Les tétraèdres à ADN modifiés par Gint4.T chargés de doxorubicine inhibent la prolifération des cellules de gliome en ciblant PDGFRβ

Introduction

Le gliome, une tumeur dérivée du neuroépithélium, est la tumeur maligne intracrânienne la plus courante. Près d'1/3 de toutes les tumeurs cérébrales sont des gliomes et environ 4/5 des tumeurs cérébrales malignes primitives sont des gliomes [1,2,3,4]. Actuellement, le traitement le plus efficace du gliome est la résection chirurgicale et la radiochimiothérapie postopératoire concomitante, mais malheureusement, le pronostic des patients reste sombre. La chimiothérapie traditionnelle du gliome ne donne pas de bons résultats en raison d'un mauvais ciblage tumoral, de complications dues à la barrière hémato-encéphalique (BHE) et à la barrière hémato-tumeur (BTB) et à un ciblage médicamenteux insuffisant. La BHE est le facteur le plus important qui empêche la livraison de presque toutes les macromolécules (y compris les médicaments et les gènes) au parenchyme cérébral et leur bon fonctionnement. Les médicaments qui ne peuvent pas traverser la BHE doivent être administrés à des doses suffisamment élevées pour atteindre une concentration thérapeutique efficace dans la zone d'intérêt. Cependant, un excès de médicaments peut provoquer des effets secondaires systémiques graves et une accumulation indésirable de médicament dans les tissus non affectés. De plus, les médicaments anti-gliomes conventionnels existants ont des capacités de ciblage insuffisantes [3, 4]. Les nanoparticules sont devenues l'outil de transport de médicaments le plus prometteur. En raison de leur avantage de taille, les nanoparticules peuvent traverser la BHE et exercer un effet antitumoral. Kafa et al. [5] ont conçu des nanotubes de carbone multiparois chimiquement fonctionnalisés (f-MWNT) ciblant l'ANG et ont confirmé leur capacité à traverser la BHE grâce à des expériences in vivo et in vitro. Cependant, ces nanomatériaux peuvent être distribués dans divers organes du corps ou même pénétrer dans le système nerveux central (SNC), où ils peuvent provoquer une neurotoxicité [6].

L'ADN est un matériau idéal pour la construction de nanostructures car son assemblage peut être contrôlé avec précision par l'appariement de bases Watson-Crick [7]. À ce jour, un certain nombre de nanostructures d'ADN bidimensionnelles (2D) et tridimensionnelles (3D) ont été conçues et démontrées [8,9,10]. Les nanostructures d'ADN tétraédriques (TDN) ont attiré une attention considérable en raison de leur biocompatibilité, stabilité, abondants sites de modification fonctionnalisés et faible immunogénicité [11,12,13]. Turberfield et al. synthétisé des nanostructures tétraédriques d'ADN avec un rendement élevé en utilisant une méthode de synthèse en une étape [14]. Walsh et al. ont découvert qu'un tétraèdre d'ADN contenant une sonde d'acide nucléique pouvait pénétrer dans les cellules de mammifère sans avoir besoin de réactif de transfection [15]. Lee et al. ont démontré que les nanoparticules tétraédriques auto-assemblées peuvent être utilisées pour la livraison ciblée d'ARNsi in vivo [16]. Le TDN a montré d'excellentes perspectives d'application dans le diagnostic moléculaire, l'administration moléculaire et la thérapie médicamenteuse ciblée. Ils sont également largement utilisés dans la recherche sur les tumeurs de divers organes, comme le cancer du sein [17]. De même, les TDN ont également été utilisés dans l'étude des maladies du système nerveux. Tian et al. [18] ont utilisé des tétraèdres d'ADN comme base et les ont modifiés avec de l'angiopep-2 (ANG) pour construire avec succès la nanosonde ANG-TDN, qui pourrait cibler la protéine 1 liée au récepteur des lipoprotéines de basse densité (LRP-1) pour une imagerie ciblée. La recherche a montré que l'ANG-TDN peut traverser la BBB. Ma et al. [19] ont suggéré que les nanostructures d'ADN tétraédriques peuvent pénétrer dans les cellules souches neurales (NSC) sans avoir besoin d'agents de transfection, où elles favorisent la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches neurales [20], et ont un grand potentiel pour la réparation et la régénération des tissus neuraux. . Par conséquent, nous avons étudié la possibilité d'utiliser le TDN dans le traitement des gliomes et d'améliorer sa capacité de ciblage.

Le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes β (PDGFRβ) est un membre important de la famille des tyrosine protéine kinase qui est impliqué dans la prolifération cellulaire, la migration et l'angiogenèse. Plusieurs études ont montré que PDGFβ est une cible prometteuse pour les thérapies antitumorales en raison de son rôle dans l'angiogenèse [21, 22]. Les aptamères sont de courts oligonucléotides d'ADN ou d'ARN simple brin qui sont produits par la méthode d'évolution systématique de ligands par la méthode d'enrichissement exponentiel (SELEX). Les aptamères sont similaires aux anticorps, qui ont une affinité et une spécificité élevées envers leurs cibles [23]. En raison de leurs propriétés uniques, les aptamères jouent un rôle important dans l'administration ciblée d'agents chimiothérapeutiques, d'ARNsi et de nanoparticules chargées de médicaments. Gint4.T, un aptamère à ARN capable de lier spécifiquement PDGFRβ, est également un antagoniste spécifique de PDGFRβ [24]. Monaco et al. [25] ont suggéré que les aptamères Gint4.T peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE) et reconnaître spécifiquement PDGFRβ. Les nanoparticules polymères (PNP) conjuguées à Gint4.T peuvent être facilement absorbées par les cellules de glioblastome (GBM). Dans cette étude, nous rapportons un nouveau système chargé de médicaments qui combine l'aptamère Gint4.T et le TDN. Le TDN modifié par Gint4.T (Apt-TDN) chargé de DOX (DOX@Apt-TDN) présentait une absorption cellulaire spécifique améliorée et une cytotoxicité contre les cellules U87MG.

Méthodes

Matériaux

Tous les oligonucléotides d'ADN et les oligonucléotides d'ARN 2'F-Py ont été achetés auprès de Sangon Biotech (Shanghai, Chine), et toutes les séquences d'oligonucléotides sont répertoriées dans le tableau 1. La solution de coloration sur gel d'ADN GelRed a été achetée auprès de Sangon Biotech. Le sérum bovin fœtal (FBS) et le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) ont été achetés auprès de Thermo Fisher (New York, États-Unis). La doxorubicine (DOX) a été achetée auprès de Mengbio Technology (Chongqing, Chine). Les cellules U87MG ont été achetées auprès de la bibliothèque de cellules de l'Académie des sciences de la vie de Shanghai (Shanghai, Chine). DAPI a été acheté auprès de Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Pékin, Chine).

Préparation de nanostructures d'ADN

Pour assembler le tétraèdre d'ADN (tableau 1), 2 μL de chaque oligonucléotide (S1, S2, S3 et S4) ont été ajoutés à 42 μL de tampon TM (10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂ , pH =8). La solution d'ADN a ensuite été chauffée à 95°C pendant 5 min puis refroidie à 4 °C pendant 2 min en utilisant une machine PCR Bio-Rad (Californie, USA) [26, 27]. La concentration finale de TDN était de 2 µM. TDN' a été préparé de la même manière sauf que S1 a été remplacé par S1'. Pour synthétiser l'Apt-TDN, l'aptamère Gint4.T a été ajouté au TDN à un rapport molaire égal, et le mélange a été incubé à 37°C pendant 60 min. Avant la synthèse, l'aptamère a été soumis à une courte étape de dénaturation-renaturation (85 °C pendant 5 min, refroidissement rapide pendant 2 min puis réchauffement à 37 °C pendant 10 min) [25].

Électrophorèse sur gel d'agarose

Un gel d'agarose (3 %) a été passé dans du tampon TEB 0,5 x à 100 µV pendant 30 µmin. La température de l'appareil d'électrophorèse a été maintenue à 0°C en plaçant l'appareil dans un bain de glace. Avant l'électrophorèse, GelRed a été ajouté au gel d'agarose pour colorer les brins d'ADN. Une fois le processus terminé, un scanner à fluorescence Bio-Rad (Californie, États-Unis) a été utilisé pour capturer une image du gel.

Diffusion dynamique de la lumière

Un Malvern Zetasizer ZS90 (Malvern, Royaume-Uni) a été utilisé pour mesurer la taille hydrodynamique et le potentiel zêta du TDN. Un total de 1 mL de TDN (100 nM) a été soumis à une analyse de diffusion dynamique de la lumière (DLS).

Imagerie par microscopie à force atomique

Les TDN ont été dilués à 100 nM avec du tampon TM (tampon Tris-HCl contenant MgCl₂ ). Ensuite, 10 μL de chaque échantillon de TDN ont été ajoutés à du mica fraîchement clivé et incubés pendant 10 min. Les échantillons ont ensuite été imagés sur un instrument de microscopie à force atomique (AFM) en mode AC (Agilent 5500, USA).

Mesure de la capacité de chargement de médicament du TDN préparé

La doxorubicine a été dissoute dans de l'eau désionisée pour former une solution de stockage de 500 μM. La doxorubicine à différentes concentrations (1 à 20 μM) a été mélangée avec du TDN (100 nM) ou de l'Apt-TDN (100 nM) pendant 6 h à température ambiante (24–26 °C). Les solutions mélangées ont ensuite été centrifugées à 12.000×g pendant 10 min pour obtenir le TDN chargé de médicament. Ensuite, 50 μL des surnageants ont été retirés et mélangés avec du PBS dans un rapport 1:1. Un lecteur de microplaques Varioskan LUX (Californie, USA) a été utilisé pour mesurer l'intensité de fluorescence de la doxorubicine (λ _ex =480 nm et λ _les =590 nm) pour déterminer la quantité de doxorubicine dans les surnageants [28]. La concentration de doxorubicine chargée dans le TDN a été calculée par la courbe standard et l'intensité de fluorescence. Nous avons également mélangé la doxorubicine avec le TDN à des rapports molaires croissants.

Stabilité du sérum du TDN In Vitro

Les TDN ont été mélangés avec du milieu complet et incubés à 37°C pendant 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 ou 24  h. Les solutions de TDN ont été mélangées avec du FBS dans un rapport 1:1 et incubées à 37°C pendant 1, 3, 5 ou 7 h. Après incubation, les mélanges ont été passés sur un gel d'agarose à 3%.

Cytotoxicité du TDN In Vitro

Pour déterminer la cytotoxicité du TDN, des cellules U87MG à une concentration de 1 × 10 ⁴ cellules/puits ont été ensemencées sur une plaque à 96 puits. Le milieu de culture cellulaire a été retiré et des milieux frais contenant 0 à 500 nM de TDN ont été ajoutés et incubés pendant encore 24  h et 48 h après une nuit d'incubation. Ensuite, 10 L de solution de CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits, et le mélange a été incubé pendant 1 h. L'absorbance à 450 nm a ensuite été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques.

Imagerie par fluorescence

L'absorption cellulaire de DOX et de TDN a été étudiée par microscopie à fluorescence (Olympus, Tokyo, Japon). Les cellules U87MG ont été ensemencées sur des lamelles dans des plaques à 24 puits avec un milieu contenant 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline et de streptomycine et cultivées pendant au moins 1 jour à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO ₂ jusqu'à ce que les cellules atteignent au moins 75 % de confluence. Après incubation, les milieux de culture ont été retirés. Des milieux complets contenant 100 nM de Cy3-TDN et Cy3-Apt-TDN ont été ajoutés et incubés pendant 3 h. TDN et Apt-TDN ont été marqués avec Cy3 pour détecter l'absorption intercellulaire de nanoparticules. Pour évaluer l'absorption cellulaire de DOX, DOX (DOX 2 μM), DOX@TDN (DOX 2 μM) et DOX@Apt-TDN (DOX 2 μM) ont été ajoutés aux cellules U87MG et incubés pendant 3 h. Après 3 h de traitement, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4% pendant 20 min à l'obscurité puis colorées au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 min. Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et observées au microscope à fluorescence.

Cytométrie en flux

Un total de 1 × 10 ⁶ Des cellules U87MG ont été implantées dans des plaques à 6 puits. Après une nuit d'incubation, les milieux de culture ont été retirés et des milieux supplémentés avec 100 nM de Cy3-TDN, 100 nM de Cy3-Apt-TDN ou 100 nM de Cy3-Apt-TDN + 1 M d'Apt libre ont été ajoutés et incubés pendant 3 h. Ensuite, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min et la cytométrie en flux a été utilisée pour analyser les pourcentages de cellules Cy-3-positives.

Cycle cellulaire et apoptose

Après traitement avec DOX, DOX@TDN ou DOX@Apt-TDN pendant 24 h, 5 × 10 ⁵ les cellules ont été recueillies et fixées dans de l'éthanol glacé à 75 % pendant la nuit. Ensuite, les cellules ont été incubées avec de la RNase et de l'iodure de propidium pendant 30 min à 37 °C dans l'obscurité. Le cycle cellulaire a été étudié par cytométrie en flux. De plus, après les différents traitements, les cellules ont été colorées à l'Annexine V-FITC/DAPI, et l'apoptose précoce a été explorée.

Dosages CCK-8

Pour déterminer la viabilité cellulaire, les cellules U87MG (5 × 10 ³ ) ont été ensemencés sur des plaques 96 puits avec 100 μL de milieu et cultivés une nuit à 37 °C sous atmosphère contenant 5% de CO₂ . Le milieu a ensuite été retiré et du milieu frais contenant du DOX, du DOX-TDN ou du DOX-Apt-TDN a été ajouté. Après 24 h d'incubation, 10 L de solution de CCK-8 ont été ajoutés, et les cellules ont été cultivées pendant encore 1 h. Un lecteur de microplaques a été utilisé pour mesurer l'absorbance à 450 nm.

Analyse statistique

Toutes les expériences de cette étude ont été réalisées en triple, et toutes les données sont présentées comme la valeur moyenne avec son écart type (moyenne ± SD). L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du programme SPSS 24.0 (IBM, USA). Des différences significatives ont été déterminées en utilisant le t de Student test, avec P <0,05 indiquant des différences significatives entre les groupes.

Résultats

Synthèse et Caractérisation du TDN et Apt-TDN

Le TDN a été auto-assemblé à partir de quatre oligonucléotides (tableau 1) via une synthèse en une seule étape, comme indiqué précédemment [18, 29]. L'aptamère ciblant la tumeur Gint4.T a été utilisé pour modifier le TDN via l'appariement de bases Watson-Crick. Le tétraèdre d'ADN contient quatre faces, chaque face étant formée par un oligonucléotide. Ainsi, quatre oligonucléotides se sont hybrides les uns avec les autres pour former un tétraèdre d'ADN (Fig. 1a). L'analyse par électrophorèse sur gel a montré une seule bande proéminente dans les voies 4 et 5, suggérant que le TDN et l'Apt-TDN ont été construits avec succès. La mobilité de l'Apt-TDN a diminué par rapport à celle du TDN, ce qui suggère que l'aptamère Gint4.T a réussi à modifier le TDN.

un Synthèse du tétraèdre d'ADN et de Gint4.T-TDN. Voie 1 :S1 ; voie 2 :S1+S2 ; voie 3 :S1+S2+S3 ; voie 4 :S1+S2+S3+S4 (TDN) ; piste 5 :TDN mélangé avec Apt-tail (Gint4.T); Apt-TDN. La piste 1 n'était pas visible car les colorants d'acide nucléique ne peuvent pas colorer correctement l'ADN simple brin. b Les images AFM ont montré que les hauteurs du TDN et de l'Apt-TDN étaient d'environ 2  nm. c Détermination de la taille des particules et du potentiel zêta du TDN et de l'Apt-TDN par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Les tailles de particules moyennes du TDN et de l'Apt-TDN étaient respectivement de 10,10 nm (A) et 13,54  nm (B). Les potentiels zêta moyens du TDN et de l'Apt-TDN étaient respectivement de - 5,69 mV (C) et - 7,3 mV (D)

Les tailles des TDN et Apt-TDN ont été déterminées par DLS et AFM. Le TDN et l'Apt-TDN ont montré des tailles de particules de 10,1 nm et 13,5 nm, respectivement, reflétant l'ajout du ligand Gint4.T (Fig. 1c (A), (B)). Comme le diamètre hydrodynamique inclut les molécules d'eau, les particules étaient plus grosses que leurs tailles théoriques. Les hauteurs du TDN et de l'Apt-TDN déterminées par les images AFM étaient de ~ 2 nm (Fig. 1b), indiquant que la modification de l'aptamère n'a pas changé la structure 3D. Les potentiels zêta moyens du TDN et de l'Apt-TDN étaient respectivement de − 5,69 mV (C) et de − 7,3 mV (D) (Fig. 1c (C) (D)). Sur la base de ces paramètres, nous avons conclu que le TDN et l'Apt-TDN avaient été assemblés avec succès.

Stabilité et cytotoxicité du TDN in vitro

L'analyse par électrophorèse sur gel a montré que le TDN restait intact lorsqu'il était incubé dans un milieu complet pendant 24h à 37°C (Fig. 2a (A)). De plus, lorsque la concentration de sérum bovin fœtal a été augmentée à 50 %, le TDN est resté stable pendant au moins 7 h (Fig. 2a (B)), ce qui est cohérent avec les rapports précédents [18, 26]. Pour déterminer la cytotoxicité de la nanostructure, le test CCK-8 a été utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire des cellules U87MG après traitement avec le TDN à un certain nombre de concentrations. Comme le montre la figure 2b, aucune cytotoxicité significative n'a été observée dans les cellules U87MG traitées avec du TDN à 0-500 nM pendant 24 h et 48 h. Par conséquent, les nanoparticules d'ADN peuvent être utilisées comme supports stables et biosûrs pour l'administration de médicaments.

un L'électrophorèse sur gel a montré que le TDN restait stable pendant 24 h en milieu complet à 37 °C (A); le TDN est resté stable pendant 7 h lorsque la concentration de sérum bovin fœtal a été augmentée à 50 % (B). b Les cellules U87MG ont été co-cultivées avec le TDN à différentes concentrations (10-500 nM) pendant 24 h et 48 h. Le test CCK-8 a montré que l'activité des cellules U87MG n'était pas affectée, ce qui indiquait la biosécurité du TDN

Capacité de chargement de médicaments du TDN et de l'Apt-TDN

La doxorubicine est un médicament chimiothérapeutique à large spectre qui peut s'intercaler dans des doubles brins d'ADN. Nous avons calculé une courbe de doxorubicine standard (Fig. 3a) et ensuite étudié l'intercalation de la doxorubicine dans le TDN. La quantité de doxorubicine intercalée dans le TDN et l'Apt-TDN a augmenté progressivement avec l'augmentation de la concentration de doxorubicine. Lorsque la concentration de doxorubicine était de 14 M, la quantité de doxorubicine intercalée dans le TDN et l'Apt-TDN a culminé à 5,5 M et 6,0 M, respectivement, et a ensuite atteint un plateau (Fig. 3b), indiquant que les brins d'ADN étaient complètement occupés. Pendant ce temps, nous avons mélangé la doxorubicine avec le TDN à des rapports molaires croissants. Le spectre de fluorescence de la doxorubicine a été balayé pour analyse. Comme le montre la figure 3c, le spectre de fluorescence de la doxorubicine a été désactivé avec de la doxorubicine à un rapport molaire de 0,05. Sur la base de ces résultats, nous avons conclu qu'environ 55 molécules de doxorubicine étaient contenues dans un seul TDN, tandis que 60 molécules étaient contenues dans un seul Apt-TDN.

un Une courbe standard des concentrations de DOX dans le tampon PBS ; ex =480 nm et em =590 nm. La quantité de DOX transportée par le TDN et Apt-TDN. b La DOX s'est intercalée dans l'ADN double brin du TDN et de l'Apt-TDN. Lorsque la concentration de DOX a atteint 14 M et que la concentration de DOX intercalée dans le TDN et l'Apt-TDN a culminé à 5,5  μM et 6,0  μM, respectivement, un seul tétraèdre d'ADN pouvait transporter 55 molécules de Dox, tandis qu'un seul tétraèdre d'ADN modifié par aptamère portait 60 DOX. molécules. c Spectres de fluorescence de la DOX dans le surnageant. La doxorubicine a été mélangée avec le TDN à des rapports molaires croissants (0, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01 et 0,05 de haut en bas). Lorsque le rapport molaire était de 1:20, la fluorescence a été désactivée

Captation cellulaire ciblée de l'Apt-TDN

L'ADN est une macromolécule chargée négativement, ce qui rend difficile son entrée dans la membrane cellulaire chargée négativement. En règle générale, les molécules d'ADN individuelles doivent accéder aux cellules à l'aide d'un réactif de transfection. Ici, nous avons étiqueté TDN et Apt-TDN avec Cy3 pour surveiller l'absorption intracellulaire des nanoparticules. Après incubation avec des cellules U87MG pendant 3 h, un signal de fluorescence Cy3 rouge a émergé dans le cytoplasme cellulaire, indiquant que le TDN liait la cytomembrane et était absorbé dans la cellule sans l'aide d'agents de transfection (Fig. 4a). L'Apt-TDN a montré une fluorescence rouge plus élevée, ce qui suggère que la présence de l'aptamère Gint4.T a augmenté de manière significative l'absorption du tétraèdre d'ADN par les cellules U87MG. Cependant, lorsque l'aptamère libre a été ajouté, la fluorescence Cy3 a diminué au niveau observé pour le TDN seul. En raison de l'inhibition compétitive par l'aptamère libre, nous en déduisons que l'aptamère sur le TDN ne pourrait pas faciliter l'absorption du TDN. Sur la base de cette inhibition compétitive, nous avons prouvé que l'Apt-TDN peut cibler les cellules U87MG. La cytométrie en flux a en outre prouvé que le pourcentage de cellules U87MG Cy3-positives était plus élevé dans le groupe Apt-TDN que dans le groupe TDN. Free Apt a diminué le pourcentage de cellules U87MG Cy3-positives dans le groupe Apt-TDN (Fig. 4b).

un Captation cellulaire U87MG du TDN et de l'Apt-TDN (TDN-Gint4.T). Le TDN est entré directement dans les cellules U87MG sans agents de transfection, et l'absorption d'Apt-TDN (liée à l'aptamère Gint4.T) a été significativement augmentée et inhibée de manière compétitive par l'Apt libre (Gint4.T), indiquant que l'aptamère Gint4.T joue un rôle rôle important dans le ciblage cellulaire. La barre d'échelle représente 50 m. b Les courbes de cytométrie en flux montrent l'absorption intracellulaire du TDN, Apt-TDN et Apt-TDN+Apt après incubation pendant 3 h

Captation cellulaire du DOX@TDN et DOX@Apt-TDN

Nous avons utilisé le spectre de fluorescence caractéristique de la doxorubicine pour évaluer l'efficacité d'absorption du médicament. Après 3h de traitement, la doxorubicine intracellulaire a été imagée par microscopie à fluorescence (Fig. 5a). La doxorubicine libre pouvait pénétrer dans les cellules U87MG et était localisée dans le noyau. Avec l'ajout du DOX@TDN, la fluorescence était supérieure à celle de la doxorubicine libre. Ce résultat suggère que les nanoparticules d'ADN améliorent l'absorption cellulaire de la doxorubicine. Lorsque DOX@Apt-TDN a été ajouté, le signal rouge dans le noyau était encore plus élevé que celui des cellules auxquelles avait été ajouté DOX@TDN. L'analyse semi-quantitative de l'absorption intracellulaire de la DOX a en outre confirmé que l'Apt-TDN a facilité une augmentation de plus du double de l'absorption intracellulaire de la DOX par rapport à celle du médicament unique. Nous en déduisons que cela est dû à la liaison spécifique de Gin4.T aux récepteurs, à la suite de laquelle davantage de nanoparticules peuvent pénétrer dans la cellule. Après digestion dans les lysosomes, la doxorubicine peut être libérée dans le cytoplasme et poursuivre ses fonctions dans le noyau.

un Absorption cellulaire du DOX, du DOX@TDN et du DOX@Apt-TDN. Modifié avec l'aptamère Gint4.T, l'Apt-TDN pourrait délivrer plus de doxorubicine aux cellules U87MG que le TDN. De plus, le TDN pourrait transporter plus de médicament vers les cellules que le médicament seul. Les barres d'échelle indiquent 50  μm. b Analyse semi-quantitative de l'intensité de fluorescence de la doxorubicine avec un traitement PBS, DOX, DOX@TDN et DOX@Apt-TDN (par rapport au blanc :*p <0,05, ***i>p <0,01)

Cytotoxicité du DOX, du DOX@TDN et du DOX@Apt-TDN

Pour l'étude de cytotoxicité, trois groupes de cellules U87MG ont été traités avec différentes concentrations de doxorubicine (Fig. 6a). L'IC₅₀ les valeurs pour la doxorubicine étaient de 13,39 µM pour le traitement DOX, de 7,826 µM pour le traitement DOX@TDN et de 4,205 µM pour le traitement DOX@Apt-TDN. Parmi les trois traitements, le DOX@Apt-TDN a montré la cytotoxicité la plus élevée à 24 h, ce qui indiquait la spécificité de l'Apt-TDN pour les cellules U87MG. Après 24 h, les cellules des groupes DOX, DOX@TDN et DOX@Apt-TDN ont été collectées et utilisées pour explorer l'apoptose précoce. Nos données ont démontré que le taux d'apoptose précoce était plus élevé dans le groupe DOX@Apt-TDN que dans les deux autres groupes (Fig. 6b). De plus, la proportion de cellules en phase G0/G1 a été augmentée dans le groupe DOX-Apt-TDN par rapport aux groupes DOX et DOX-TDN (p <0,01), et le ratio de cellules en phase S a diminué dans le groupe DOX-Apt-TDN (p <0,01) (Fig. 6c). Le pourcentage de cellules en phase G2 n'a pas été modifié (données non présentées).

un Cytotoxicité du DOX, du DOX@TDN et du DOX@Apt-TDN à diverses concentrations. Le taux d'inhibition des cellules U87MG était significativement augmenté avec l'augmentation de la concentration de DOX, mais les groupes DOX@TDN et DOX@Apt-TDN présentaient une cytotoxicité significativement accrue par rapport au groupe DOX. Le taux d'inhibition cellulaire du groupe DOX@Apt-TDN était également significativement plus élevé que celui du groupe DOX@TDN (par rapport à DOX, **p < 0,05 ; par rapport à la DOX, ***p <0,01 ; par rapport à DOX@Apt-TDN, ^# p <0,05). b Apoptose des cellules U87MG après incubation avec PBS, DOX, le DOX@TDN, et le DOX@Apt-TDN pendant 24h. c Histogrammes de cytométrie en flux du cycle cellulaire U87MG après incubation avec PBS, DOX, le DOX@TDN et le DOX@Apt-TDN pendant 24 h (par rapport au témoin, **p < 0,05 ; par rapport au témoin, ****p <0,01 ; par rapport à DOX@Apt-TDN, ^# p <0,01)

Discussion

Que ce soit via des expériences in vitro ou in vivo, la stabilité d'un médicament et de son vecteur doit être déterminée. Après assemblage du TDN, sa stabilité a d'abord été déterminée in vitro. Cette étude a montré que la structure 3D des nanoparticules d'ADN peut améliorer leur stabilité dans le sérum en inhibant la liaison enzymatique. La sécurité biologique de la nanostructure concernée est l'exigence la plus importante pour son application. Aucune cytotoxicité significative n'a été observée dans les cellules U87MG co-cultivées avec diverses concentrations de TDN pendant 24h ou 48h. Aucune des séquences d'ADN utilisées dans cette étude ne code aucune information génétique, et aucun effet secondaire n'a été signalé dans le test de cytotoxicité. Par conséquent, le TDN peut servir de transporteur de médicament sûr et stable.

L'efficacité de ciblage d'une nanostructure modifiée par un aptamère est cruciale pour l'administration sélective de médicaments aux cellules cancéreuses. Contrairement aux anticorps, les aptamères sont chimiquement stables, peu coûteux et peuvent être produits en masse. De plus, contrairement à d'autres matériaux, les aptamères peuvent facilement lier un tétraèdre d'ADN en utilisant le principe de la complémentarité des bases. Ainsi, la combinaison d'aptamères et de tétraèdres d'ADN jette les bases d'une administration ciblée de médicaments et de traitements de nouvelle génération. Nos résultats ont montré que le TDN pouvait pénétrer dans les cellules sans agents de transfection, ce qui est similaire aux résultats de Walsh et al. et Ma et al. [15, 19]. Par rapport à celle du TDN, l'absorption de l'Apt-TDN par les cellules U87MG a été significativement augmentée. Après l'ajout d'aptamère libre, cette augmentation a disparu. Ce résultat suggère que Gint4.T est un antagoniste spécifique de PDGFRβ [25]. Notre étude a démontré que l'aptamère Gint4.T pouvait cibler les cellules U87MG en raison de la forte expression de PDGGRβ à la surface des cellules de gliome. Camorani et al. [24] ont également montré que l'aptamère Gint4.T pouvait cibler les cellules tumorales en interagissant spécifiquement avec le domaine extracellulaire de PDGFRβ. Les avantages du ciblage de l'aptamère Gint4.T ont été démontrés dans une certaine mesure via des études in vitro, mais des tests in vivo supplémentaires sont nécessaires pour confirmer ces résultats. Cette étude a également confirmé que le DOX@Apt-TDN est plus cytotoxique que le DOX ou le DOX@TDN, ce qui provient probablement de deux facteurs. Premièrement, l'aptamère Gint4.T peut lier spécifiquement les domaines extracellulaires du PDGFR, bloquant la prolifération des cellules tumorales et inhibant la croissance des cellules tumorales [24]. Ceci est cohérent avec nos résultats expérimentaux. Par rapport au groupe témoin, les changements du cycle cellulaire U87MG après traitement avec DOX, DOX@TDN et DOX@Apt-TDN ont augmenté de manière significative dans les cellules tumorales en phase G0/G1, diminué dans les cellules en phase S et bloqué les cellules tumorales à G0. /G1, indiquant qu'ils peuvent inhiber le cycle cellulaire des cellules U87MG et inhiber leur prolifération. Comparé aux groupes DOX et DOX@TDN, le groupe DOX@Apt-TDN avait une capacité significativement plus forte à inhiber la prolifération des cellules U87MG. De plus, Gint4.T se lie spécifiquement aux cellules tumorales et améliore le ciblage cellulaire du complexe DOX@Apt-TDN. Ainsi, nous pouvons augmenter l'efficacité de ciblage des médicaments et réduire la dose d'administration systémique de médicaments antitumoraux pour prévenir leurs effets secondaires systémiques.

Conclusions

La modification avec Gint4.T a augmenté la spécificité et l'efficacité du TDN dans le traitement des gliomes en ciblant le PDGFRβ qui est exprimé en grande quantité sur les cellules de gliome. De plus, lorsqu'il est chargé d'Apt-TDN, il pourrait favoriser de manière significative les effets anti-gliome de la DOX. Par conséquent, DOX@Apt-TDN peut constituer une stratégie thérapeutique prometteuse contre le gliome pour les patients. Le défaut de cette étude est qu'elle n'a été vérifiée qu'in vitro. Dans la dernière étude, nous explorerons davantage dans des modèles animaux.

Disponibilité des données et des matériaux

Les données pertinentes sont incluses dans l'article.

Abréviations

BBB :

Barrière hémato-encéphalique

BTB :

Barrière tumorale sanguine

TDN :

Nanostructures d'ADN tétraédriques/tétraèdres d'ADN

DOX :

Doxorubicine

PDGFRβ :

Récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes β

Apt-TDN :

TDN modifié par Gint4.T

DOX@ TDN :

TDN chargé avec DOX

DOX@Apt-TDN:

Gint4.T-modified TDN loaded with DOX

CNS:

Central nervous system

ANG:

Angiopep-2

LRP-1:

Low-density lipoprotein receptor-related protein 1

SELEX:

Exponential enrichment

PNPs:

Polymeric nanoparticles

GBM:

Glioblastoma

FBS :

Foetal bovine serum

DMEM :

Milieu Eagle modifié de Dulbecco

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

AFM :

Microscopie à force atomique

CCK-8 :

Kit de comptage cellulaire-8

Cy3:

Sulfo-Cyanine3

DAPI :

4′,6-Diamidino-2-phenylindole