Système d'assemblage réversible induit par le pH avec chargement et libération contrôlables par le resvératrol pour une chimiothérapie améliorée ciblant la tumeur

Introduction

Le cancer du poumon est l'une des tumeurs malignes solides les plus mortelles chez l'homme. Avec la détérioration accrue de l'environnement et d'autres facteurs, l'incidence du cancer du poumon a augmenté d'année en année et son taux de survie à 5 ans n'est que de 17,4 % [1, 2]. À l'heure actuelle, bien que les traitements cliniques traditionnels tels que la résection chirurgicale, la radiothérapie et la chimiothérapie standard de première ligne soient disponibles, le taux de survie global médian des patients atteints de cancer du poumon doit encore être amélioré [3, 4]. Par conséquent, des traitements plus efficaces et plus sûrs doivent être développés de toute urgence pour guérir cette maladie mortelle. Actuellement, bien que les effets cibles faibles et les effets secondaires élevés de nombreux médicaments chimiothérapeutiques aient limité leur utilité en chimiothérapie [5, 6], de nouveaux agents chimiothérapeutiques sont constamment développés, en particulier dans le domaine émergent des nano-médicaments [7,8, 9,10]. Le resvératrol (RV) est un extrait de plantes naturelles telles que le raisin et le soja, qui a été largement utilisé en milieu clinique pour favoriser l'agrégation plaquettaire, l'inhibition de la vasodilatation, la réduction de la viscosité sanguine, etc. ]. Ces dernières années, il s'est également avéré avoir un fort effet anticancéreux [16,17,18]. Cependant, en tant que médicament potentiel à petite molécule, le RV présente également certains inconvénients par rapport aux autres médicaments chimiothérapeutiques de première intention, tels qu'une faible solubilité, une courte demi-vie de circulation sanguine et un manque de sélectivité tumorale [19, 20]. Des nano-médicaments à base de RV ont été développés ces dernières années pour surmonter ces lacunes et pour améliorer ses effets thérapeutiques [21]. Divers types de nanosupports ont été utilisés pour charger le RV, notamment des liposomes, de l'albumine sérique, des matériaux carbonés, des dichalcogénures de métaux de transition bidimensionnels (2D-TMD) et autres [21,22,23,24,25]. Bien qu'il ait été rapporté que ces nanosupports améliorent efficacement les effets thérapeutiques du RV, ils présentent encore certaines lacunes, telles qu'une capacité de libération active à haute efficacité pour les liposomes et l'albumine sérique, et une toxicité systémique potentielle à long terme pour les matériaux carbonés et 2D- TMD [26, 27]. Par conséquent, il existe toujours une demande pour des nanotransporteurs plus qualifiés.

La ferritine est une protéine nanocage naturelle avec une lumière d'environ 8 nm, formée par l'interaction et l'assemblage de 24 sous-unités de chaînes lourdes et légères [28, 29]. Parce qu'il s'agit d'une protéine endogène, la ferritine a une excellente biocompatibilité et sécurité. De plus, il existe un rapport selon lequel la ferritine est une protéine naturellement sensible au pH qui peut être dénaturée et réassemblée de manière réversible lorsque son environnement passe d'un état acide à un état alcalin [30]. Lorsque le pH était acide, les oligomères en forme de bâtonnets désassemblés ne recouvraient que la structure en forme de casque et les intermédiaires en forme de casque désassemblés ne recouvraient que la structure sphérique creuse [28,29,30]. Ce comportement unique d'assemblage et de désassemblage déclenché par le pH fait de la ferritine un système d'administration de médicament idéal. Récemment, Zhang et al. ont rapporté que les molécules de doxorubicine (DOX) peuvent être encapsulées dans de la ferritine et libérées avec succès par régulation du pH pour le traitement des tumeurs [28].

Dans cette étude, nous avons cherché à développer un système d'assemblage réversible induit par le pH (PIRAS) à base de ferritine pour contrôler la charge et la libération du VD pour une chimiothérapie améliorée ciblant les tumeurs. La surface de la sphère de ferritine était liée au peptide de ciblage tumoral RGD. Le nano-médicament résultant RV@Ft-RGD s'est avéré stable dans les environnements neutres et alcalins (pH> 7,4) et ne libère du RV que dans les environnements acides (pH <7,4). Une fois caractérisé, le RV@Ft-RGD a montré les avantages suivants in vitro et in vivo :(1) RV@Ft-RGD ciblait les cellules tumorales et s'accumulait dans le lysosome (environnement acide), où il facilitait la libération de plus de RV dans le cytoplasme; (2) le transporteur de ferritine a considérablement amélioré la mi-temps sanguin du RV libre, améliorant la rétention du médicament dans la circulation systémique pour faciliter l'accumulation de médicaments dans les sites tumoraux ; (3) la stabilité architecturale de la ferritine a empêché la fuite par éclatement du VD pendant le processus d'administration ; (4) RV@Ft-RGD a montré une grande biocompatibilité in vitro et in vivo. Par conséquent, en raison de ces mérites, RV@Ft-RGD a affiché de splendides propriétés thérapeutiques antitumorales, qui présentent un grand potentiel pour de futures traductions cliniques.

Matériaux et méthodes

Matériaux

La ferritine, le resvératrol (RV, ≥ 99 %) provenaient de Sigma-Aldrich. Le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), le N-hydroxysuccinimide (NHS) et l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ont été achetés auprès d'Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD (Shanghai, Chine). NH₂ -PEG₂₀₀₀ -RGD a été acheté auprès de Hunan Huateng Pharmaceutical Co., Ltd (Hunan, Chine). Les milieux cellulaires DMEM, le sérum bovin fœtal (FBS) et la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ont été obtenus auprès d'Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Le kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8) a été fourni par Dojindo Laboratories (Japon).

Synthèse de RV@Ft-RGD

Le chargement du VD a été préparé comme décrit dans le rapport précédent [21, 28] avec des modifications. Premièrement, NH₂ -PEG₂₀₀₀ -RGD (10 mg) a été dispersé dans la solution de Ft (1,5 mg/mL) en présence de 20 L d'EDC (5 mg/mL) et de 20 μL de NHS (20 mg/mL). Le mélange a été mis à réagir pendant 2 h à 4°C sous légère agitation, et purifié par dialyse contre de l'eau distillée (PM cut off =5 kDa) pendant une nuit, résultant en des nanoparticules Ft-RGD. Et puis, le RV insoluble dans l'eau a été dissous dans du DMSO à 2 mg/mL et a été ajouté dans la solution de Ft-RGD avec une concentration finale de 1,5 mg/mL. Le pH du mélange a été ajusté à pH =5 pour désassembler les sous-unités polypeptidiques. Ensuite, le pH du mélange a été lentement ajusté à 7,4 avec de l'hydroxyde de sodium (1 M) pour ressembler aux sous-unités polypeptidiques. La solution résultante a été dialysée dans de l'eau distillée pendant une nuit pour éliminer les molécules de RV libres pour être le produit final (RV@Ft-RGD). La quantité de RV chargée a été détectée par spectrophotomètre UV-vis (UV3100, Shimadzu, Japon) en surveillant le pic d'absorption à 306 nm. Le rapport de chargement du VR était (A _un − A _b )/A _c , où A _un , A _b , et A _c représentent respectivement le poids du RV initial déchargé et du Ft-RGD.

Caractérisations

La méthode de diffusion dynamique de la lumière (DLS) (BI-9000AT, Brookhaven, USA) a été utilisée pour détecter la taille et le potentiel zêta des nanoparticules. La morphologie des nanoparticules a été observée au microscope électronique à transmission (TEM, JEM-100S, JEOL, Japon). Les spectres de fluorescence ont été détectés par un spectrophotomètre de luminescence Perkin-Elmer LS50B. Le signal de fluorescence cellulaire a été enregistré par le microscope à balayage laser commercial (LSM 510, Zeiss, Allemagne) et la cytométrie en flux (FCM, EPICS XL, Beckman, États-Unis).

Étude de sortie de VR

Cinq cents microlitres de solution RV@Ft-RGD ont été placés dans un tube D (MWCO 6-8 kDa, Novagen) et la solution a été ajustée à différentes valeurs de pH via différents tampons. La solution a ensuite été dialysée à 37 ^o Après un temps d'incubation différent, des aliquotes de 1 mL de dialysat ont été prélevées et remplacées par 1 mL de milieu frais. Le RV libéré à différents temps d'incubation a été déterminé par un spectrophotomètre UV-vis. De plus, RV@Ft-RGD a été dissous dans une solution de rinçage ayant différentes conditions de pH, notamment pH 5, 6,5, 7,4 et 8,5. Après incubation à 37°C pendant 24h, la taille des nanoparticules a été caractérisée par DLS.

Culture cellulaire

Les cellules de cancer du poumon humain A549 et NCI-H358 ont été obtenues auprès de la Cell Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Chine) et cultivées dans un milieu DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline streptomycine (PS) dans un atmosphère humidifiée contenant 5% de CO₂ à 37 ^o C.

Captation cellulaire et localisation de RV@Ft-RGD

En tant que méthode couramment utilisée, le FITC a été appliqué pour étiqueter les nanoparticules. Le FITC a été dissous dans une solution d'éthanol (2,0 mg/mL) et mélangé avec une solution aqueuse de RV@Ft et RV@Ft-RGD (1,0 mg/mL) sous agitation de 4 h dans un environnement sombre à température ambiante. Le mélange a été dialysé dans de l'eau distillée pendant une nuit pour éliminer le FITC et l'éthanol redondants, résultant en une solution RV@Ft et RV@Ft-RGD marquée par FITC. Pour confirmer la localisation des organites des nanoparticules in vitro, les cellules ont été traitées avec RV@Ft et RV@Ft-RGD marqués FITC pendant 5 h et colorées par le colorant spécifique des lysosomes Lyso Tracker Red (Invitrogen). Par la suite, l'internalisation cellulaire de RV@Ft et RV@Ft-RGD a été observée à l'aide d'un CLSM. En bref, les cellules A549 ont été incubées avec RV@Ft et RV@Ft-RGD marqués FITC (avec la même concentration de FITC) pendant 5 h. Et ensuite, les cellules ont été traitées avec des solutions Lyso Tracker Red (100 nM) à 37°C pendant 30 min. Après trois lavages au PBS, les cellules ont été observées au microscope à balayage laser du commerce. Le logiciel ImageJ a été utilisé pour analyser l'intensité de fluorescence des cellules.

Étude de chimiothérapie tumorale in vitro et d'apoptose

Tout d'abord, la cytotoxicité du support Ft-RGD a été évaluée par un test CCK-8 standard (Bestbio, Chine). Cellules A549 et NCI-H358 (1 × 10 ⁵ cellules/mL, 0,5 mL) ont été ensemencées en plaque 96 puits et cultivées pendant 24 h. Après avoir jeté les anciens supports, des supports frais contenant 0, 0,01, 0,1, 0,5 et 1 mg/mL de Ft-RGD ont été incubés avec des cellules A549 et NCI-H358 pendant 24 h. Les cellules ont été doucement lavées trois fois avec du PBS. Cent microlitres de solution de travail de CCK-8 (10 % de CCK-8 + 90 % de DMEM) ont ensuite été ajoutés à chaque puits et incubés pendant 30 min à 37 °C. Les valeurs d'absorbance à 450 nm ont été mesurées à l'aide d'un spectrophotomètre à microplaque (Multiskan FC, Thermo Scientific). Des photographies de chaque groupe de cellules ont été observées au microscope optique (Olympus).

Diverses concentrations de RV libre, RV@Ft, RV@Ft-RGD et RV@Ft-RGD + RGD (0, 10, 20, 30 et 40 g/mL d'équivalents RV) ont été traitées avec des cellules A549. Après 24 h d'incubation, la viabilité des cellules traitées a été analysée par dosage CCK-8. Pendant ce temps, ces cellules traitées ont été doublement colorées par un kit de détection d'apoptose (Annexin VFITC/PI) et analysées par FCM.

Temps de circulation du RV@Ft-RGD dans le sang

RV libre ou RV@Ft-RGD (6 mg/kg équivalent RV) a été injecté par voie intraveineuse à des souris nudes Balb/c saines (n =5 par groupe). Après l'injection, le sang veineux des souris a été collecté à différents moments et placé dans un tube de prélèvement sanguin contenant de l'héparine, puis le plasma a été séparé. La concentration de RV dans le plasma a été extraite par un réactif isopropanol acidifié, puis son absorbance à 306 nm d'excitation a été mesurée pour déterminer la concentration de RV.

Modèle animal et in vivo Chimiothérapie tumorale

Les souris Balb/c (âgées de 4 à 6 semaines) utilisées dans ce travail ont été achetées auprès de Charles River Laboratories (Pékin, Chine). Toutes les opérations impliquant des expérimentations animales sont strictement conformes aux directives pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. La directive a été approuvée par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Zhengzhou. Pour établir un modèle de tumeur sous-cutanée de A549, 2 × 10 ⁶ Des cellules A549 ont été injectées par voie sous-cutanée dans le dos des souris. Ils ont ensuite été placés dans l'animalerie pendant 7 à 9 jours. La formule de calcul du volume tumoral est la longueur × largeur ² /2.

Les tumeurs A459 porteuses de souris ont été réparties au hasard en cinq groupes. Chaque groupe était composé de cinq souris. Les groupements spécifiques sont contrôle (solution saline), RV, RV @Ft et RV@Ft-RGD. Au début du traitement, l'échantillon a été injecté une fois par jour par la veine caudale pendant trois jours consécutifs. Le volume tumoral et le poids corporel des souris ont été enregistrés tous les 5 jours. Après 45 jours de traitement, les tumeurs de chaque groupe ont été recueillies. Les tissus tumoraux ont été fixés dans une solution de formol à 10 %, sectionnés, puis soumis à une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E).

Biocompatibilité In Vivo

Deux cents microlitres de RV@Ft-RGD ont été injectés à des souris Balb/c saines via la veine caudale (la dose de RV était de 15 mg/kg). Des souris saines injectées de sérum physiologique de la même manière ont été utilisées comme groupe témoin à blanc. Aux jours 0, 10 et 45 après l'injection, du sang de souris a été collecté pour l'évaluation du nombre de cellules, y compris les globules blancs (WBC), les globules rouges (RBC), l'hémoglobine (HGB) et le volume plaquettaire moyen (MPV). , l'hémoglobine moyenne des globules rouges (MCH), l'hématocrite (HCT), la concentration moyenne d'hémoglobine des globules rouges (MCHC), le volume moyen des globules rouges (MCV) et les plaquettes (PLT). De plus, les tissus du cœur, du foie, de la rate, des poumons et des reins de chaque groupe ont été collectés pour la coloration H&E le 45e jour.

Analyse statistique

Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± écart type (s.d.). L'analyse statistique des échantillons a été effectuée à l'aide du t de Student test, et p <0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats et discussion

Synthèse et caractérisations de RV@Ft-RGD

Le chargement et la libération de RV à partir de RV@Ft-RGD ont été effectués via le démontage et le réassemblage réversibles induits par le pH de Ft (Fig. 1). Premièrement, la ferritine a été conjuguée au peptide de ciblage tumoral RGD pour former Ft-RGD. Celui-ci a ensuite été redissous dans un tampon acétate (pH =5) pour désassembler les sous-unités polypeptidiques et former une sphère à pores creux. Les molécules RV ont ensuite été ajoutées et autorisées à entrer dans la cavité, après quoi la solution a été lentement ajustée à un pH 7,4 pour réassembler Ft, piégeant les molécules RV à l'intérieur de la cavité Ft scellée. Lorsque le pH du tampon a ensuite été abaissé à ~ 5, les pores des nanoparticules se sont ouverts de manière réversible et ont libéré leurs molécules RV. Figure 2a et fichier supplémentaire 1 :La figure S1 montre les images SEM et TEM du RV@Ft-RGD assemblé, qui affichait une structure sphérique. Selon l'analyse DLS, les particules RV@Ft-RGD avaient des diamètres plus grands (~ 22,5 nm) par rapport aux nanoparticules Ft brutes (~ 11,8 nm) (Fig. 2b) et avaient des potentiels zêta similaires à ceux des nanoparticules Ft brutes (− 29,6 mV) (Fig. .2c). Après 20 jours, l'indice de polydispersité (PDI) de RV@Ft-RGD dans l'eau, le FBS, les milieux cellulaires et le PBS n'a montré aucun changement significatif (Fig. 2d), indiquant que RV@Ft-RGD avait une stabilité colloïdale remarquable. La figure 2e montre les spectres d'absorbance de RV libre, Ft-RGD et RV@Ft-RGD. Comme on peut le voir, comparé à celui de RV et Ft-RGD, le spectre d'absorption de RV@Ft-RGD présentait un nouveau pic à 306 nm (provenant de RV), indiquant le chargement réussi de RV. De plus, RV@Ft-RGD a montré une fluorescence d'émission significative similaire à celle du RV libre à 400 nm, lorsqu'il est excité par un laser à 325 nm (Fig. 2f).

Une illustration schématique de la préparation RV@Ft-RGD et de la chimiothérapie ciblant la tumeur

un L'image TEM de RV@Ft-RGD. b , c La distribution des tailles et la distribution du potentiel zêta de Ft-RGD et RV@Ft-RGD. d Le changement PDI du RV@Ft-RGD dans l'eau, le FBS, le milieu cellulaire et le PBS sur 20 jours. e Les spectres d'absorbance de RV libre, Ft-RGD et RV@Ft-RGD. f Les spectres d'absorbance de RV libre et RV@Ft-RGD

Chargement et libération du médicament

La capacité de charge maximale du Ft-RGD s'est avérée être de 252,6%, probablement en raison de la grande cavité à l'intérieur du creux Ft-RGD. Comme Ft est sensible au pH, nous avons pu caractériser la capacité de charge du RV dans différentes conditions de pH. Comme le montre la figure 3a, avec l'augmentation du pH de 5,0 à 8,5, l'efficacité de chargement du RV a considérablement diminué. La libération de RV du complexe a également été caractérisée sous différentes valeurs de pH de 5,0 à 8,5. Un profil de libération de RV dépendant de la valeur du pH et du temps a été construit à partir de ces données et est illustré à la figure 3b. Le rapport maximal de libération du médicament (51,6 %) s'est produit à pH =5,0 pendant 24 h, ce qui était supérieur à celui à pH =6,5, 7,4 et 8,5. Selon des rapports connexes, les valeurs de pH de 5,0, 6,5 et 7,4 sont celles typiquement trouvées dans les lysosomes cellulaires, les tissus tumoraux, le sang et l'environnement physiologique normal, respectivement [31]. Dans des conditions physiologiques (pH 7,4), la teneur en médicament RV de RV@Ft-RGD est restée élevée même après 50 h (Fig. 3c), suggérant que le RV dans RV@Ft-RGD est stable et ne s'échappe pas facilement. De plus, nous avons étudié le changement de diamètre de RV @ Ft-RGD dans plusieurs conditions de pH différentes. Après incubation à 37 °C pendant 12 h, l'analyse DLS a montré que le diamètre de RV@ Ft-RGD était presque constant, à environ 23 nm à pH 8,5 et 7,4. Lorsque la valeur du pH est tombée à 6,5 et 5,0, le diamètre de RV @ Ft-RGD a augmenté à 25 nm et 28,6 nm respectivement (Fig. 3d). Ces résultats confirment le comportement du désassemblage et du réassemblage réversibles induits par le pH de RV@Ft-RGD, ce qui est bénéfique pour le chargement contrôlable du médicament in vitro et la libération du médicament dans le tissu tumoral.

un Efficacité de chargement du Ft-RGD dans diverses conditions de pH. b Profil de libération de RV de RV@Ft-RGD dans diverses conditions de pH de 5,0 à 8,5. c Le RV permanent en RV@Ft-RGD en condition physiologique. d Le changement de taille moyen de RV@Ft-RGD dans diverses conditions de pH de 5,0 à 8,5

Captation et localisation cellulaires in vitro

L'absorption cellulaire in vitro et la localisation de RV@Ft-RGD ont ensuite été évaluées. Premièrement, RV@Ft et RV@Ft-RGD ont été marqués par FITC via une interaction de liaison hydrogène et une absorption physique. Comme le montre la figure 4a, les cellules traitées au FITC libres ont montré des signaux de fluorescence cytoplasmique négligeables. Les cellules traitées par RV@Ft-RGD, en revanche, présentaient une fluorescence verte FITC intense, supérieure à celle des cellules traitées par RV@Ft. Notamment, les cellules traitées par RV@Ft-RGD et prétraitées par RGD ont toutes deux montré une faible fluorescence verte. À partir de ces résultats, nous pouvons conclure que RV@Ft-RGD a été absorbé par les cellules en grande quantité, probablement par le biais d'un effet cible actif médié par RGD. Ces cellules traitées ont également été analysées par FCM, dont les résultats sont présentés sur la figure 4b. Les résultats statistiques d'intensité de fluorescence cellulaire suggèrent une conclusion similaire.

un Images de fluorescence des cellules A549 après incubation avec FITC libre et FITC marqué RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD et RV@Ft-RGD, respectivement. Barre d'échelle =60 m. b Mesure FCM des intensités de fluorescence FITC cellulaires dans les cellules A549 après incubation avec FITC libre et FITC marqués RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD et RV@Ft-RGD, respectivement. c Coefficient de co-localisation de la fluorescence cellulaire du FITC et du Lyso Tracker Red. **P <0,01, par rapport aux autres groupes, respectivement

Pour étudier la localisation des organites de RV@Ft-RGD, un colorant spécifique aux lysosomes (Lyso Tracker Red) a été utilisé pour colorer les cellules incubées avec les nanoparticules. Comme on peut le voir sur la figure 4a, le cytoplasme a montré une forte fluorescence rouge dans tous les groupes. Après fusion avec la fluorescence verte FITC, RV@Ft-RGD a montré une fluorescence jaune (vert + rouge) la plus intense dans le cytoplasme parmi ces groupes. Sur la base d'une analyse statistique, le groupe traité par RV@Ft-RGD présentait le coefficient de colocalisation le plus élevé entre le FITC et la fluorescence Lyso Tracker Red (Fig. 4c). Ces résultats indiquent que RV@Ft-RGD peut entrer activement dans les cellules puis être transféré dans l'environnement acide du lysosome (pH 5,0). Ces avantages, ainsi que la libération de médicament sensible au pH, confèrent à RV@Ft-RGD de nombreuses applications potentielles pour la thérapie tumorale in vivo.

Biocompatibilité in vitro et thérapie tumorale

Avant d'étudier les propriétés antitumorales de RV@Ft-RGD, la cytotoxicité du transporteur Ft-RGD a été étudiée. Comme le montrent la figure 5a et le fichier supplémentaire 1 :les figures S2 et S3, Ft-RGD n'ont montré aucune suppression évidente de la viabilité des cellules A549 du cancer du poumon et des cellules NCI-H358 à des concentrations allant jusqu'à 1 mg/mL. La morphologie cellulaire n'a également présenté aucun changement significatif lorsque les cellules traitées à 1 mg/mL ont été comparées aux groupes témoins (Fig. 5b), suggérant clairement que Ft-RGD en tant que support avait une excellente biocompatibilité. Comme le montrent les figures 6a, b, le RV libre, le RV@Ft et le RV@Ft-RGD tuent tous les cellules d'une manière dépendante de la concentration. Les cellules traitées par RV@Ft-RGD présentaient une diminution de viabilité plus importante et n'avaient une viabilité cellulaire que de 11,2 % dans les groupes de 40 g/mL, ce qui était inférieur aux groupes prétraités RV@Ft et RV@Ft-RGD + RGD. Une étude préliminaire avec le FCM a en outre révélé qu'avec RV seul, RV@Ft ou RV@Ft-RGD, la majorité des morts cellulaires était médiée par l'apoptose (Fig. 6c). Ces résultats démontrent que l'effet de destruction des cellules tumorales du RV a été grandement amélioré par le chargement dans Ft-RGD, principalement en raison de l'accumulation accrue de RV@Ft-RGD dans le lysosome, où un pH acide a déclenché une libération accrue de RV favorisant l'apoptose. dans le cytoplasme [32, 33].

un Cytotoxicité in vitro contre les cellules A549 traitées avec différentes concentrations de Ft-RGD pendant 24 h. b L'image au microscope des cellules A549 après 24 h de traitement avec 1 mg/mL de Ft-RGD

un Viabilité cellulaire de différentes concentrations de cellules A549 traitées par RV. b Viabilité cellulaire des cellules traitées avec RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD et RV@Ft-RGD avec diverses concentrations de RV. c Apoptose cellulaire des cellules A549 traitées avec du PBS (contrôle), RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD et RV@Ft-RGD par cytométrie en flux. **P <0,01, par rapport aux autres groupes, respectivement

Demi-vie sanguine de RV@Ft-RGD

La concentration de RV dans le plasma sanguin à différents moments après l'injection a été étudiée dans les groupes traités par RV libre et RV@Ft-RGD, respectivement. Comme le montre la figure 7a, la demi-vie sanguine de RV@Ft-RGD était de 5,1 ± 0,23 h. Le RV libre a été éliminé plus rapidement de la circulation, avec une demi-vie sanguine de seulement 0,43 ± 0,11 h. La demi-vie considérablement prolongée de RV@Ft-RGD dans le sang est bénéfique pour améliorer la rétention des médicaments dans la circulation systémique et facilite l'accumulation de médicaments sur les sites tumoraux.

un Temps de circulation du RV libre et du RV@Ft-RGD dans le sang. b Le profil de croissance des tumeurs xénogreffées A549 après trois injections intraveineuses de sérum physiologique (témoin), RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD et RV@Ft-RGD. La flèche rouge indique le moment de l'injection. **P <0,01, par rapport aux autres groupes, respectivement. c Poids corporel de souris porteuses de tumeurs après divers traitements. d Micrographies de tranches de tumeur colorées par H&E recueillies auprès de différents groupes de souris après la fin du traitement. Les barres d'échelle mesurent 50 m

Effet antitumoral in vivo et toxicité systémique du RV@Ft-RGD

La figure 7b montre le profil de croissance tumorale de souris porteuses de tumeurs avec un traitement différent, qui a été exprimé en volume tumoral relatif. La croissance tumorale a été inhibée dans une certaine mesure lorsqu'elle est traitée avec RV@Ft, probablement en raison de la faible absorption de RV@Ft. Cependant, dans le groupe traité avec RV@Ft-RGD, la croissance tumorale a été significativement supprimée par rapport aux autres groupes (contrôle, RV, RV@Ft et RV@Ft-RGD + RGD). Au cours du traitement, il n'y a eu aucune perte notable de poids corporel dans aucun groupe expérimental (Fig. 7c), indiquant la haute sécurité biologique de RV@Ft-RGD. Après la fin du traitement, une coloration H&E du tissu tumoral dans ces groupes a été réalisée pour étudier les effets chimiothérapeutiques. Comme le montre la figure 7d, une grande zone d'apoptose a été observée dans les tumeurs traitées avec RV@Ft-RGD, ce qui est en contraste significatif avec seulement une petite zone d'apoptose dans les tumeurs traitées avec RV libre, RV@Ft et RV@ Ft-RGD + RGD. De plus, la toxicité systémique de RV@Ft-RGD a également été évaluée chez des souris normales. Des échantillons de sang total de souris saines traitées avec une solution saline et RV@Ft-RGD ont été prélevés à 0, 10 et 45 jours après l'injection pour une analyse sanguine. Comme le montrent les figures 8a, b, les numérations globulaires complètes (WBC, RBC, HGB, MPV, MCH, HCT, MCV, PLT et MCHC) des souris injectées par RV@Ft-RGD n'ont montré aucune différence significative de 0 jour à 45 jours. Les principaux organes de souris saines traitées avec une solution saline et RV@Ft-RGD ont également été collectés à 45 jours pour la coloration H&E. Aucun effet secondaire évident n'a été trouvé dans ces tissus (Fig. 8c), suggérant une toxicité indésirable à long terme négligeable. Tous ces résultats démontrent le potentiel prometteur de RV@Ft-RGD pour une chimiothérapie anticancéreuse améliorée in vivo.

un Analyse sanguine de souris saines traitées avec RV@Ft-RGD pendant 45 jours. b Images des principaux organes colorés par H&E de souris saines traitées avec RV@Ft-RGD pendant 45 jours. c La coloration HE reproduit les principaux organes des groupes témoins et traités par RV@Ft-RGD. Les barres d'échelle mesurent 50 m

Conclusion

En résumé, nous avons développé avec succès un système d'assemblage réversible induit par le pH (PIRAS) avec une charge et une libération contrôlables par le pH du médicament antitumoral RV pour une chimiothérapie améliorée ciblant la tumeur. Dans des conditions acides (pH =5,0), le système peut se démonter et charger ou libérer RV, tandis qu'en conditions neutres (pH =7,4), RV@Ft-RGD est très stable et présente une fuite de médicament négligeable. Grâce à l'effet cible médié par RGD, RV@Ft-RGD peut être absorbé à des concentrations élevées par les cellules A549 et s'accumuler dans le lysosome, ce qui est bénéfique pour la libération de RV à la fois in vitro et in vivo. En raison de l'accumulation de RV@Ft-RGD dans le lysosome et de la libération de RV déclenchée par le pH du lysosome acide dans le cytoplasme, RV@Ft-RGD a montré d'excellents effets de destruction des cellules tumorales et de promotion de l'apoptose par rapport au RV libre. De plus, après le chargement de RV dans Ft-RGD, RV@Ft-RGD a montré une demi-temps de sang beaucoup plus longue que celle de RV libre. Les résultats in vivo démontrent que RV@Ft-RGD montre une suppression tumorale remarquable et aucune toxicité systémique notable. Cette étude suggère que PIRAS basé sur Ft est très efficace dans le chargement et la libération de médicaments pour une thérapie anticancéreuse améliorée.

Disponibilité des données et des matériaux

Les conclusions tirées dans ce manuscrit sont basées sur les données qui sont toutes présentées et montrées dans cet article.

Abréviations

BSA :

Sérum albumine bovine

CCK-8 :

Kit de comptage cellulaire-8

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

EDC :

1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide

FBS :

Sérum fœtal bovin

FITC :

Isothiocyanate de fluorescéine

Ft :

Ferritine

HCT :

Hématocrite

HGB :

Hémoglobine

MCH :

Hémoglobine corpusculaire moyenne

CMHC :

Concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine

MCV :

Volume corpusculaire moyen

MPV :

Volume plaquettaire moyen

NHS :

N-hydroxysuccinimide

PIRAS :

Système d'assemblage réversible induit par le pH

PLT :

Plaquette

RBC :

Globules rouges

RGD :

Arg-Gly-Asp

RV :

Resvératrol

WBC :

Globule blanc