L'exposition aux nanoparticules de dioxyde de titane pendant la grossesse a modifié le microbiote intestinal de la mère et augmenté la glycémie du rat

Introduction

Nanoparticule de dioxyde de titane (TiO₂ NP) est l'un des nanomatériaux les plus largement utilisés et peut être facilement trouvé dans la crème solaire, la peinture, l'encre et les aliments [1, 2]. Ils peuvent facilement être libérés et pénétrer dans le corps humain lors de l'utilisation de produits commerciaux. Notamment, les femmes enceintes ne peuvent éviter de s'y exposer. Des études animales ont montré que des dysfonctionnements ovariens et reproducteurs étaient observés [3], et que les neurotransmetteurs monoaminergiques étaient également altérés [4] lorsque des souris femelles adultes étaient exposées au TiO₂ NPs. De plus, des complications de grossesse et des issues défavorables à la naissance ont également été observées après que des souris gravides ont été exposées au TiO₂ NP [5]. Toutes les études ci-dessus ont indiqué que TiO₂ Les NP étaient nocives pour les femelles adultes, ainsi que pour les femelles gravides, mais les mécanismes n'étaient pas entièrement compris. Les études relatives doivent donc être réalisées pour l'évaluation de la sécurité du TiO₂ NPs.

TiO₂ Le NP est utilisé comme une sorte d'agent antibactérien puissant; ils peuvent tuer de nombreux types de bactéries, y compris Staphylococcus aureus , Salmonella, Streptococcus mutans , et ainsi de suite [6]. Les effets antibactériens étaient en fait non sélectifs, alors que la plupart des études actuelles se concentrent principalement sur leurs effets sur la destruction des bactéries nocives, peu ont indiqué si TiO₂ Les NP tueraient les probiotiques ou d'autres bactéries symbiotiques et auraient des effets néfastes sur les êtres humains. Études pour savoir si TiO₂ Les NP modifieraient la composition normale du microbiote intestinal et causeraient des inconvénients aux femelles gravides faisaient également défaut ; par conséquent, nous avons mené cette étude du point de vue du microbiote intestinal.

Récemment, de plus en plus de recherches ont montré que le microbiote intestinal était étroitement lié aux maladies humaines, notamment le diabète de type 2 [7] et l'obésité [8]. Les probiotiques pourraient affecter le métabolisme des femmes enceintes atteintes de diabète gestationnel [9] et modifier la méthylation des gènes associés au diabète chez les fœtus [10]. Des études ont rapporté que le taux de glucose plasmatique augmentait lorsque des souris adultes étaient exposées au TiO₂ NPs pendant 12 semaines [11]. Il n'a pas été indiqué si la glycémie des femmes enceintes augmenterait après l'exposition et si la période d'exposition raccourcirait.

Toutes les études mentionnées ci-dessus suggèrent que TiO₂ Les NP peuvent affecter le microbiote intestinal et augmenter le taux de glucose plasmatique, mais aucune preuve directe n'a prouvé le lien entre le microbiote intestinal et le taux de glucose sanguin maternel, et les mécanismes n'étaient pas non plus clairs. Les études précédentes se concentrent principalement sur les études sur les animaux adultes et les effets du TiO₂ Les NP sur les femelles gravides ont été simplement étudiées du point de vue du microbiote intestinal. Dans cette étude, nous avons établi le modèle d'exposition de la grossesse chez le rat pour déterminer si le microbiote intestinal maternel changerait et comment il changerait après l'exposition des femelles gravides au TiO₂ NPs, et nous avons essayé de répondre à la question de savoir quels effets indésirables seraient apportés aux femelles gravides par les changements du microbiote intestinal après TiO₂ exposition aux NP. Notre étude a soulevé des inquiétudes quant à la sécurité du TiO₂ NPs aux femmes enceintes et nous avons révélé les mécanismes potentiels.

Matériaux et méthodes

Conception de l'étude

Sur la base d'une étude réalisée par Weir, A. et ses collègues chez l'homme [12], la voie d'exposition et la dose d'exposition chez le rat ont été déterminées. Les rats femelles ont reçu quotidiennement par gavage 5 mg/kg de poids corporel/jour de TiO₂ NPs du 5e au 18e jour après la grossesse, et les progrès ont été montrés sur la Fig. 1a. Chaque rat a été pesé avant exposition orale, et 0,5 % de la méthylcellulose a été administré comme véhicule témoin.

un La conception expérimentale de cette étude. b Les images MET de TiO₂ NPs, barre =50 nm. c Principales caractéristiques du TiO₂ Les NP mesurées ou rapportées par le fabricant ont été présentées

Animaux

Des études animales ont été réalisées avec l'autorisation du comité d'éthique. Les rats Sprague-Dawley (SD) ont été achetés auprès de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Rats femelles (n = 8, 12 semaines) ont été séparés des rats mâles (n = 8, 14 semaines) et des rats du même sexe ont été gardés dans une grande cage. Tous les rats ont été logés dans des conditions de température (22 ± 2 °C) et d'humidité (40–60 %) contrôlées, avec un cycle lumière/obscurité de 12 h pour 1 semaine de repos. Ensuite, les rats femelles ont été divisés au hasard en groupe témoin (n = 4) et groupe d'exposition (n = 4), et accouplés avec des mâles dans un rapport de 1:1 dans des cages individuelles. Un bouchon vaginal a été observé chaque matin et la présence d'un bouchon vaginal a confirmé la grossesse et enregistré comme jour de gestation 0,5 (GD 0,5), et les rates gravides ont été élevées dans des cages séparées.

TiO₂ Préparation et administration des IP

TiO₂ NP est un produit commercial acheté auprès de Sigma-Aldrich (13463-67-7). La solution mère de TiO₂ Les NP ont été dissoutes dans de la méthylcellulose (0,5 %) à la concentration de 5 mg/ml selon une étude précédente [13], et soniquées pendant 30 min (100 W). Le diamètre hydrodynamique du TiO₂ Les NP dans la méthylcellulose ont été mesurées par diffusion dynamique de la lumière (DLS).

Collecte des matières fécales et préparation de l'ADN total fécal

Les matières fécales de chaque rat ont été collectées à GD 0 (avant l'accouplement), GD 10 et GD 17 avec le processus de gestation, respectivement. Les matières fécales ont été stockées à - 80 °C avant l'analyse de la diversité bactérienne. L'ADN total fécal a été extrait à l'aide d'un kit Power Soil DNA (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, Californie, USA) selon le protocole du fabricant. Et les concentrations d'ADN ont été mesurées par spectrophotomètre NanoDrop (NanoDrop™ 2000/2000C, USA).

Séquençage des gènes de l'ARNr 16S et analyse des données

Le séquençage bactérien des gènes de l'ARNr 16S a été réalisé avec la plateforme Illumina MiSeq (Hangzhou Guhe Information and Technology Co., Ltd., Zhejiang, Chine). Les régions V3 et V4 de l'ARNr 16S bactérien ont été amplifiées avec des amorces spécifiques comme décrit précédemment [14]. Et les ADN ont été soumis au séquençage Illumina MiSeq après avoir été amplifiés et purifiés. Les données de séquençage ont été traitées à l'aide d'informations quantitatives sur l'écologie microbienne (QIIME) selon des études antérieures [15]. Les données ont été lues et fusionnées à partir des fragments d'ADN d'origine, et les longueurs de lecture étaient comprises entre 400 et 500 pb. Les séquences chimériques ont été examinées plus en détail à l'aide de QIIME si elles se produisent.

Collecte d'échantillons sanguins et détermination de la glycémie

Le sang veineux à jeun de tous les rats femelles a également été collecté en conséquence lorsque les matières fécales ont été collectées. Les échantillons de sang ont été prélevés dans la veine caudale le matin après 12 h de famine à GD 0, GD 10 et GD 17, respectivement. Ensuite, les taux de glycémie à jeun ont été immédiatement déterminés avec le lecteur Roche ACCU-CHEK® Performa selon le protocole du fabricant après prélèvement.

Analyse statistique

Les analyses statistiques ont été effectuées avec Graphpad Prism 6; toutes les données sur la diversité des bactéries ont été présentées avec des boîtes à moustaches en tant que moyenne  ± SE, et la signification de parmi tous les groupes a été examinée par ANOVA à un facteur suivie du test de comparaison multiple de Dunnett. P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats et discussion

Caractéristiques du TiO₂ NP

Les principales caractéristiques du TiO₂ Les NP ont été mesurées et présentées avant les études animales. La figure 1b montre un champ visuel de TiO₂ NPs sous microscope électronique à transmission. La morphologie du TiO₂ NPs était presque une sphère avec un diamètre primaire d'environ 21 nm. Le diamètre hydrodynamique moyen était d'environ 199,5 nm dans une solution de méthylcellulose (Fig. 1c). La pureté du TiO₂ NPs est ≥ 99,5 % et la superficie est de 35 à 65 m ² /g selon le rapport du fabricant. Des études récentes ont rapporté que le TiO₂ de qualité nanométrique et fine pourrait augmenter le taux de glucose sanguin des animaux adultes après une exposition orale [11, 16], et si le glucose sanguin des femelles gravides serait affecté était inconnu. Pour clarifier cette question et les mécanismes sous-jacents, nous avons établi le modèle d'exposition des rats gravides pour évaluer la toxicité du TiO₂ NPs et pour sonder les méfaits des rates gravides.

La plupart des TiO₂ les particules dans les produits ont une taille primaire allant principalement de 60 à 300 nm, la minorité (~ 20 %) était de < 100 nm [17], tandis qu'une étude récente a montré que la quantité de TiO₂ Les NP dans certains produits alimentaires sont beaucoup plus grandes que ce que nous connaissons (~ 90%), par exemple, le chewing-gum [18]. Comme on le sait, les nanoparticules plus petites avaient une toxicité plus élevée [19, 20], et les femelles étaient plus sensibles aux substrats nocifs pendant la grossesse, donc la partie minoritaire de TiO₂ Les NP peuvent apporter des effets non négligeables sur les femelles gravides que la majorité des particules fines. Dans cette étude, nous avons exposé le modèle de rat gravide à du TiO₂ nanométrique. (~ 21 nm) pour étudier les risques potentiels du TiO₂ IP aux femmes enceintes.

Modifications de la diversité des bactéries pendant la grossesse normale

Pendant la gestation, les femelles gravides deviennent plus sensibles à l'exposition physique et chimique; afin de diminuer les effets de l'opération manuelle sur l'implantation de l'ovule fécondé, le 5ème jour a été choisi comme premier jour d'exposition lorsque les blastulas ont terminé l'implantation. GD 17 est le dernier jour avant l'accouchement et GD 10 est le milieu de la grossesse. La dynamique normale du microbiome intestinal pendant la grossesse a été examinée à l'aide d'échantillons fécaux provenant de trois points temporels de groupes témoins (GD 0, GD 10 et GD 17). Nous avons observé la diversité alpha du microbiome intestinal au fil du temps en calculant les indices de Shannon, Simpson et Chao1, mais la différence n'était pas significative (Fig. 2a). Sur la base d'une analyse de mise à l'échelle multidimensionnelle non métrique (NMDS), aucune différence marquée n'a également été trouvée dans les échantillons à différents moments (Fig. 2b), ce qui était cohérent avec les études précédentes [21, 22]. Le diagramme de Venn (Fig. 2c) montrait les unités taxonomiques opérationnelles (OTU) partagées et spécifiques dans des échantillons de différents moments, et les OTU partagées de trois moments (GD 0, GD 10, GD 17) dans les groupes témoins étaient de 164 ; ces résultats ont indiqué que le nombre d'UTO spécifiques augmentait avec le temps pendant la grossesse. Nos résultats ont montré que le microbiote intestinal n'a révélé aucun changement significatif au cours d'une grossesse normale, et les changements n'apporteront pas d'effets indésirables et sont même bénéfiques pour la mère. Nos résultats suggèrent que le changement du microbiote intestinal pourrait être le résultat du processus de grossesse, qui pourrait être causé par des changements hormonaux des femmes enceintes [23], similaires aux changements de la flore vaginale pendant la grossesse [24]. En outre, cela pourrait être une condition préalable à une grossesse normale.

Modifications des caractéristiques du microbiote intestinal chez des rats témoins (non exposés) au cours d'une gestation normale. un Alpha-diversité du microbiome intestinal révélée par les indices de Shannon, Simpson et Chao1. b La bêta-diversité a été révélée par une analyse de mise à l'échelle multidimensionnelle non métrique (NMDS). c Les numéros d'unités taxonomiques opérationnelles (OTU) uniques et de partage ont été présentés dans le diagramme de Venn. D0 Ctrl signifie rats dans le groupe témoin avant l'accouplement, d10 Ctrl et d17 Ctrl signifient rats témoins dans GD 10 et GD 17, respectivement

Modifications de la diversité des bactéries après exposition au TiO₂ IP pendant la grossesse

Des études ont indiqué que le microbiote intestinal est crucial pour le maintien d'une situation immunitaire normale [25]; un changement naturel du microbiote intestinal au cours d'une grossesse normale peut réguler le système immunitaire pour accepter l'implantation d'ovules fécondés [26]. Pendant ce temps, l'altération naturelle du microbiote intestinal pendant une grossesse normale pourrait également aider les femmes enceintes à s'adapter aux changements métaboliques pendant la gestation. Une fois que l'altération du microbiote intestinal a dépassé un « degré approprié », une issue défavorable de la grossesse peut survenir. Nous avons donc analysé les changements du microbiote après TiO₂ Exposition aux NPs dans la partie suivante. Les effets du TiO₂ Les NP sur la diversité des bactéries pendant la grossesse ont été évaluées en analysant la diversité alpha et bêta à GD 0, GD10 et GD17 après que les femelles ont été exposées à des nanoparticules. Les résultats ont montré que la diversité alpha montrait une tendance à la hausse à Shannon et un changement significatif de l'indice de Simpson (P < 0,05) par rapport à une grossesse normale, mais aucune différence dans Chao1 (Fig. 3a). L'analyse NMDS (Fig. 3b) n'a pas non plus montré de différence significative comme c'est le cas lors d'une grossesse normale, mais après exposition au TiO₂ NPs, les OTU spécifiques dans les échantillons ont diminué au milieu et à la fin de la grossesse (Fig. 3c). Au cours d'une grossesse normale, la diversité du microbiote intestinal n'a subi aucun changement évident, mais nous avons observé une tendance à la hausse de la diversité bactérienne dans les selles maternelles après que des souris femelles aient été exposées au TiO₂ NPs pendant la grossesse, qui pourraient être dues à TiO₂ Les NP étant un agent antibactérien très efficace et pouvant tuer de nombreux types de bactéries ; ils ont inhibé les bactéries dominantes dans l'intestin et les bactéries supprimées à l'origine pouvaient se reproduire dans ces conditions. Des études ont indiqué que le microbiote intestinal était associé à de nombreuses maladies, notamment le diabète, l'obésité, l'hypertension [27] et le cancer [28] ; le lien entre le microbiote intestinal et le diabète gestationnel avait également été confirmé [29]. La raison pour laquelle aucun changement significatif entre GD 0, GD10 et GD17 n'a été observé après l'exposition peut être que TiO₂ Les NP étaient « relativement sûres » ou les modifications du microbiote induites par TiO₂ L'exposition aux NP peut être couverte par les changements du microbiote liés à la grossesse.

Modifications des caractéristiques du microbiote intestinal chez les rats exposés au cours de la gestation. un L'alpha-diversité du microbiome intestinal révélée par l'indice de Shannon, Simpson et Chao1. b La bêta-diversité a été révélée par l'analyse NMDS. c Les numéros d'OTU uniques et de partage ont été présentés dans le diagramme de Venn. Test D0 désigne des échantillons prélevés sur des rats avant exposition au TiO₂ NPs, test d10 et test d17 signifient des échantillons prélevés sur des rats exposés à GD 10 et GD 17, respectivement

Modifications du microbiote intestinal au cours du deuxième trimestre après exposition au TiO₂ NP

Pour exclure les effets de la grossesse et découvrir plus en détail les effets indépendants du TiO₂ NPs sur le microbiote intestinal, nous avons comparé les différences de microbiome intestinal entre le groupe témoin et le groupe de traitement à l'aide d'échantillons prélevés au cours du deuxième trimestre (GD 10). Aucune différence significative de diversité alpha n'a été trouvée selon les indices de Shannon, Simpson et Chao1 (Fig. 4a). Une distinction remarquable a été observée entre les deux groupes sur la base de l'analyse NMDS (Fig. 4b). La figure 4c a montré que l'exposition au TiO₂ Les NP ont entraîné des modifications de certaines OTU spécifiques dans le groupe de traitement par rapport au groupe témoin (Venn). Ces résultats ont montré que TiO₂ Les NP étaient relativement sûres et n'induiraient pas de dysbactériose évidente. Mais la composition de la flore, à savoir l'abondance du genre spécifique, a changé respectivement au deuxième trimestre et à la fin de la grossesse. Pour mieux connaître les risques potentiels des changements survenus pendant la grossesse et explorer les effets indésirables pouvant être provoqués, nous avons identifié les changements fonctionnels du microbiote intestinal grâce à la bioinformatique. Les résultats ont montré que deux biomarqueurs dominants, Ellin6075 et Clostridiales, ont été trouvés par analyse LefSe (analyse discriminante linéaire (LDA)> 2). L'abondance d'Ellin6075 a diminué et les Clostridiales ont augmenté après TiO₂ Exposition aux NPs respectivement (Fig. 4d). Ellin6075 a été isolé dans une ferme australienne, mais peu d'informations étaient disponibles concernant ses traits ou fonctions phénotypiques, de sorte que leurs effets sur la grossesse nécessitent une enquête plus approfondie. Yan et ses collègues ont montré que Clostridium augmentait significativement chez les rats obèses SD [30], ce qui était cohérent avec notre conclusion selon laquelle Clostridium coexistait avec une glycémie élevée. Pour révéler les effets du changement du microbiote intestinal sur la grossesse, nous avons prédit les différences génétiques dans les échantillons fécaux à l'aide d'une enquête phylogénétique des communautés par reconstruction d'états non observés (PICRUSt) (Fig. 4e), et avons découvert que les gènes du diabète de type 2 étaient liés à la fonction et les protéines de biosynthèse des lipides ont été renforcées dans le groupe de traitement, tandis que le métabolisme de la taurine et de l'hypotaurine a été affaibli. Les chercheurs ont démontré que le microbiote intestinal pouvait générer des acides gras à chaîne courte, notamment de l'acide acétique, de l'acide propionique, et réguler à son tour la glycémie de l'hôte [31]. Et le changement de taurine et d'hypotaurine était également en accord avec le fait que la taurine pouvait réguler à la baisse les concentrations de glucose dans le sang maternel [32].

Modifications des caractéristiques du microbiote intestinal entre les rats témoins et TiO₂ Rats exposés à NP à GD 10. a , b La diversité alpha et bêta du microbiome intestinal a été présentée sous la forme d'indices de Shannon, Simpson et Chao1, ainsi que d'une analyse NMDS. c Le diagramme de Venn a montré les caractéristiques des OTU. d , e Des biomarqueurs dominants et des fonctions génétiques associées ont été trouvés par Lefse et l'enquête phylogénétique des communautés par la prédiction de reconstruction d'états non observés (PICRUSt), respectivement. D10 Ctrl signifie les rats témoins à GD 10, d10 Test signifie les rats d'exposition à GD 10

Modifications du microbiote intestinal en fin de grossesse après exposition au TiO₂ NP

Le microbiome intestinal de fin de grossesse a été examiné par des échantillons de selles prélevés à GD17. Aucune différence significative n'a été trouvée dans la diversité alpha (Fig. 5a). Ces échantillons ont été répartis de manière significative par groupe témoin et groupe de traitement dans le modèle NMDS (Fig. 5b). Comme le montre la figure 5c, une diminution du nombre d'OTU observées a été trouvée dans le groupe de traitement. Nous avons également utilisé Lefse pour identifier des biomarqueurs potentiels. Notamment, comme le montre la figure 5d, l'abondance d'Ellin6075 a persisté dans le groupe de traitement en fin de grossesse (LDA > 2), et l'abondance de Dehalobacteriaceae a été diminuée par l'exposition au TiO₂ NPs également (LDA > 2). À ce stade, les modifications génétiques liées au diabète sucré n'ont pas été observées, ce qui suggère que le deuxième trimestre, au lieu du dernier trimestre, était la fenêtre sensible pour TiO₂ NPs pour augmenter la glycémie maternelle. Et le résultat était en accord avec notre reconnaissance clinique que, nos médecins ont effectué le test de tolérance au glucose par voie orale (OGTT), un diagnostic commun du diabète gestationnel humain, pour dépister le diabète gestationnel chez les femmes enceintes au deuxième trimestre (environ la 26e semaine en femmes enceintes). Les résultats ont montré que la glycémie à jeun avait augmenté au jour J 10 après que les rates gravides ont été exposées au TiO₂ NPs, et est antérieur à un résultat précédent rapporté (~ 12 semaines) chez les animaux adultes [11], qui prouvait le fait que les femelles gravides étaient plus sensibles que les adultes.

Modifications des caractéristiques du microbiote intestinal entre les rats témoins et TiO₂ Rats exposés aux NP au 17e jour de la grossesse. a Les indices de Shannon, Simpson et Chao1 qui présentaient une alpha-diversité ont été comparés entre deux groupes. b La bêta-diversité a été révélée par l'analyse NMDS. c Le diagramme de Venn montrant les OTU uniques et partagées en deux groupes. d Lefse a trouvé les biomarqueurs candidats (LDA > 2) et les différences de fonctions des gènes ont été prédites. e Les taux de glycémie à jeun de rats ont été mesurés à GD 0, GD 10 et GD 17 après exposition au TiO₂ NPs. D17 Ctrl et d17 Test désignent les rats témoins et exposés au 17e jour de gestation, respectivement

Les effets du TiO₂ IP sur la glycémie après exposition prénatale

Afin de prouver les résultats de la prédiction PICRUST, nous avons mesuré la glycémie à jeun des rats à GD10 et GD17, respectivement. Après que les rates gravides aient été exposées au TiO₂ NPs pendant 12 jours (GD5–GD17), les taux de glycémie à jeun ont été mesurés. Comme le montre la figure 5e, en comparaison avec le groupe témoin, les taux de glucose à jeun des rats ont augmenté de manière significative à la fois GD10 (P < 0,05) et GD17 (P < 0,01) après exposition au TiO₂ NPs, ce qui était conforme aux rapports précédents que TiO₂ Les NP pourraient augmenter la glycémie des animaux adultes [11, 33]. Mais l'augmentation de la valeur entre le groupe témoin et GD 17 était relativement faible (~ 0,5 mM) et n'atteignait pas la norme du diabète gestationnel [34]. Les résultats suggèrent que la mère solitaire exposée au TiO₂ Les NP pendant la gestation ne sont pas suffisantes pour induire un diabète gestationnel, mais l'augmentation de la glycémie peut entraîner des effets indésirables pour les femelles gravides et leur progéniture. Et il a été rapporté que la mère exposée à une glycémie plus élevée pendant la grossesse pourrait augmenter les risques d'obésité et de tolérance anormale au glucose des fœtus [35], ce qui nous a également rappelé que TiO₂ Les NP peuvent présenter des risques potentiels pour la progéniture.

Conclusion

Nos études ont indiqué que l'exposition prénatale au TiO₂ Les NP pourraient augmenter la glycémie à jeun chez la mère, et les altérations du microbiote intestinal pourraient être le mécanisme sous-jacent. Et nous en tirons la conclusion que TiO₂ Les IP pourraient augmenter le risque de diabète gestationnel chez les femmes enceintes humaines, ce qui devrait éveiller notre attention.

Abréviations

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

GD :

Jour de gestation

LDA :

Analyse discriminante linéaire

NMDS :

Mise à l'échelle multidimensionnelle non métrique

OGTT :

Test de tolérance au glucose par voie orale

OTU :

Unités taxonomiques opérationnelles

PICRSt :

Investigation phylogénétique des communautés par reconstruction d'états non observés

QIIME :

Informations quantitatives sur l'écologie microbienne

SD :

Sprague-Dawley

TiO₂ NP :

Nanoparticules de dioxyde de titane