités gluco-(1-4)-liées glucosamine et N-acétyl-D-glucosamine [24]. Le CS a reçu une grande attention en médecine biologique en raison de ses propriétés fascinantes, notamment la biodégradabilité, la biocompatibilité, la mucoadhésivité et l'activité antibactérienne [25,26,27,28,29]. Comparé aux polymères, polyélectrolytes et supramolécules synthétisés via des processus compliqués, le CS est relativement bon marché et facilement disponible par la désacétylation exhaustive de la chitine [30,31,32]. De plus, il a été rapporté que le CS peut ouvrir des jonctions serrées entre les cellules, augmentant ainsi l'absorption du médicament [33]. Par conséquent, le polymère CS a été sélectionné comme agent de coiffage en raison de sa bonne biocompatibilité et de sa taille appropriée pour couvrir les mésopores du HMSS afin de bloquer la libération du médicament.

Dans notre travail, un DDS sensible aux enzymes spécifiques du côlon basé sur un matériau HMSS (HMSS-N=N-CS) a été conçu pour la première fois comme indiqué dans le schéma 1. Dans ce système, les porteurs HMSS ont été préparés via une méthode sélective. stratégie de gravure. Le polymère CS a été attaché à la surface du HMSS par des liaisons azoïques pour agir comme un gardien pour bloquer les ouvertures du HMSS. Les liaisons azoïques entre le HMSS et le CS peuvent être clivées par des enzymes dans les sites du côlon [34, 35], entraînant la séparation du CS des ouvertures du HMSS. La DOX a été utilisée comme médicament modèle à intégrer dans la cavité du HMSS, et des expériences de libération de médicament in vitro ont été menées pour évaluer la libération sensible aux enzymes en présence d'enzymes coliques. La microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et la cytométrie en flux (FCM) ont été utilisées pour étudier l'absorption cellulaire par les cellules Caco-2. Enfin, la cytotoxicité du HMSS–N=N–CS/DOX vis-à-vis des cellules Caco-2 a été mesurée.

Illustration schématique de a processus de préparation de HMSS–N=N–CS et b la charge médicamenteuse et la libération enzymatique de HMSS–N=N–CS/DOX en réponse à l'enzyme du côlon

Matériaux et méthodes

Matériaux

tétraéthoxysilane (TEOS); chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N-éthylcarbodiimide (EDC); chitosane (DAC ≥ 95 %); bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB); 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES); bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT); acide azobenzène-3,3'-dicarboxylique; bromure de potassium (pureté spectrale, 99,5%); Le N-hydroxysuccinimide (NHS) et le DOX ont été achetés auprès d'Aladdin Chemical Inc. (Shanghai, Chine). L'acide azobenzène-3,3'-dicarboxylique a été fourni par Inno-chem Technology Co. Ltd. (Pékin, Chine). Les milieux de culture cellulaire DMEM, pénicilline-streptomycine et sérum bovin fœtal (FBS) ont été fournis par GIBCO, Invitrogen Co. (Carlsbad, USA). Tous les réactifs analytiques n'ont pas été purifiés avant utilisation.

Préparation du HMSS–N=N–CS

Préparation du HMSS–NH₂

Les nanoparticules de HMSS ont été préparées sur la base des travaux publiés en utilisant une méthode de gravure sélective [36]. Les sphères solides de silice ont d'abord été synthétisées par une méthode Stober modifiée. Brièvement, 6 mL de TEOS ont été versés dans le mélange de 10 mL d'eau déminéralisée, 74 mL d'éthanol et 3 mL de NH₃ concentré. ·H₂ O. Ensuite, le mélange a été agité pendant 60 min pour obtenir des suspensions de silice colloïdale à température ambiante. Les sphères solides ont été centrifugées, lavées et séchées pour une utilisation ultérieure. Ensuite, la coquille de silice mésoporeuse a été recouverte de sphères de silice solides. Trois cents milligrammes de silice solide ont été dispersés dans 50 mL d'eau déminéralisée par ultrasons pendant 45 min. Et les suspensions de silice ont été versées dans un mélange de 60 mL d'éthanol, 450 mg de CTAB, 90 mL d'eau et 1,7 mL de NH₃ ·H₂ O. Après agitation du mélange pendant 60 min, du TEOS (0,75  mL) a été ajouté. Par la suite, les nanoparticules ont été centrifugées après agitation pendant 6 h pour collecter des échantillons puis redispersées dans 40 mL d'eau. Environ 1,2  g Na₂ CO₃ a été ajouté à la suspension aqueuse sous agitation vigoureuse. Après que le mélange ait été maintenu à 55°C pendant 12h, les produits des nanoparticules de HMSS ont été collectés et lavés avec de l'éthanol anhydre. La méthode post-greffage avec le ratio de HMSS et APTES étant à 4:1 (m/v) pour préparer HMSS–NH₂ à 80 °C sous N₂ condition pour 8 h, CTAB a été enlevé par reflux [3].

Préparation du HMSS–N=N–COOH

L'acide azobenzène-3,3'-dicarboxylique (50 mg) a été ajouté dans du PBS à pH 5,8. Ensuite (5 mg/mL), EDC et (3 mg/mL) NHS ont été ajoutés pour activer l'acide azobenzène-3,3′-dicarboxylique à 30 °C pendant 1 h. Et 10 mL de PBS contenant 15 mg/mL de HMSS–NH₂ a été ajouté et le mélange a été agité pendant 24 heures. Et le HMSS-N=N-COOH résultant a été séparé par centrifugation et lavé avec de l'éthanol.

Préparation du HMSS–N=N–CS

0,15 g de CS et 0,5 mL d'acide acétique ont été ajoutés dans 50 mL d'eau pour préparer la solution de CS. Et 100 mg de HMSS–N=N–COOH ont été dispersés dans 25 mL de PBS à pH 5,0 et activés par EDC et NHS pendant 0,5 h. Ensuite, une solution de CS (10 mL) a été versée dans la suspension sous agitation continue pendant 1 jour. Enfin, le HMSS-N=N-CS synthétisé a été centrifugé et lavé pour collecter les échantillons.

Extraction du mélange d'enzymes coliques de la microflore

La microflore colique a été collectée selon un ouvrage publié [37]. Ensuite, la culture a été inoculée pour obtenir un mélange d'enzymes sécrété par la microflore colique à 37 °C. Le milieu colique simulé contenant le mélange d'enzymes a été filtré à travers un filtre de 0,22 µm pour éliminer tous les débris cellulaires du fluide de culture. Par la suite, le filtrat a été lyophilisé pour obtenir le mélange d'enzymes sous forme de poudre, qui a été utilisé dans l'étude ultérieure.

Processus de chargement du médicament et libération enzymatique

Vingt-cinq milligrammes de DOX ont été dissous dans 5 mL de solution de HCl à pH 3,5. Et 100 mg de HMSS–N=N–CS ont été ajoutés dans la solution DOX et agités à température ambiante pendant 12 h. Ensuite, une solution de NaOH 0,2 M a été utilisée pour ajuster le pH du mélange à 7,0, et la suspension a été agitée pendant 12  h supplémentaires. Ensuite, le HMSS–N=N–CS chargé de DOX (appelé HMSS–N=N–CS/DOX) a été centrifugé et lavé pour éliminer la DOX adsorbée à la surface du HMSS–N=N–CS. Le surnageant a été recueilli à chaque étape pour mesurer l'efficacité de chargement DOX (LE) à 480 nm par spectrophotométrie UV-Vis. La masse totale de DOX chargée dans le HMSS–N=N–CS a été calculée en soustrayant la DOX déchargée après les processus de chargement du médicament de la masse initiale de DOX ajoutée. Le HMSS/DOX a été préparé comme témoin en utilisant le HMSS comme support initial. Le LE de DOX a été calculé selon l'équation :

Dans lequel m _A était la masse ajoutée de DOX, m _B était la masse de DOX dans le surnageant, et m _C était la masse totale du HMSS–N=N–CS.

La libération in vitro de DOX enzymatique à partir du HMSS–N=N–CS/DOX a été évaluée comme suit. Deux milligrammes de nanoparticules HMSS–N=N–CS/DOX et HMSS/DOX ont été dispersés dans du PBS à pH 7,4 secouant à 125 tr/min avec différentes concentrations de mélange d'enzymes coliques (0 mg/mL, 0,3 mg/mL et 1 mg/mL) . À des intervalles de temps spécifiés, 1 mL de milieu de libération a été prélevé pour mesurer l'absorbance. La libération de DOX a été mesurée à 480 nm. HMSS/DOX a été utilisé comme contrôle.

Adsorption de BSA

La quantité d'adsorption de BSA a été évaluée sur la base des travaux publiés [38, 39]. La BSA a été ajoutée dans du PBS à pH 7,4 (0,5  mg/mL). Cinq milligrammes de HMSS et HMSS–NH₂ et HMSS-N=N-CS ont été ajoutés dans 2,5  mL de PBS (pH 7,4). Et la solution de BSA à volume égal a été fournie, et la suspension a été placée dans un agitateur à 100 rpm. Après 6 h, une centrifugation a été utilisée pour recueillir la solution supérieure. Enfin, la concentration en BSA a été mesurée à 595 nm après coloration avec une solution de bleu brillant de Coomassie.

Caractérisation

La structure du réseau mésoporeux et la morphologie des nanoparticules HMSS ont été évaluées par images MET (EM–208S, CSIS, USA). La surface et la distribution de la taille des pores des nanoparticules ont été caractérisées à l'aide d'un analyseur d'analyse d'adsorption d'azote (V-Sorb 2800P, Gold APP Instrument Corporation, Chine). Les potentiels et les tailles de particules ont été caractérisés sur un Nano-z90 Nanosizer (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, Royaume-Uni). L'analyse TGA a été mesurée sur un équipement TGA-50 (Shimadzu, Kyoto, Japon) avec une vitesse de chauffe de 10 °C/min sous flux d'azote. Les spectres spectrophotométriques infrarouges à transformée de Fourier (FT-IR) ont été mesurés à l'aide d'un spectromètre FT-IR (Bruker Tensor27, Suisse). La gamme a été réalisée de 400 à 4000 cm ⁻¹ en utilisant la technique des pastilles de KBr. Power XRD a été réalisée sur un diffractomètre à rayons X Siemens D5005 (Karlsruhe, Allemagne) avec un rayonnement Cu-Kα (λ =1.5418 Å).

Expérience de culture cellulaire et d'absorption cellulaire

Les cellules Caco-2 ont été cultivées dans un milieu additionné de 10 % de FBS, 1 % d'acide aminé non essentiel, 1 % (v/v) d'acide pyruvique sodique et 1 % de streptomycine. Les cellules NIH-3T3 ont été cultivées dans du DMEM avec 1 % de streptomycine et 10 % de FBS. L'absorption des cellules Caco-2 des nanocarriers a été caractérisée à l'aide de FCM et CLSM. Les cellules Caco-2 ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits. Après la culture pendant une nuit, du DOX libre, du HMSS–N=N–CS/DOX et du HMSS–N=N–CS/DOX préincubés avec des nanoparticules d'enzymes coliques (égales à la concentration de 5 μg/mL de DOX) ont été ajoutés aux puits correspondants . Après une incubation continue pendant 2 h, le milieu cellulaire a été retiré et lavé soigneusement avec du PBS. Ensuite, les cellules ont été fixées par du formaldéhyde à 4 % et colorées par Hoechst 33258 pour l'observation CLSM. Le FCM a été utilisé pour obtenir une évaluation quantitative de l'absorption cellulaire. Les cellules Caco-2 ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits et encore incubées pendant 24 heures. Après lavage avec du PBS, les cellules Caco-2 ont été incubées avec du DOX libre, du HMSS–N=N–CS/DOX et du HMSS–N=N–CS/DOX préincubés avec des nanoparticules d'enzyme colique (égale à la concentration de 5 μg/ mL DOX) dans du DMEM sans sérum pendant 2 h. Ensuite, les cellules Caco-2 ont été rincées avec du PBS froid, trypsinisées et remises en suspension dans 0,5  mL de PBS. La fluorescence DOX dans les cellules a été mesurée à l'aide d'un cytomètre en flux FACS Canto (Becton, Dickinson, USA).

Test de prolifération cellulaire in vitro

La cytotoxicité des porteurs blancs HMSS et HMSS–N=N–CS vis-à-vis des cellules NIH-3T3 et Caco–2 a été attestée par le test MTT [40, 41]. En bref, les cellules Caco-2 et les cellules NIH-3T3 ont été ensemencées séparément dans des plaques à 96 puits et incubées pendant une nuit. L'ancien milieu cellulaire a été remplacé par un milieu sans sérum contenant différentes concentrations de nanoparticules. Après incubation pendant 2 jours, 50 μL de solution de MTT (2 mg mL ^–1 ) a été ajouté et incubé pendant 4 h pour mesurer les cellules vivantes. Ensuite, la solution de MTT a été retirée et 150 L de DMSO ont été ajoutés pour dissoudre le formazan. Par la suite, l'absorbance a été mesurée sur un lecteur de microplaques (Tecan, Männedorf, Suisse) à 570  nm. La cytotoxicité de DOX libre, HMSS–N=N–CS/DOX et HMSS–N=N–CS/DOX préincubés avec des mélanges enzymatiques extraits de la microflore colique a été mesurée en utilisant des cellules Caco-2 avec les concentrations de DOX correspondantes de (0,1, 1, 5, 10 et 20 g/mL). Le temps d'incubation était de 48  h, et les autres processus expérimentaux étaient les mêmes que ceux décrits ci-dessus.

Études de toxicité

Les tests d'irritation de la muqueuse gastro-intestinale sont essentiels pour l'évaluation de la biosécurité in vivo de l'administration orale de médicaments. Des rats mâles Sprague-Dawley (180 ± 10 g) ont été répartis au hasard en trois groupes (trois rats pour chaque groupe). Les rats ont reçu une solution saline, du HMSS et des nanoparticules HMSS-N=N-CS avec une dose de 100 mg/kg pour chaque jour. Après 7 jours et demi, tous les rats ont été sacrifiés et les tissus ont été collectés et examinés par examen histopathologique (H&E). Pour évaluer la biosécurité des nanoparticules HMSS et HMSS–N=N–CS, les poids corporels des souris BALB/c (18–20 g) ont été enregistrés après administration orale à une dose de 100 mg/kg tous les deux jours. Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément aux directives pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Université de médecine de Qiqihar et ont été approuvées par le comité d'éthique de l'Université de médecine de Qiqihar.

Statistiques

Les données statistiques ont été analysées avec un logiciel SPSS en utilisant le t de Student à deux queues -test. Les barres d'erreur présentées dans cette étude sont SD. Un p <0,05 est considéré comme statistiquement significatif.

Résultats et discussion

Préparation et caractérisation du HMSS–N=N–CS

Les HMSS ont été préparés sur la base de travaux antérieurs avec des modifications mineures [36]. Tout d'abord, du SiO₂ solide des nanosphères ont été préparées, et une coquille mésoporeuse a été revêtue sur la surface des nanosphères de silice solides contenant le modèle CTAB. Ensuite, Na₂ CO₃ a été utilisé pour graver sélectivement le solide SiO₂ nanosphères tandis que la coquille mésoporeuse était protégée par le modèle CTAB. La préparation du HMSS–N=N–CS avec CS attaché en tant que « garde-porte » par une liaison azoïque est décrite dans la Fig. 1a. Tout d'abord, les surfaces des nanoparticules de HMSS ont été modifiées avec APTES en tant que réactif de couplage alkyle pour devenir du HMSS à fonction amino (HMSS-NH₂ ) par une méthode de post-modification. Par la suite, HMSS–N=N–COOH a été préparé par une réaction d'amidation entre les groupes aminés de HMSS–NH₂ et les groupes carboxyle de l'acide azobenzène-3,3'-dicarboxylique. Ensuite, le CS a été modifié de manière covalente sur la surface des nanoparticules de HMSS par une réaction d'amidation entre les groupes carboxyle du HMSS-N=N-COOH et les groupes aminés du CS.

TEM de a HMSS et b HMSS–N=N–CS

Comme le montre l'image de microscopie électronique à transmission (MET) de la figure 1a, le diamètre moyen du HMSS était de 280  nm et les HMSS avaient une structure creuse uniforme et une coquille mésoporeuse très ordonnée. L'épaisseur moyenne de la coquille mésoporeuse était d'environ 90  nm. Par rapport à la surface lisse du HMSS, la surface du polymère greffé HMSS–N=N–CS (Fig. 1b) était rugueuse, indiquant que le CS recouvrait le support du HMSS.

Les surfaces et les distributions de pores des matériaux mésoporeux ont joué un rôle crucial dans le chargement et la livraison des molécules hôtes pour une libération contrôlée. Les courbes de distribution de la taille des pores et les isothermes ont été mesurées par N₂ analyse d'adsorption et de désorption (Fig. 2). Paramètres détaillés (la surface Brunauer-Emmett-Teller (BET) (S _PARIER ), volume poreux total (V _P ) et la distribution de la taille des pores (D _P )) sont affichés dans le tableau 1. Le S _PARIER et V _P de HMSS pur étaient de 810,7 m ² /g et 0,969 cm ³ /g, respectivement, et le D _P était d'environ 3,8  nm. Le D _P du HMSS–NH₂ était presque la même que celle du HMSS après amination, indiquant que les mésopores n'étaient pas bloqués après la fonctionnalisation amino. Le S _PARIER et V _P de HMSS–N=N–CS ont été nettement diminués après modification par le composé azoïque et le revêtement CS, indiquant que CS avait recouvert la surface du HMSS [1].

un Les isothermes d'adsorption/désorption d'azote et b distributions de la taille des pores du HMSS, HMSS–NH₂ , et HMSS–N=N–CS

Le succès de la greffe de HMSS–N=N–CS a été vérifié par diverses méthodes. Le potentiel du HMSS–NH₂ a subi un grand changement après fonctionnalisation, variant de - 27,9 à + 31,4  mV, comme le montre la figure 3a, qui a été attribué à l'ajout des groupes amine à la surface du HMSS. Après HMSS–NH₂ réagi avec l'acide azobenzène-3,3′-dicarboxylique pour former HMSS–N=N–COOH, le potentiel a encore diminué à - 2,0 mV en raison des groupes carboxyle à la surface du HMSS. Une fois que le polymère CS a été encore greffé sur la surface du HMSS pour former HMSS-N=N-CS, le potentiel est revenu à + 32,4  mV. Le résultat a été attribué au revêtement CS chargé positivement abondant en amino sur la surface du HMSS [1]. Courbes d'analyse thermogravimétrique (TGA) de HMSS, HMSS–NH₂ , les espèces HMSS–N=N–COOH et HMSS–N=N–CS sont illustrées à la figure 3b. Par rapport au HMSS–N=N–COOH, le HMSS–N=N–CS a perdu un poids supplémentaire d'environ 19 %, ce qui était dû à l'élimination des chaînes CS. Le greffage de liaisons azoïques à la surface du HMSS a également été confirmé par un changement de couleur lors de la préparation du HMSS–N=N–COOH, comme le montre l'encart de la figure 3b. Le réactif HMSS-NH₂ est blanc, tandis que le produit HMSS–N=N–COOH était brun jaunâtre après la réaction de l'acide azobenzène-3,3′-dicarboxylique avec les groupes amino du HMSS. Le diamètre hydrodynamique (D _H ) et les valeurs de l'indice de polydispersité (PDI) de HMSS, HMSS–NH₂ , et HMSS–N=N–CS ont été déterminés dans de l'eau distillée, comme le montre la figure 3c. Le HMSS avait un diamètre de 309  nm et un PDI de 0,190. Après l'ajout de groupes amine sur les surfaces du HMSS pour former le HMSS-NH₂ , le D _H augmenté à 324 nm. Le diamètre de HMSS–N=N–CS était de 342 nm, ce qui était plus grand que celui de HMSS–NH₂ grâce aux chaînes CS greffées. Le PDI de HMSS–N=N–CS (0,177) était inférieur à celui de HMSS–NH₂ , indiquant que les tailles moyennes de particules étaient devenues encore plus importantes après le greffage de CS. Comparés aux diamètres obtenus par MET, les diamètres de HMSS et HMSS–N=N–CS mesurés par DLS étaient plus grands. Le D _H des nanoparticules a été mesurée dans un environnement aqueux avec une couche d'hydratation, tandis que la taille des nanoparticules fournies par MET a été obtenue à partir de nanoparticules sèches [3]. Spectres FT-IR du HMSS–NH₂ , HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS et CS sont illustrés à la figure 4d. Par rapport aux pics pour HMSN–NH₂ , une augmentation des pics d'adsorption à 2853 et 2925 cm ⁻¹ a été attribuée à la vibration de − CH₂ dans le greffage de liaisons azoïques carboxy-terminales. Après l'ajout de CS à la surface du HMSS–N=N–COOH, il y a eu des augmentations des pics d'adsorption à 1660 cm ⁻¹ et 3435 cm ⁻¹ , qui ont été attribués à υ_(C=O) dans la bande amide et la vibration de N-H dans le CS. Tous les résultats ont prouvé la réussite de la préparation du HMSS-N=N-CS.

un Les potentiels correspondants de HMSS, HMSS–NH₂ , HMSS–N=N–COOH et HMSS–N=N–CS ; b Les courbes TGA de HMSS–NH₂ , HMSS–N=N–COOH et HMSS–N=N–CS (l'encart :la photographie de (a ) HMSS–N=N–COOH et (b ) HMSS–NH₂ ); c Distribution de la taille du HMSS, HMSS–NH₂ , et HMSS–N=N–CS encart :les valeurs PDI correspondantes des nanoparticules ; et d Spectres FT-IR du HMSS–NH₂ , HMSS–N=N–COOH, HMSS–N=N–CS et CS

Modèles XRD de DOX, HMSS–N=N–CS, HMSS–N=N–CS/DOX et PM

État du médicament et efficacité de chargement

DOX a été choisi pour étudier les comportements de chargement et de libération de HMSS–N=N–CS. Lorsque la valeur du pH de la suspension de nanoparticules HMSS-N=N-CS a été ajustée à un pH de 3,5, le biopolymère CS s'est chargé positivement (le pK_a de CS était de 6,3) en raison des groupes amino protonés dans l'environnement acide [24]. Le polymère CS s'est chargé positivement et a gonflé, conduisant à l'ouverture de mésopores de HMSS attribuées à l'interaction répulsive entre les charges de CS. Ainsi, DOX a eu accès aux mésopores de HMSS–N=N–CS par diffusion. Cependant, après que le mélange chargé de médicament ait été ajusté à 7,4, les chaînes CS se sont déprotonées et se sont effondrées pour empêcher la libération prématurée de DOX.

Le LE de HMSS–N=N–CS/DOX était de 35,2 %, ce qui était beaucoup plus élevé que celui des autres systèmes d'administration de silice mésoporeuse chargés en DOX [3, 16]. Le LE élevé de DOX dans les nanoporteurs HMSS a été attribué à la cavité creuse, à la grande surface et au réseau mésoporeux, qui pourraient être utilisés comme réservoir de médicament. L'état physique de la DOX dans HMSS–N=N–CS/DOX a été évalué par diffraction des rayons X de puissance (XRD). Comme le montrent les profils XRD (Fig. 4), la DOX brute a présenté des pics caractéristiques et intenses de diffraction cristalline du médicament. Le mélange physique (PM) de HMSS–N=N–CS et DOX a également montré des pics de diffraction cristallins évidents. Cependant, aucun pic cristallin distinct n'a été présenté par HMSS–N=N–CS/DOX, ce qui a prouvé que l'état physique de DOX dans HMSS–N=N–CS/DOX était non cristallin en raison des contraintes de la structure mésoporeuse de HMSS.

Libération in vitro sensible aux enzymes dans un environnement colique simulé

Pour étudier la libération enzymatique de HMSS–N=N–CS, des nanoparticules HMSS–N=N–CS/DOX et HMSS/DOX ont été ajoutées à du PBS à pH 7,4 avec différentes concentrations de mélange d'enzymes coliques. Comme le montre la figure 5a, le HMSS–N=N–CS/DOX présentait une libération lente de DOX dans du PBS à pH 7,4, et le pourcentage de libération cumulée n'était que d'environ 10 % en 24 h, indiquant une bonne capacité de coiffage du CS polymères et liaisons azoïques. Comme prévu, dans le cas d'une enzyme diluée dans du PBS à pH 7,4, la libération cumulative de DOX a été améliorée à plus de 20 % au cours de la même période. De plus, la quantité de libération de DOX a été considérablement augmentée à près de 40 % en présence d'enzyme concentrée. Comparativement à la libération enzymatique de HMSS–N=N–CS/DOX, la libération de DOX de HMSS/DOX avait des tendances similaires en présence ou en absence d'enzyme concentrée. Le pourcentage de libération de médicament relativement faible était dû à l'interaction électrostatique entre le HMSS chargé négativement et le DOX chargé positivement [42]. Les résultats ci-dessus ont prouvé que la libération de DOX à partir de HMSS–N=N–CS/DOX était nettement accélérée par des enzymes extraites de la microflore dans les régions coliques. Le mécanisme de libération sensible à l'enzyme pourrait être que les liaisons azoïques dans le HMSS-N=N-CS sont dégradées par l'enzyme, provoquant le détachement du CS de la surface du HMSS et la libération rapide du HMSS. Il a été rapporté que les liaisons azoïques étaient clivées par des enzymes sécrétées par la microflore colique [34, 35].

un Profils de libération cumulée de HMSS/DOX et HMSS–N=N–CS/DOX dans du PBS à pH 7,4 en présence d'un mélange d'enzymes coliques concentré et dilué ; et b comportements de libération in vitro sensibles au pH de la DOX à partir du HMSS–N=N–CS dans les milieux de libération de différentes valeurs de pH

De plus, pour évaluer davantage la libération enzymatique du HMSS-N=N-CS/DOX dans l'environnement mimétique GIT, les nanoplateformes HMSS-N=N-CS/DOX ont été initialement dispersées dans le SGF pendant 2 h, puis dispersées dans SIF pendant 6 h, et enfin, les supports ont été ajoutés à du PBS à pH 7,4 contenant 1 mg/mL d'enzyme extraite. Comme le montre la figure 5b, dans le suc gastrique simulé, la libération de DOX était relativement rapide et la quantité cumulée atteignait 15 % en 2 h. La libération relativement rapide était due à l'interaction plus faible entre le HMSS–N=N–CS et la DOX dans des conditions acides que dans des conditions neutres [1]. Ensuite, la libération de DOX a été ralentie dans SIF pendant 2 à 8 h. Cependant, après que le HMSS–N=N–CS/DOX ait été incubé avec des enzymes extraites dans du PBS à pH 7,4, la libération de DOX a continué d'augmenter de façon marquée et la quantité de libération cumulée a atteint plus de 50 % en 24 h. La libération incomplète de DOX du HMSS-N=N-CS/DOX était due à la forte interaction entre le DOX chargé positivement et le HMSS chargé négativement.

L'adsorption des protéines par et la stabilité du HMSS–N=N–CS

Pour l'administration orale, les propriétés de surface des nanosupports affecteront inévitablement les comportements de libération du médicament et la bioadsorption [43]. Un essai d'adsorption de protéines sur la surface a été utilisé pour évaluer l'effet du CS greffé sur la surface du HMSS. Comme le montre la figure 6a, les nanosupports HMSS nus avaient une adsorption de BSA spectaculaire pouvant atteindre 16,5 %, ce qui était attribué à la grande surface et à la cavité creuse du HMSS, à une forte capacité d'adsorption et à des interactions non spécifiques entre les groupes silanol de HMSS et de BSA [ 38, 39]. De plus, le HMSS–NH₂ avait de même une quantité de BSA adsorbée relativement élevée de 10,2 %. Néanmoins, le pourcentage de BSA adsorbé sur la surface a nettement diminué à 2,5% après l'ajout du polymère CS comme couverture, diminuant ainsi considérablement l'effet sur le comportement in vivo de HMSS-N=N-CS. Pour observer davantage la stabilité des échantillons de HMSS–N=N–CS et de HMSS, 20 mg de HMSS–N=N–CS et de HMSS ont été ajoutés à du PBS à pH 7,4 et de l'eau déminéralisée. As displayed in Fig. 6b, although HMSS–N=N–CS and HMSS were relatively stable in water, HMSS quickly flocculated in pH 7.4 PBS. By contrast, the dispersity of HMSS–N=N–CS was obviously enhanced after the polymer CS was grafted onto the surfaces of HMSS. Additionally, HMSS–N=N–CS carriers can remain stable for more than 12 h without precipitation in pH 7.4 PBS. These results proved that covering with the hydrophilic CS polymer could improve the dispersity and decrease protein adsorption on the surface of HMSS–N=N–CS.

un BSA adsorbance amounts of HMSS and HMSS–NH₂ and HMSS–N=N–CS (n =3, *p <0,05). b Photograph images of HMSS–N=N–CS and HMSS dispersed in water and PBS with a concentration of 4 mg/mL

Cellular Uptake

Caco–2 cells, as human epithelial colorectal adenocarcinoma cells, are widely used as model cells in oral drug delivery. As shown in Fig. 7a, Caco–2 cells incubated with free DOX showed a relatively strong fluorescence signal resulting from DOX because positively charged DOX could enter the cell and then the nucleus. Compared with the free DOX group, the HMSS–N=N–CS/DOX group showed a weaker fluorescence signal intensity due to incomplete drug release from HMSS–N=N–CS/DOX. However, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, it showed a markedly increased fluorescence signal. This was attributed to the azo bonds being cleaved by the enzyme mixture, which led to the removal of the CS from the surfaces of HMSS, thus significantly accelerating the DOX release from HMSS–N=N–CS/DOX. To quantitatively evaluate the cellular uptake differences for HMSS–N=N–CS/DOX and HMSS–N=N–CS/DOX incubated with extracted enzymes, FCM was used. As shown in Fig. 7b, the mean fluorescence intensity (MFI) for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 124.7, which was weaker than that of the free DOX group, with a p value less than 0.001. Excitingly, after HMSS–N=N–CS/DOX was preincubated with the colonic enzyme mixture for 1 h, the MFI markedly increased to 357 and even exceeded that of the free DOX group owing to the accelerated drug release from HMSS–N=N–CS/DOX after the breakage of azo bonds. All these results indicated that the azo bonds in HMSS–N=N–CS/DOX could be cleaved in the presence of colonic enzymes, which led to the shedding of CS from the surface of HMSS and accelerated the DOX release from HMSS.

un CLSM of Caco-2 cells incubated with different samples. b The MFI of DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX treated by enzyme measured by FCM in Caco-2 cells (n =3, ***p <0.001)

In Vitro Cell Viability Evaluation

To prove the enzyme-responsive release effect of HMSS–N=N–CS/DOX in simulated colonic conditions, an in vitro cell viability assay was carried out using Caco-2 cells. The classic anticancer drug DOX was used in the cell viability assay. Prior to this assay, different concentrations of blank HMSS and HMSS–N=N–CS were employed to ascertain the biocompatibility of the nanoplatform towards Caco-2 cells and normal NIH-3T3 (mouse embryo fibroblast) cells at various concentrations from 10 to 250 μg/mL by MTT assay [44, 45]. As displayed in Fig. 8a, b, HMSS and HMSS–N=N–CS at different concentrations showed negligible cytotoxicity after incubation with Caco–2 cells or NIH-3T3 cells, and the viability of Caco–2 cells was 87.9% and 88.3% at the high concentration of 100 μg/mL, respectively, which is sufficiently high for clinical applications due to the high drug loading of HMSS. In addition, NIH-3T3 cells incubated with HMSS and HMSS–N=N–CS for 48 h had high cell viability (above 80%) at the relatively high concentration of 100 μg/mL. These results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS are cytocompatible and could be employed for oral delivery.

Effect of HMSS and HMSS–N=N–CS on cell proliferation of a Caco–2 cells and b NIH-3T3 cells for 48 h by MTT assay. c Cytotoxicity of free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX, and HMSS–N=N–CS/DOX with enzyme against Caco-2 cells with different concentrations for 48 h

The effect of the DOX-loaded nanocarrier HMSS–N=N–CS/DOX on the viability of Caco–2 cells is displayed in Fig. 8c. Free DOX showed strong and concentration-dependent cytotoxicity towards 4T1 cells, which was attributed to the fact that positively charged free DOX could pass through 4T1 cell membranes easily. L'IC₅₀ value for the free DOX group was determined to be 10.18 μg/mL using the SPSS Statistics software. Compared with free DOX, HMSS–N=N–CS/DOX exhibited a higher cell viability at the same DOX concentration owing to the incomplete release of DOX from HMSS–N=N–CS induced by the strong electrostatic interactions between negatively changed HMSS carriers and positively changed DOX. L'IC₅₀ value for the HMSS–N=N–CS/DOX group was 32.22 μg/mL, which was much higher than that for free DOX. However, HMSS–N=N–CS/DOX preincubated with concentrated colon enzymes showed an obvious concentration-dependent cytotoxicity, and the IC₅₀ value was calculated to be 9.41 μg/mL, which was much lower than that of HMSS–N=N–CS/DOX. This reason could be ascribed to the colon enzymes degrading the azo bonds in HMSS–N=N–CS, which would lead to the detachment of grafted CS from the surface of HMSS, causing the fast release of DOX from HMSS carriers.

Toxicity Studies

The hazards of using HMSS–N=N–CS are a vital factor to be considered before its clinical applications in the future. H&E staining of gastrointestinal mucosa irritation is essential to evaluate the in vivo biosafety of the delivery system for oral administration (Fig. 9a). Compared to a saline group, both the HMSS and HMSS–N=N–CS groups exhibited no marked histopathological changes or hyperemia after oral administration for a week with an administration dose of 100 mg/kg. No death or unusual behaviors of rats was observed during the experimental process. A decrease in body weight is widely regarded as an important and simple index for in vivo systemic toxicity [46]. As shown in Fig. 9b, the body weights of mice in the HMSS and HMSS–N=N–CS groups increased slightly and were similar to those of the saline group. The above results indicated that HMSS and HMSS–N=N–CS showed good biocompatibility as drug carriers for oral administration.

un Gastrointestinal mucosa irritation assay after oral administration of HMSS and HMSS–N=N–CS with the dose of 50 mg/kg for 7 days. b The weight changes of mice after oral administration for a week. Data were means ± SD (n =3)

Conclusions

In summary, biodegradable CS was attached through azo bonds to gate the openings of HMSS to achieve enzyme-responsive colon-specific drug delivery. DOX was loaded in the hollow cavity and mesopores of HMSS in a noncrystalline state with a high loading efficiency of 35.2%. Stability and BSA adsorption results illustrated that the CS gates could increase the biocompatibility and stability of HMSS. In vitro release results proved that HMSS–N=N–CS/DOX exhibited enzyme-responsive drug release behavior in the presence of colonic enzymes. CLSM uptake and FCM results indicated that the cellular uptake of DOX was obviously increased after HMSS–N=N–CS/DOX was incubated with the colonic enzyme mixture. Cell viability results indicated that HMSS–N=N–CS/DOX incubated with colonic enzymes showed increased cytotoxicity, and the IC₅₀ value obviously decreased from 32.22 μg/mL for HMSS–N=N–CS/DOX to 9.41 μg/mL upon incubation.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données sont entièrement disponibles sans restriction.

Abréviations

HMSS:

Hollow mesoporous silica spheres

CS :

Chitosan

DOX :

Doxorubicine

DDSs:

Drug delivery systems

MSSs:

Mesoporous silica spheres

CLSM:

Microscopie confocale à balayage laser

FCM :

Cytométrie en flux

FBS :

Sérum fœtal bovin

LE:

Loading efficiency