Amélioration de la magnétofection de nanoparticules magnétiques de polyéthylèneimine dans les ostéoblastes MG-63 à l'aide d'un nouveau champ magnétique uniforme

Contexte

L'ostéosarcome est la tumeur osseuse maligne la plus fréquente qui touche principalement les enfants et les adolescents. Parce que les thérapies conventionnelles offrent une amélioration limitée, une nouvelle stratégie pour son traitement est impérative [1,2,3]. L'avènement de la thérapie génique a incité les chercheurs à évaluer ses applications dans l'ostéosarcome [4,5,6]. Un système de délivrance de gènes sûr et efficace est essentiel à la thérapie génique. Les systèmes de délivrance de gènes peuvent être divisés en systèmes de délivrance de gènes viraux et systèmes de délivrance de gènes non viraux. Il a été démontré que les systèmes de délivrance de gènes viraux ont une efficacité de transfection élevée dans une variété de cellules primaires et de lignées cellulaires. Les systèmes de délivrance de gènes viraux sont fortement associés à des problèmes de sécurité tels que le déclenchement de réponses inflammatoires et de mutations génétiques [7], incitant les chercheurs à détourner leurs études vers des systèmes de délivrance de gènes non viraux. Cependant, la plupart des techniques de transfection de gènes non viraux n'ont pas été particulièrement efficaces pour transfecter des lignées cellulaires d'ostéosarcome [8, 9].

Au cours de la dernière décennie, diverses méthodes physiques telles que les canons à gènes [10], les ultrasons [11] et l'électroporation [12] ont été efficacement utilisées pour améliorer la transfection. Cependant, ces méthodes physiques induisent également des dommages cellulaires [13]. Étant donné que les champs magnétiques ne causent généralement pas de dommages cellulaires, la technologie de transfection assistée magnétique a attiré l'attention des chercheurs. Mah et al. introduit des nanoparticules magnétiques dans des expériences de transfection de gènes en liant des virus adéno-associés recombinants (rAAV) porteurs de protéines fluorescentes vertes (GFP) à des nanoparticules magnétiques pour obtenir une transfection améliorée spécifique à la cible à la fois in vitro et in vivo. Par rapport aux adénovirus purs, les nanoparticules d'adénovirus magnétiques peuvent réduire le dosage des rAAV porteurs de GFP à 1% dans les mêmes conditions de taux de transfection [14]. Scherer et al. a inventé le terme « magnétofection » pour désigner la transfection à médiation magnétique utilisant des particules magnétiques [15]. Par la suite, Plank et al. ont décrit la technique de transfection magnétique utilisant des vecteurs non viraux [16]. Pour améliorer encore l'efficacité de la magnétofection des vecteurs non viraux, Fouriki et al. ajusté la fréquence et l'amplitude d'un champ magnétique oscillant pour induire un effet de stimulation mécanique dynamique sur les nanoparticules magnétiques, augmentant ainsi la probabilité d'entrer en contact avec les cellules cibles [17]. Oral et al. une efficacité de transfection encore améliorée et une cytotoxicité réduite des porteurs de gènes en faisant tourner en sens inverse l'arbre hexagonal de l'aimant pour contrôler la vitesse et la direction du champ magnétique [18]. Dans une autre étude, Vainauska et al. a utilisé un champ magnétique à gradient dynamique généré par la rotation d'un aimant permanent cylindrique pour cibler l'administration de porteurs de gènes magnétiques [19].

L'efficacité de la magnétofection s'est considérablement améliorée à mesure que les champs magnétiques sont passés de statiques et uniques à dynamiques et sophistiqués. Cependant, les études portant sur l'uniformité et la portée effective du champ magnétique sont limitées. À notre connaissance, la plupart des dispositifs magnétiques ne peuvent pas former de champs magnétiques uniformes dans un espace tridimensionnel particulier, ce qui entraîne une distribution hétérogène des nanoparticules magnétiques, n'atteignant qu'une efficacité de transfection locale du champ magnétique et ne résolvant pas les cytotoxicités qui en résultent. Un champ magnétique non uniforme entrave également les comparaisons de réactifs de transfection magnétique et diminue l'efficacité de la transfection.

Pour résoudre ces problèmes, notre groupe de recherche en collaboration avec le Collège d'ingénierie électrique de l'Université de Chongqing a développé un nouveau générateur de champ magnétique [20, 21]. Le générateur de champ magnétique peut former un champ magnétique uniforme à une certaine hauteur, et les nanoparticules magnétiques ajoutées sont rapidement et uniformément réparties au fond de la plaque de culture. Le champ magnétique uniforme est non seulement pratique pour les études comparatives sur la relation entre la dose et l'efficacité de transfection de divers réactifs de transfection, mais peut également être utilisé pour évaluer l'absorption cellulaire de nanoparticules magnétiques.

Dans la conception actuelle, nous avons cherché à établir un système de livraison de gènes non viral fiable avec une efficacité de magnétofection élevée dans les lignées cellulaires d'ostéosarcome. La polyéthylèneimine linéaire Mw20000 (PEI-20000) a été sélectionnée pour la préparation de nanoparticules magnétiques, car plusieurs études antérieures ont confirmé que les systèmes de délivrance linéaire de PEI ont une meilleure efficacité de transfection que les systèmes de délivrance de PEI ramifié in vivo [22, 23]. Les propriétés des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques modifiées par la polyéthylèneimine (PEI-SPIO-NPs) ont été évaluées. Un nouveau générateur de champ magnétique a été développé pour former un champ magnétique uniforme, qui a été utilisé pour transfecter des complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA dans des lignées cellulaires d'ostéosarcome MG-63. Les effets de différents champs magnétiques sur la magnétofection ont été étudiés systématiquement.

Méthodes

Matériaux et réactifs

Les nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques (SPIO-NP), le chlorhydrate de polyéthylèneimine (PEI) et Hoechst-33,324 ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, USA). Le PolyMag-200 (réactif de magnétofection commercial) a été obtenu auprès de Beijing Chief-East Tech Co., Ltd. (Qwbio) (Pékin, Chine). 1-éthyl-3-[3-(diméthylamino)propyl] carbodiimide (EDC) et N -hydroxy succinimide (NHS) ont été achetés auprès de Chengdu Xiya Reagent Co. (Sichuan, Chine). Les plaques magnétiques de culture cellulaire PolyMag-200 et 96 puits ont été achetées auprès de Chemicell GmbH (Berlin, Allemagne). Le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et la pénicilline-streptomycine et le sérum bovin fœtal (FBS) ont été obtenus auprès d'Invitrogen-Gibco (CA, USA). L'isothiocyanate de rhodamine B a été obtenu auprès d'Aladdin Ind., Co. (Shanghai, Chine). LysoTracker Green DND-26 a été obtenu auprès de Shanghai Wei Jin Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Le kit de test CCK-8 a été obtenu auprès de Seven Seas Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, Chine), et le Maxi Kit-25 de Plasmide sans Endo a été acheté auprès d'OMEGA (GA, USA). Une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et d'autres réactifs ont été préparés dans notre laboratoire. Tous les solvants et produits chimiques étaient de qualité analytique.

Synthèse des PEI-SPIO-NPs

Les PEI-SPIO-NPs ont été préparés comme décrit précédemment [24]. En bref, 0,1 g d'EDC et 0,5 g de NHS ont été ajoutés à 15 mL de solution aqueuse de SPIO-NPs modifiée par carboxyle (5 mg/mL, pH ajusté à 5), et la solution a été agitée pendant 4 à 6 h à température ambiante pour activer le carboxyle de nanoparticules d'oxyde de fer. Ensuite, le même volume de solution aqueuse de chlorhydrate de polyéthylèneimine (20 mg/mL) a été ajouté pour réagir pendant plusieurs heures. La solution de PEI-SPIO-NPs conjuguée résultante a été dialysée à l'aide d'une membrane de dialyse (MWCO 20 000) immergée dans de l'eau distillée pendant 2 jours pour éliminer toutes les molécules et intermédiaires de PEI non conjugués. Une aliquote de la solution de nanoparticules a été lyophilisée et stockée.

Synthèse et caractérisation des complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA

La synthèse de PEI-SPIO-NPs était comme décrit ci-dessus, PEI-SPIO-NPs et ADN plasmidique (pDNA) ont été préchauffés séparément pendant 10 min à 37 °C, puis mélangés ensemble à différents rapports N/P pour préparer le Complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp. La morphologie des complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA a été mesurée par microscopie électronique à transmission (TEM, CM100, Philips, Pays-Bas), et le diamètre hydrodynamique a été mesuré par diffusion dynamique de la lumière (DLS, Nicomp 380, PSS, FL, USA) . Leurs propriétés magnétiques de SPION et PEI-SPIO-NPs ont été examinées avec un magnétomètre d'échantillon vibrant EV-11 (PPMS-9, Quantum Design, San Carlos, CA, USA) à 300 K. Les mesures ont été normalisées au poids de fer dans chaque échantillon, et les mesures ont été vérifiées à l'aide d'un spectromètre d'émission optique à plasma à couplage inductif (ICP-OES).

Les charges de surface ont été mesurées en déterminant le potentiel zêta en utilisant l'instrument de diffusion dynamique de la lumière (Malvern, Southborough, MA, USA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH =7,4). Les complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA ont été préparés à divers rapports molaires N/P allant de 2,5 à 25 en ajoutant la solution PEI-SPIO-NPs à la solution de pDNA, et la concentration finale en pDNA a été ajustée à 30 μg/mL.

Les composants des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp ont été détectés à l'aide d'un microscope à force atomique (IPC-208B, Université de Chongqing, Chongqing, Chine). Un petit métal floconneux qui a été utilisé comme support pour l'observation a été lavé avec de l'acétone et séché. Ensuite, quelques gouttes de l'échantillon de sonde antisens ont été placées sur le métal et séchées à l'air. La morphologie de surface de l'échantillon a été observée dans une zone de balayage à grande échelle de 700 nm × 700 nm et 1000 × 1000 pixels. La structure moléculaire et la microstructure de l'échantillon ont été observées dans une zone de balayage à petite échelle de 9 nm × 9 nm et 800 × 800 pixels. Les données de l'image originale ont été transmises à un ordinateur et une reconstruction 3D a été réalisée avec le logiciel G2DR [25]. Les mesures ont été répétées trois fois pour chaque groupe.

La mobilité de l'ADNp après liaison avec les PEI-SPIO-NPs a été analysée par électrophorèse sur gel. Les rapports N/P de PEI-SPIO-NPs/pDNA étaient de 1/5, 1, 5, 10, 15, 20, 25 et 30, la teneur en ADN étant maintenue à 3 μg. Après 15 minutes d'incubation à 37 °C, 10 μL de solution de mélange ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % (90 V, 30 min). L'ADNp nu a été utilisé comme contrôle.

Les effets de PEI-SPIO-NPs sur la protection de l'ADNp contre la DNase I ont été évalués. Les complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp à divers rapports N/P et l'ADNp nu (3 μg) ont été incubés à 37 °C dans un CO₂ à 5 % environnement subhumide pendant 30 min avec DNase I (4 U) dans DNase/Mg ²⁺ tampon de digestion composé de 50 mM de Tris-HCl (pH=7,6) et 10 mM de MgCl₂ . La DNase I a ensuite été inactivée en ajoutant une solution d'EDTA (pH =8,0) jusqu'à ce que la concentration finale soit de 2,5 mM. L'échantillon a ensuite été incubé pendant 15 min à 65 °C, et 10 μL de 1 mg/mL d'héparine de sodium ont été ajoutés pour libérer l'ADNp des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp [26]. L'intégrité de l'ADNp a été évaluée par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % (90 V, 30 min).

Champ magnétique

Le nouveau générateur de champ magnétique (Fig. 4) a été développé par notre groupe en collaboration avec le Collège d'ingénierie électrique de l'Université de Chongqing [20, 21]. Nous avons utilisé l'image CAO 3D pour montrer la disposition des aimants du champ magnétique uniforme. La distribution du plan XOY et la distribution 3D du champ magnétique dans la région d'intérêt ont été affichées. La distribution des PEI-SPION-NPs dans différents champs magnétiques a été observée, et un champ magnétique non uniforme (plaque permanente Nd-Fe-B à 96 puits) a été utilisé comme contrôle.

Culture cellulaire

La lignée cellulaire d'ostéosarcome humain MG-63 (à l'origine de l'American Type Culture Collection) a été obtenue auprès du Chongqing Engineering Research Center of Stem Cell Therapy (Chongqing, Chine). Les cellules ont été maintenues dans du DMEM additionné de 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 mg/mL de streptomycine et incubées à 37 °C avec 5 % de CO₂ et 95% d'humidité relative.

Cytotoxicité in vitro

Les effets cytotoxiques in vitro de différentes nanoparticules avec ou sans ADNp et des nanoparticules magnétisées ou non sur les cellules d'ostéosarcome MG-63 ont été déterminés à l'aide du kit de test CCK-8. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques de culture 96 puits à une densité de 4 × 10 ³ cellules par puits, et différentes nanoparticules ont été ajoutées et incubées pendant 24, 48, 72 et 96 h. Une solution de CCK-8 (10 % du volume du milieu de culture) a été ajoutée à chaque puits à des moments prédéfinis et les cellules ont été cultivées pendant 2 h supplémentaires. La densité optique des cellules a été évaluée à l'aide d'un lecteur de microplaques à fluorescence à une longueur d'onde de 450 nm, la valeur d'absorbance reflétant la viabilité cellulaire élevée ; l'observation d'une viabilité élevée indique que les nanoparticules induisent de faibles effets cytotoxiques. PolyMag-200/pDNA et PolyMag-200 ont été utilisés comme contrôle positif. Pour étudier les effets de toxicité de différents champs magnétiques sur les cellules, nous avons sélectionné les PEI-SPIO-NPs (sans ADNp) comme vecteurs de gènes, et la densité optique des cellules intervenues avec différents champs magnétiques à différents moments a été étudiée.

Analyse en microscopie confocale

L'absorption de complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp ou de nanoparticules de polyéthylèneimine (PEI-NPs) a été observée par microscopie confocale à balayage laser. Des cellules d'ostéosarcome MG-63 ont été ensemencées dans des boîtes en verre de 24 mm à une densité de 3 × 10 ⁵ par puits. Des complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA (3 μg) marqués à l'isothiocyanate de rhodamine B (RBITC) ont été ajoutés aux cellules et incubés pendant 30 min sous l'action d'un champ magnétique uniforme ou d'un champ magnétique non uniforme ; Des complexes PEI-NPs/ADNp marqués au RBITC ont été ajoutés aux cellules sans l'intervention d'un champ magnétique. Les cellules ont ensuite été immédiatement lavées deux fois avec du PBS (0,01 M) pour éliminer tous les complexes libres PEI-SPIO-NPs/pDNA marqués au RBITC ou les complexes PEI-NPs/pDNA marqués au RBITC, et les cellules traitées ont été incubées pendant 6 à 24 h. . Le milieu a été retiré 6, 12 et 24 h après la transfection, et les noyaux cellulaires ont été colorés avec Hoechst 33342 pendant 5  min. Après élimination du résidu Hoechst 33342, les cellules ont été incubées dans un milieu préchauffé contenant 0,5 mM de LysoTracker Green DND-26 pendant 1 h, puis lavées deux fois avec du PBS préchauffé. Les cellules ont été imagées sous une microscopie confocale à balayage laser (LSM 700, Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne) avec un objectif × 40 pour visualiser les fluorochromes avec les longueurs d'onde d'excitation (Ex) et d'émission (Em) suivantes [GFP (Ex :488 nm; Em :530 nm), Hoechst (Ex :350 nm ; Em :460 nm), LysoTracker Green (Ex :443 nm ; Em :505 nm) et RBITC (Ex :554 nm; Em :576 nm)] [27 ].

Analyse de cytométrie en flux

Les cellules MG-63 ont été ensemencées dans des plaques 12 puits (1 × 10 ⁵ cellules par puits) pendant 24 h, après quoi elles ont été rincées deux fois avec du PBS et pré-incubées pendant 1 h avec 0,8 mL de milieu Opti-MEM à 37 °C avant la transfection. Les complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA (N/P = 10) ou les complexes PEI-NPs/pDNA (N/P = 10) contenant 3 μg d'ADNp ont été ajoutés dans chaque puits, et les plaques de culture cellulaire ont été placées dans l'uniforme ou champ magnétique non uniforme pendant 20 min. PolyMag-200/pDNA a été utilisé comme témoins positifs. Après 4 h, les cellules ont été rincées trois fois avec 1 mL de PBS (0,01 M) pour éliminer tous les complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA libres ou les complexes PEI-NPs/pDNA, et les cellules ont été cultivées pendant encore 24 h. Après incubation, les cellules ont été collectées et évaluées pour l'efficacité de la transfection par cytométrie en flux (BD FACS Canto II, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), cette partie de l'expérience a été répétée trois fois.

Analyse statistique

Les données quantitatives ont été obtenues en triple (n = 5) et exprimé comme la moyenne  ± déviation standard. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de l'ANOVA à un facteur pour des comparaisons multiples et du t de Student. test de comparaison intergroupe. Un P la valeur < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats et discussion

Principe de magnétofection

La magnétofection est définie comme des vecteurs associés à des nanoparticules superparamagnétiques et qui s'accumulent sur les cellules cibles par l'application de champs de gradient magnétique [15]. La figure 1 présente les composants et la morphologie des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp et le principe principal de la magnétofection. Une accumulation lente de vecteurs et, par conséquent, une faible concentration de vecteurs dans les tissus cibles ont été identifiées comme des barrières simples mais fortes à une délivrance efficace des gènes [28]. Le principal mécanisme d'amélioration de l'efficacité de la magnétofection semble être la sédimentation rapide de la dose complète du vecteur sur les cellules cibles, de sorte que jusqu'à 100 % de ces cellules auront des particules vectorielles liées à leur surface en quelques minutes. Ainsi, la magnétofection est un outil approprié pour surmonter la forte barrière de l'accumulation lente de vecteurs et, par conséquent, la faible concentration de vecteurs dans les tissus cibles. PEI-SPIO-NPs/pDNA se complexe de manière aléatoire, et son dépôt dans les cellules ciblées est limité et prend du temps en l'absence de champ magnétique. Néanmoins, le complexe PEI-SPIO-NPs/pDNA peut toucher largement et uniformément les cellules ciblées dans un laps de temps relativement court en présence d'un champ magnétique, ce qui peut augmenter le risque d'absorption endocytaire dans la zone unitaire des cellules, de manière à améliorer le taux d'utilisation du complexe PEI-SPIO-NPs/pDNA et améliorer l'efficacité de la transfection.

Présentation de la magnétofection à l'aide du complexe PEI-SPIO-NPs/pDNA. La polyéthylèneimine doublée (LPEI) et les nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétique (SPIO-NPs) sont associées par la réaction de condensation de déshydratation. À cette fin, les SPIO-NP ont été recouverts de LPEI, c'est-à-dire que le LPEI est étroitement lié à la surface des SPIO-NP et ils forment ensemble les PEI-SPIO-NP. Si les PEI-SPIO-NPs sont mélangés avec de l'ADNp nu, l'ADNp chargé négativement se lie aux PEI-SPIO-NPs chargés positivement par adsorption électrostatique. Les cellules sont incubées avec les complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp en présence d'un champ magnétique qui attire les complexes vers les cellules. Le résultat de la magnétofection est que pratiquement toutes les cellules entrent en contact avec des vecteurs et qu'un pourcentage élevé de cellules est rapidement transfecté

Caractérisation des complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA

La figure 2a montre que les PEI-SPIO-NPs sont à peu près sphériques et que les complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA apparaissent agrégés, tous deux ayant une dispersibilité favorable, et l'attraction entre les charges positives et négatives rend les complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA capables d'acquérir une petite taille. La boucle d'hystérésis des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp est illustrée à la figure 2b. Le pourcentage en poids d'oxyde de fer dans les PEI-SPION-NPs mesuré par un spectromètre d'absorption atomique est de 20,33 (± 2,87) %. L'aimantation à saturation des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp était de 21,5 (± 1,6) emu/g de fer. Malgré les propriétés magnétiques réduites par rapport à celles des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques non modifiées, les complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp ont présenté une excellente réactivité magnétique, ce qui est nécessaire pour une magnétofection à haute efficacité.

Caractéristiques des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp. un MET des complexes PEI-SPIO-NPs et PEI-SPIO-NPs/ADNp. b Boucles d'hystérésis des complexes SPIO-NPs et PEI-SPIO-NPs/ADNp. c Potentiel zêta et diamètre hydrodynamique des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp à divers rapports N/P. d Image AFM en niveaux de gris et structure moléculaire des complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA. Les points rouges représentent l'emplacement du groupe chimique SPIO, les points verts indiquent les atomes d'azote, les points jaunes signifient les atomes de carbone et l'atome de phosphore est représenté par un point noir en cercle blanc. e (a) Distribution de la taille des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp et e (b) potentiel zêta des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp tel que mesuré par un instrument de diffusion dynamique de la lumière Malvern Zetasizer. Les résultats sont exprimés en moyenne  ± SD (n = 5)

Le diamètre hydrodynamique et le potentiel zêta ont été considérés comme les paramètres indispensables des porteurs de gènes. La figure 2c montre que le diamètre hydrodynamique des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp était de 200 (± 21,7) nm avec un rapport N/P (NH₂ —groupe à l'Î.-P.-É./PO₄ —groupe dans l'ADNp) de 2,5 et 175 (± 16,4) nm lorsque le rapport N/P était de 5, indiquant que le changement rapide de taille s'est produit pendant la transition du potentiel de négatif à positif. Par la suite, les forces de répulsion entre les complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA ont augmenté avec des rapports N/P plus élevés, indiquant que la taille des nanoparticules avait augmenté.

Nous avons analysé les types de liaisons chimiques en fonction de la disposition des atomes et spéculé sur la structure moléculaire des complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA. La structure moléculaire des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp a été indirectement divulguée par microscopie à force atomique (AFM, Fig. 2d), qui a montré que les groupes carboxyle des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques se combinaient avec l'amine primaire de PEI par la liaison amide. De plus, l'ADNp a été enveloppé dans une chaîne moléculaire de PEI via une liaison électrostatique entre les groupes phosphate de la chaîne nucléotidique et les groupes amine de PEI, formant des complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA. Dans l'image en niveaux de gris AFM, le point rouge représente l'emplacement des atomes de fer, le point vert indique les atomes d'azote, les points jaunes signifient les atomes de carbone et l'atome de phosphore est représenté par un cercle blanc avec un point noir.

Comme le montre la figure 2e, le potentiel des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp a été détecté à l'aide de l'instrument de diffusion dynamique de la lumière. À pH =7, le potentiel des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques (SPIO-NP) était de − 6,6 (± 1,1) mV, ce qui indiquait la présence de groupes carboxyliques à leur surface. Le potentiel de PEI-SPIO-NPs était de + 18,2 (± 1,5) mV. Le potentiel de PEI modifié avec des SPIO-NPs a été transformé en une surface chargée positivement, qui pourrait être utilisée comme porteur de gène qui se combine avec l'ADNp chargé négativement. Nous avons évalué le changement des charges de surface des complexes PEI-SPIO-NPs/pDNA à différents rapports N/P. Les complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp ont montré une charge de surface négative même à un faible rapport N/P de 2,5, qui s'est progressivement traduite en une charge de surface positive à mesure que le rapport N/P augmentait à 5. Cette augmentation des rapports N/P dans les complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp a entraîné une augmentation de la charge de surface positive des polyplexes. À un rapport N/P de 10, le potentiel des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp (N/P = 10) était de + 11,9 (± 1,2) mV, et la charge de surface a atteint un plateau. Les complexes chargés positivement sont entrés en contact avec la membrane cellulaire chargée négativement et ont permis l'absorption cellulaire des nanoparticules complexées [29]. Les PEI-SPIO-NP peuvent non seulement être utilisés comme porteurs de gènes d'ADNp chargé négativement, mais contribuent également à un certain niveau de magnétisme pour l'administration ciblée de médicaments et deviennent l'agent de contraste utilisé pour l'imagerie de contraste par résonance magnétique (IRM) [30, 31] .

Une exigence fondamentale des porteurs de gènes est que le porteur de transfection doit former efficacement un complexe stable avec les acides nucléiques. Pour évaluer sa capacité de liaison, des volumes similaires de solution de PEI-SPIO-NPs et de solution d'ADNp ont été mélangés à différents rapports N/P et vortexés. Une aliquote de 10 μL du mélange a ensuite été analysée par électrophorèse sur gel d'agarose (Fig. 3a). Contrairement à l'ADNp nu, la migration du plasmide a été complètement bloquée à un rapport N/P de 5, indiquant que les PEI-SPIO-NPs ont entièrement concentré l'ADNp [32].

Le test de liaison à l'ADNp et le test de protection de l'ADNp des PEI-SPIO-NP. un Électrophorèse sur gel d'agarose des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp à divers rapports N/P. b Analyse de mobilité électrophorétique de PEI-SPIO-NPs/pDNA après traitement à la DNase-I. Les PEI-SPIO-NPs à divers rapports N/P et ADNp (3 μg) ont été incubés à 37 °C dans un CO₂ à 5 % environnement subhumide pendant 30 min avec DNase-I (4 U) dans DNase/Mg ²⁺ tampon de digestion composé de 50 mM de Tris-HCl (pH = 7.6) et de 10 mM de MgCl₂ . La DNase I a ensuite été inactivée en ajoutant une solution d'EDTA (pH =8) jusqu'à ce que la concentration finale soit de 2,5 mM. L'échantillon a ensuite été incubé pendant 15 min à 65 °C, et 10 μL de 1 mg/mL d'héparine de sodium ont été ajoutés pour libérer l'ADNp de PEI-SPIO-NPs/pDNA. L'intégrité de l'ADNp a été évaluée par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % (90 V, 30 min)

Une autre caractéristique des PEI-SPIO-NP en tant que porteurs potentiels de gènes est qu'ils pourraient protéger l'ADNp de la dégradation par les nucléases, favorisant ainsi la transfection. La figure 3b montre que l'ADNp nu est significativement dégradé par la DNase-I. Les complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp à un rapport molaire N/P < 5 ont été totalement digérés, tandis que l'ADNp libéré des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp (N/P = 5:1) est resté intact. Les résultats de ces tests de protection de la DNase-I ont montré que les PEI-SPIO-NP protégeaient efficacement l'ADNp de la digestion de la DNase-I, impliquant ainsi ses applications potentielles à la thérapie génique.

Comme indiqué ci-dessus, lorsque N/P était <5, les PEI-SPIO-NP ne pouvaient pas protéger les ADNp de la dégradation par la nucléase. Les tailles des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp augmentaient lorsque N/P était> 10, ce qui ne convenait pas au transport de vecteurs [33, 34]. La taille des complexes PEI-SPIO-NPs/ADNp était la plus petite et présentait une stabilité à N/P  =5. De plus, le potentiel zêta des PEI-SPIO-NP n'augmentait pas de manière significative lorsque N/P> 10. Par conséquent, pour assurer la stabilité de PEI-SPIO-NPs/pDNA, un rapport N/P de 10 a été sélectionné pour les expériences suivantes.

Génération d'un champ magnétique

Le nouveau générateur de champ magnétique Halbach (Fig. 4a, b) a été développé par notre groupe, en collaboration avec le Collège d'ingénierie électrique de l'Université de Chongqing [20, 21]. Le nouveau générateur de champ magnétique est composé de neuf modules à aimants permanents cuboïdes identiques et de deux feuilles de calage passives (Fig. 4c), qui génèrent un champ magnétique très uniforme dans le plan horizontal.

Le générateur de champ magnétique et leur uniformité de champ magnétique et les PEI-SPIO-NPs répartis dans les différents champs magnétiques. un Mesure de l'uniformité du champ magnétique par Graussmeter. b Générateur de champ magnétique uniforme. c Image 3D de la disposition des aimants du générateur de champ magnétique uniforme (où chaque aimant a une taille de 40 × 40 × 200 mm ³ ). d Générateur de champ magnétique 96 puits. e Uniformité du champ magnétique du générateur de champ magnétique à 96 puits. f Uniformité du champ magnétique du générateur de champ magnétique uniforme. g Distribution des PEI-SPIO-NPs dans un champ magnétique de 96 puits. h Distribution des PEI-SPIO-NPs dans un champ magnétique uniforme. je La distribution plane XOY du champ magnétique uniforme (50 mm × 50 mm) et j Distribution 3D du champ magnétique uniforme

La structure d'aimant d'optimisation peut générer un champ magnétique qui se distribue de manière plate dans la direction horizontale de la zone de 50 mm × 50 mm dans le plan YOZ. Le gradient est distribué dans le sens vertical avec un gradient de 2 mT/mm. Le champ magnétique est uniformément distribué dans une zone XOY de 50 mm × 50 mm avec une uniformité de 1,3 × 10 ⁻³ et un champ magnétique de 0,0739 T, les forces magnétiques du plan coronal et des plans sagittaux où la plaque de culture cellulaire a été placée sont respectivement de 0,0632 T et 0,07 T. La différence d'uniformité de chaque puits dans la plaque magnétique de culture cellulaire à 96 puits était d'environ 80 % (Fig. 4d, e). Cependant, la différence d'uniformité de chaque puits dans le nouveau champ magnétique de Halbach est inférieure à 2‰, de sorte que la différence d'uniformité entre les deux champs magnétiques est> 100 fois (Fig. 4f). Dans ce cas, nous avons défini une plaque magnétique de culture cellulaire à 96 puits comme un champ magnétique non uniforme, et le nouveau champ magnétique Halbach est un champ magnétique relativement uniforme, qui a été utilisé comme outil expérimental pour les études ultérieures.

La distribution de PEI-SPIO-NPs a été significativement affectée par le champ magnétique. Les PEI-SPIO-NP ont coulé progressivement en raison de la gravité et ont été répartis de manière aléatoire en l'absence de champ magnétique. Lors de l'application d'un champ magnétique, les PEI-SPIO-NPs ont rapidement coulé au fond des plaques. De plus, la distribution pourrait également être modifiée de manière significative dans différents champs magnétiques. Dans le champ magnétique non uniforme conventionnel (plaque magnétique de culture cellulaire à 96 puits), les PEI-SPIO-NP ont été rassemblés en masses ou en bandes et distribués avec les lignes de force magnétique (Fig. 4g). Cependant, les PEI-SPIO-NP étaient uniformément distribués dans le champ magnétique uniforme induit par le nouveau générateur de champ magnétique (Fig. 4h). Comme on peut le voir à partir de la distribution plane XOY et de la distribution 3D du champ magnétique (Fig. 4i, j), la zone rouge sur la figure est un champ magnétique relativement uniforme, avec une uniformité d'environ deux millièmes (Z = 10 mm), et on peut voir que le gradient du champ magnétique dans la région cible est d'environ 1,3 t/m (130 G/cm). The magnetic field generated in the designated area could obtain a good flat property in the horizontal direction by adjusting the arrangement of the magnet module and changing the magnetization direction of the magnet module.

Assessment of In Vitro Cytotoxicity

We used CCK-8 kits to evaluate the effects of magnetization, magnetic field, and pDNA on the cytotoxicity of nanoparticles. Figure 5a shows that with the prolongation of culture time, the absorbance values increased in all the groups except for the PolyMag-200/pDNA groups. The absorbance values of PEI-SPIO-NPs/pDNA group were higher than that of PEI-NPs/pDNA group and PolyMag-200/pDNA group (P  < 0.05) and lower than that of the control group (P  > 0.05), suggesting that the cytotoxicity of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes is lower than unmagnetized PEI-NPs/pDNA complexes and PolyMag-200/pDNA complexes. Figure 5b shows the negative effects on the absorbance values caused by the uniform and non-uniform magnetic fields. The negative effect caused by the uniform magnetic field was smaller than that caused by the non-uniform magnetic field (P < 0,05). As shown in Fig. 5c, the absorbance values of nanoparticles without pDNA is significantly lower than that of nanoparticles with pDNA (P  < 0.05), which meant nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts.

Comparison of cytotoxicity effects of the uniform magnetic field and non-uniform magnetic field, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, PolyMag-200/pDNA complexes and PEI-NPs/pDNA complexes, and different nanoparticles with pDNA and without pDNA on MG-63 osteoblasts. Cytotoxicity is detected by the CCK-8 test kit, the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm, which reflects the cell viability, and the high viability is indicative of the low cytotoxicity. The results are expressed as the mean ± SD (n  = 5, one-way ANOVA, *P < 0,05, ***i>P < 0,01). un The cytotoxicity effects of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, PolyMag-200/pDNA complexes and PEI-NPs/pDNA complexes on MG-63 osteoblasts. b The cytotoxicity effects of the uniform magnetic field and non-uniform magnetic field on MG-63 osteoblasts and c the cytotoxicity effects of different nanoparticles with pDNA and without pDNA

Although PEI is an efficient transfection reagent, its cytotoxicity is strongly and positively correlated with its transfection efficiency and the mechanism of cytotoxicity caused by PEI is not very clear [35]. The present study found that during transfection, PEI increases the permeability of the cell membrane and damages the integrity of the mitochondrial and nuclear membranes [36, 37]. Sonawane et al. [38] reported that PEI25K promotes the release of mitochondrial protons and inhibits the electron transport chain in a dose- and time-dependent manner, indicating that PEI induces cell apoptosis. Another study showed that PEI induces cell autophagy, which is closely related to cytotoxicity [39]. The cytotoxicity of magnetized PEI decreased, and this might be attributable to the surface carboxyl groups of superparamagnetic iron oxide nanoparticles, which are negatively charged, thus partly neutralizing the positive charge of the PEIs and decreasing the chances of incurring irreversible damage. The non-uniform magnetic field induced PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes to gather into masses or bands, and be distributed along with the lines of magnetic force (Fig. 4b), thereby causing severe damage to parts of the cell membrane and even cell death due to the excessively high number of positive charges [40]. In contrast, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes were uniformly distributed across the uniform magnetic field, thereby decreasing the accumulation of positive charges and reducing the cytotoxicity.

Nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts than nanoparticles without pDNA; this may be attributed to the negatively charged pDNA partially neutralize the surface positive potential of the cationic nanoparticles at the beginning of magnetofection progress. Moghimi SM et al. concluded that PEI-induced cellular toxicity could been defined as a two-stage process, with the first stage taking place within 30 min of PEI uptake [41]. Stage-one toxicity has been defined as necrosis that is based on compromise of cell membrane integrity mediated by PEI binding to negatively charged plasma membrane proteoglycans, with highly cationic NPs being extremely cytotoxic [42]. After internalized by MG-63 osteoblast, different nanoparticles exhibits similar cytotoxic mechanisms, internalization leads to proton buffering, osmotic pressure, and eventual lysis of lysosomal membranes, releasing hydrolytic enzymes and other lysosomal constituents into the cytoplasm [43].

Cellular Uptake of PEI-SPIO-NPs/pDNA Complexes

To better understand the intracellular distribution of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes or PEI-NPs/pDNA complexes and the relationship between intracellular uptake of complexes and transfection efficiency, a laser scanning confocal microscope was used to trace the magnetized RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes and non-magnetized RBITC-PEI-NPs/pDNA complexes during transfection of MG-63 cells. LysoTracker Green D26 is a specific marker for lysosomes, and Hoechst 33342 specifically stains nuclei. Overlapping green and red fluorescence, which yields yellow fluorescence, represents colocalization and indicates entrapment of polyplexes in lysosome.

Figure 6 shows that extensive co-localization was observed at 6 h post-transfection, which indicates that most of the complexes were entrapped in endosomes. The RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed a higher frequency of co-localization than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group (arrow). At 12 h post-transfection, most of the red fluorescence had already translocated from the green fluorescence of lysosomes to the surrounding blue fluorescence of nuclei, and some green fluorescence of gene expression was visible in the cytoplasm, which indicated that most complexes escaped the endosomes via the proton sponge effect [44, 45] (arrow). The fluorescent signals of the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group were more distinct than those of the RBITC-SPIO-PEI-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group. It was interesting that the cytoplasm emitted green fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, which indicated expression of GFP, thereby illustrating the proton sponge effect that facilitates gene expression. At 12 h post-transfection, some nuclei emitted red fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, indicating that complexes had been transported into nuclei, which may be attributable to the mechanical effect of magnetofection (arrow). At 24 h post-transfection, the green fluorescence in the cytoplasm showed maximal levels, the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed more intense green fluorescence than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field and the PBITC-PEI-NPs group (arrow). The affiliated magnetic field enabled the magnetic nanoparticles to attach rapidly to the cell membrane and accelerate intracellular uptake of magnetic nanoparticles. By contrast, up to 100% of these cells will have vector particles bound to their surfaces within a few minutes in the presence of the novel uniform magnetic field; more vectors adherence leads to a greater probability of cellular uptake, and transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [46].

Intracellular tracking of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes in the presence of uniform magnetic field (uniform MF) or non-uniform magnetic field (non-uniform MF) and PEI-NPs/pDNA complexes without magnetic field (No MF) at 6, 12, and 24 h post-transfection to MG-63 osteoblasts. Confocal images were obtained from three channels and overlaid:red indicates RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes (excitation:554 nm; emission:576 nm), green represents lysosomes stained with Lysotracker-DND26 and the homogeneous green in the cytoplasm implies GFP expression (excitation:443 nm; emission:505 nm), blue signifies the nuclei stained by the Hochest 33342. (excitation:359 nm; emission:461 nm)

In Vitro Transfection

Because PEI-SPIO-NPs are endowed with promising attributes such as pDNA condensation ability and high cell viability, we next used it as a gene carrier to determine the role of novel uniform and non-uniform magnetic fields on transfection efficiency. To evaluate the effectiveness of magnetofection, we selected the MG-63 osteosarcoma cell line as target cells and used GFP-pDNA as the reporter gene.

GFP expression was observed by inverted fluorescence microscopy at 24 h post-transfection. Figure 7a shows that the PEI-SPIO-NPs/pDNA group yielded significantly higher transfection efficiencies than the PEI-NPs/pDNA group in the presence of the uniform or non-uniform magnetic field, which is obvious in the uniform magnetic field group (P  < 0.05), the transfection efficiency of the uniform magnetic field group was 42.1%, which is roughly two times higher than that of the non-uniform magnetic field group. Although PolyMag-200/pDNA showed high transfection efficiency and has been confirmed to transfect most adherent cell lines, it is also highly cytotoxic. The cells were collected for flow cytometry at 48 h post-transfection (Fig. 7b), and the statistical analysis results were in agreement with the findings from fluorescence microscopy (Fig. 7c).

MG-63 osteoblasts transfected with PEI-SPIO-NPs/pDNA or PEI-NPs/pDNA under the condition of no magnetic field, non-uniform magnetic field, or uniform magnetic field. GFP-pDNA was used for reporter gene in combination with PEI-NPs or PEI-SPIO-NPs (N/P = 10), and the cells were exposed to the non-uniform or uniform magnetic fields for 20 min. At 24-h post-transfection, cell images were captured under an inverted fluorescent microscope. PolyMag-200 comprise commercial magnetic transfection reagents that were used as positive control, naked pDNA was used as the negative control. un At × 40 magnification in an inverted fluorescent microscope. b Transfection efficiency was calculated by flow cytometer and c statistical analysis of the transfection efficiency of PEI-SPIO-NPs/pDNA group, PolyMag-200/pDNA group and PEI-NPs/pDNA group. The results are expressed as the mean ± SD (n  = 5, one-way ANOVA, *P < 0,05, ***i>P  < 0.01)

The mechanism underlying the increase in transfection efficiency by magnetofection is currently unclear. Previous studies have demonstrated that magnetofection does not involve magnetic nanoparticles being pulled directly into the cells by the magnetic field, magnetic nanoparticles enter cells via endocytosis and remain intact upon cellular uptake [47]. The observed significant increase in transfection efficiency may be due to the synergistic effect of accelerated sedimentation and fast internalization [48, 49]. The number of magnetic complexes that enter each cell apparently influences pDNA content. Although genes must still escape endosomes before transcription, transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [50], branched PEIs showed a higher uptake rate. However, once inside the cell, lysosomal escape becomes the key to transfection, especially with higher N/P ratios, and linear PEIs showed higher rates of lysosomal escape [51,52,53]. Because of the magnetic force, PEI-SPIO-NPs can quickly come in close contact with cell membranes, which to some extent, increases the uptake capability of complexes. Once the complexes are inside the cell, PEIs provide a structural advantage and facilitate timely release of pDNA, which is eventually expressed by the cells.

Conclusions

The novel magnetic field generator has been developed to induced a uniform magnetic field, in which the PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes are rapidly and uniformly distributed on the surface of MG-63 osteoblasts, thereby averting local transfection and decreasing disruption of the membrane caused by centralization of positively charged PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, ultimately resulting in an increase in the effective coverage of the magnetic gene carriers during transfection, and improving magnetofection efficiency. This innovative uniform magnetic field could be used to determine the optimal amount of PEI-SPIO-NPs and pDNA, and screen for the optimal formulation design of a magnetic gene carrier under homogeneous conditions. Most importantly, the novel uniform magnetic field facilitates the transfection of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes into osteoblasts, which provides a novel approach for the targeted delivery of therapeutic genes to osteosarcoma tissues and serves as a reference for the treatment of other tumors. However, a series of comprehensive studies are warranted to establish the therapeutic potential of PEI-SPIO-NPs that are integrated into a novel uniform magnetic field in combating osteosarcoma.

Abréviations

AFM :

Microscopie à force atomique

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMEM :

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

EDC :

1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino) propyl] carbodiimide

FBS :

Sérum fœtal bovin

GFP:

Green fluorescent protein

ICP-OES:

Inductively coupled plasma optical emission spectrometer

MF:

Magnetic field

MG-63:

Human osteoblasts

IRM :

Imagerie par résonance magnétique

MWCO:

Molecular weight cut off

NHS:

N -hydroxy succinimide

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

pDNA:

Plasmid DNA

Île-du-Prince-Édouard :

Polyéthylèneimine

PEI-NPs:

Polyethylenimine nanoparticles

PEI-SPIO-NPs:

Polyethylenimine modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles

RBITC:

Rhodamine B isothiocyanate

SPIO-NPs:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticles

TEM :

Microscopie électronique à transmission

VSM :

Magnétomètre à échantillon vibrant