Un nouvel agent de contraste basé sur des nanoparticules magnétiques pour la détection du cholestérol en tant que biomarqueur de la maladie d'Alzheimer

Contexte

Plusieurs études ont montré que la présence d'une quantité appropriée de cholestérol (CHO) dans la membrane plasmique neuronale joue un rôle clé dans la protection des cellules nerveuses contre la toxicité de la protéine β-amyloïde dans la maladie d'Alzheimer (MA) en contrecarrant la production excessive de cette protéine. [1,2,3] ; les neurones enrichis en CHO sont plus résistants au stress oxydatif et à la toxicité de la protéine β-amyloïde [4, 5].

Par conséquent, on peut supposer que la quantité de CHO présente dans la membrane plasmique neuronale, et pas seulement ses niveaux plasmatiques, peut jouer un rôle dans la pathogenèse des maladies neurodégénératives [6]. En fait, les données expérimentales soutiennent l'idée qu'une quantité optimale de CHO dans les membranes cellulaires est nécessaire pour créer une barrière protectrice contre les agents toxiques. Une quantité réduite de CHO cellulaire dans la membrane plasmique altère cette barrière protectrice, réduisant la protection contre les agents toxiques, dont la protéine β-amyloïde [7]. Fait intéressant, les neurones du cortex cérébral des souris transgéniques AD contiennent moins de CHO dans la membrane plasmique que ceux des souris de type sauvage [8].

Mori et al. [9] ont montré que tant chez l'homme que chez la souris transgénique précurseur de la protéine amyloïde (APP), la CHO s'accumule anormalement dans les plaques amyloïdes matures mais pas dans les plaques diffuses ou immatures, suggérant que la CHO pourrait jouer un rôle dans la formation et la progression des plaques séniles. D'autres études ultérieures ont révélé que la CHO et l'apolipoprotéine E étaient présentes au cœur des plaques fibrillaires, mais pas dans les plaques diffuses à un stade précoce. Aux stades plus avancés de la maladie, un nombre plus élevé de plaques fibrillaires immunopositives pour la cholestérol oxydase a été décrit [10]. La quantité de CHO libre par plaque sénile, déterminée par spectrométrie de masse, était similaire à la charge protéique β-amyloïde [8]. Cette augmentation mutuelle de la concentration de CHO et de plaques séniles dans la MA pourrait suggérer un nouveau mécanisme pathogène de la maladie [11]. De plus, dans les tissus cérébraux des patients atteints de MA, des dépôts lipidiques co-localisés avec des plaques séniles fibrillaires ont été décrits en utilisant la diffusion Raman anti-Stokes et la microscopie à fluorescence à 2 photons dans des échantillons colorés à la Thioflavine-S [10]. Deux morphologies lipidiques peuvent être observées :des structures lamellaires et des macro-agrégats coalescents de tailles submicroniques. Étant donné que la composition/l'organisation lipidique varie à travers les plaques, il existe des preuves claires d'une interaction étroite amyloïde-lipide dans les plaques séniles fibrillaires, ce qui en fait des compositions plus dynamiques qu'on ne le pensait auparavant [12].

De plus, afin de détecter des biomarqueurs de la MA aux stades précoces de la maladie, plusieurs études ont proposé l'utilisation de nanoparticules d'oxyde de fer magnétique fonctionnalisées (MNP) comme agents de contraste spécifiques pour l'imagerie par résonance magnétique (IRM) des plaques séniles [13,14, 15] et la détection de la protéine ferritine [16]. L'effet hypointense présenté par ces particules dans les séquences pondérées en T2 et T2* offre un plus grand contraste dans les images IRM. Par conséquent, l'utilisation de MNP comme agents de contraste pour l'IRM est une méthode prometteuse pour le diagnostic précoce de la MA.

Le présent travail présente l'hypothèse de l'utilisation d'un nouveau contraste à base de MNPs biofonctionnalisés, pour la détection par IRM d'accumulations anormales de CHO dans les plaques séniles, qui peut être utilisé comme biomarqueur potentiel de la MA.

Le présent travail présente pour la première fois, à notre connaissance, la conception d'un nouvel agent de contraste à base de MNPs biofonctionnalisés pour la détection par IRM d'accumulations anormales de CHO dans les plaques séniles, pouvant être utilisé comme biomarqueur potentiel de la MA. .

L'hypothèse

En raison de l'incidence élevée de la MA dans la population mondiale au cours des années [17], et des coûts associés de la pathologie en termes sanitaires et sociaux pour les pays [17], il est urgent de développer des outils non invasifs permettant la détection précoce de biomarqueurs pour diagnostic et évolution de la maladie.

Dans les méthodes de diagnostic précoce, le développement d'agents de contraste pour l'imagerie moléculaire (IM) devient particulièrement utile. L'IM combine des technologies d'imagerie conventionnelles avec des sondes moléculaires, conçues pour détecter les aspects de la biochimie et de la biologie cellulaire qui sous-tendent la progression de la maladie et la réponse au traitement [18,19,20].

Nous proposons la synthèse d'un agent de contraste à base de MNP enrobées de polyéthylène glycol (PEG) et fonctionnalisées à la streptavidine (Fig. 1a) pour permettre la liaison directionnelle d'un anticorps biotinylé qui reconnaît spécifiquement le CHO présent dans les plaques séniles (NANOCHOAD) ( Fig. 1b). L'anticorps reconnaîtra également le CHO présent dans la membrane plasmique cellulaire, détectant ainsi la diminution de CHO dans les membranes plasmiques neuronales. Les MNP seront recouverts de chaînes PEG pour améliorer la stabilité colloïdale de la nanoplateforme, facilitant sa dispersion dans la circulation sanguine et le passage à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) [21].

Schéma de principe de la nanoplateforme conçue et de son mécanisme d'action. un la structure de MNP, et fonctionnalisation avec anticorps anti-CHO (NANOCHOAD), b stratégies de pénétration de la nanoplateforme via BBB, c Mécanisme de passage à travers le BBB de NANOCHOAD. d nanoconjugué anti-CHO-MNP ciblant les dépôts de CHO sur les plaques amyloïdes

La BHE représente l'une des barrières biologiques les plus exclusives rencontrées dans le traitement et le diagnostic des maladies neurologiques, restreignant l'accès de la plupart des agents diagnostiques et thérapeutiques au cerveau par voie systémique [22, 23]. Par conséquent, le défi du diagnostic et du traitement d'un grand nombre de troubles cérébraux est de surmonter la difficulté d'administrer des agents thérapeutiques et de contraste via la BHE pour cibler des régions concrètes du cerveau. Heureusement, les cellules endothéliales des capillaires cérébraux présentent des mécanismes de transport spécifiques médiés par des récepteurs. Il a été documenté qu'un nombre élevé de récepteurs de la transferrine sont exprimés par les cellules endothéliales capillaires cérébrales, impliquées dans la transcytose médiée par les récepteurs via la BHE [24].

Ainsi, pour résoudre le problème du passage de l'agent de contraste par la BHE, nous proposons trois stratégies alternatives :(i) conjuguer les anti-CHO-MNPs avec la transferrine [25], ce qui lui permettrait de passer par la BHE; (ii) l'administration intranasale du conjugué anti-CHO-MNPs. La voie intranasale, non invasive et contournant la BHE, est une voie alternative pour délivrer des nanoconjugués au cerveau [26, 27]; et (iii) l'application de champs magnétiques externes pour faciliter le passage du nanoconjugué à la BHE (Fig. 2c). Cette nouvelle technique d'administration peut délivrer une dose cliniquement pertinente au cerveau (région olfactive, cortex, hippocampe…) via la BHE [28,29,30] (Fig. 1c). De plus, le passage du nanoconjugué à travers la BHE serait également favorisé à la fois par l'utilisation de MNP enrobés de PEG et par la détérioration de la BHE due à la pathologie elle-même. Le nanoconjugué reconnaîtra spécifiquement les dépôts anormaux de CHO dans les plaques séniles, par l'affinité antigène-anticorps (Fig. 1c, d). L'accumulation de nanoparticules dans les structures pathologiques du parenchyme cérébral sous forme de plaques séniles indiquerait des changements de localisation de CHO dans le parenchyme cérébral AD. Par conséquent, la présence d'anti-CHO-MNP associés aux plaques séniles montrera des signaux hypointenses en IRM pondérée en T2*, permettant la détection du CHO associé à d'autres caractéristiques établies de la MA, telles que les plaques séniles, et donc l'imagerie par résonance magnétique du cerveau CHO pourrait devenir un nouveau biomarqueur de la maladie. De plus, des modifications de l'IRM dues à une diminution de la membrane plasmique CHO sont attendues.

Conception expérimentale pour tester l'hypothèse. Premièrement, in vitro (a ) :détermination de la biocompatibilité du nanoconjugué synthétisé. Test ex vivo (b ) :test de la spécificité du nanoconjugué anti-CHO-MNPs par incubation de nanoplateforme sur des tranches de cerveau fixées de souris transgéniques 5XFAD. Études in vivo (c ) :la nanoplateforme sera injectée par voie intraveineuse ou par des voies alternatives comme administration intranasale/application de champ magnétique externe, et son efficacité (ciblage) sera évaluée par IRM

L'élimination de l'agent de contraste du parenchyme cérébral pourrait être accomplie par l'internalisation des MNP par les cellules microgliales et leur traitement lysosomal ultérieur, comme démontré dans des études précédentes [16, 31, 32]. Les MNP seront éliminés par les voies courantes utilisées pour le métabolisme du fer endogène. Néanmoins, les voies d'élimination des agents de contraste, en fonction de leur taille et de leur charge de surface, et leur toxicité potentielle seront déterminées lors de l'élaboration de l'hypothèse proposée, comme détaillé ci-dessous.

Test de l'hypothèse

Synthèse et caractérisation de nanoparticules magnétiques

La synthèse de nanoparticules d'oxyde de fer sera réalisée selon une méthode de co-précipitation contrôlée, en mélangeant des ions ferreux (Fe2+) et ferriques (Fe3+) en solution alcaline suite aux travaux de Predescu et al. [33]. Les MNP seront recouverts d'une coque PEG suivant le protocole précédemment établi par Liu et al. [34].

La structure, la morphologie et le magnétisme des nanoparticules de fer recouvertes de PEG seront étudiées par diffraction des rayons X (XRD), microscopie électronique à balayage (MEB), microscopie électronique à transmission (MET), spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) et magnétométrie par dispositif d'interférence quantique supraconducteur (SQUID).

Après caractérisation du nanomatériau magnétique synthétisé, il sera fonctionnalisé avec (1) la protéine streptavidine par la méthode NHS/EDC. Après cela, il sera couplé à un anticorps anti-CHO biotinylé et (2) à la protéine transferrine. La conjugaison de la transferrine sera réalisée en couplant le groupe carboxylique présent à la surface du ligand et le groupe hydroxyle présent sur le revêtement PEG [35].

Tests in vitro

Dans un premier temps, la biocompatibilité de la nanoplateforme sera testée in vitro (Fig. 2a). Le nanoconjugué sera ajouté à des co-cultures de neurones et d'astrocytes et à des cultures de cellules endothéliales [36] pour déterminer la compatibilité du nanoconjugué avec des cellules cérébrales typiques. Si la cytocompatibilité des MNP fonctionnalisées est correcte, l'efficacité du système sera testée dans un modèle ex vivo de la maladie (Fig. 2b). Le modèle sélectionné est une souris double transgénique APP/(préséniline-1) PS1 qui co-exprime cinq mutations familiales de la MA (5XFAD) et présente une pathologie de la plaque amyloïde similaire à celle trouvée dans la MA [37].

L'accumulation de CHO autour des plaques séniles dans le modèle transgénique 5XFAD sera évaluée par immunohistochimie.

Si le modèle est valide, une fois démontrée l'accumulation de CHO dans les plaques séniles, il est proposé de tester la spécificité du nanoconjugué synthétisé. Pour cela, d'abord, des tranches de cerveau fixées seront obtenues à partir des souris transgéniques 5XFAD, puis, on tentera sur elles l'union du nanoconjugué, en incubant les anti-CHO-MNP sur les sections de cerveau fixées de souris 5XFAD. La spécificité du nanoconjugué sera déterminée, en évaluant la colocalisation des anti-CHO-MNP avec les dépôts CHO et les plaques séniles présentes dans les coupes cérébrales 5XFAD, en effectuant les contrôles appropriés. Dans le cas où aucune accumulation évidente de cholestérol dans 5XFAD n'a été détectée, une mutation suédoise alternative sur le modèle murin de la protéine précurseur amyloïde (APP_sw ), modèle murin de MA, sera utilisé, car dans ce modèle, une accumulation de CHO clairement associée à des plaques amyloïdes a été décrite dans l'hippocampe [9].

Tests in vivo

Une fois la spécificité du conjugué démontrée, les analyses de biocompatibilité du nanocojugué in vivo seront réalisées. La nanoplateforme serait injectée par voie intraveineuse à différentes doses (allant de 25 à 100 mg/kg [38]) (Fig. 2c), et la toxicité subaiguë au cours de l'étude sera analysée en observant la mortalité, les signes d'atrophie , congestion, inflammation ou tout changement brutal de comportement chez la souris. Le coefficient de poids de chaque organe sur le corps sera calculé. La toxicité rénale sera déterminée par les niveaux d'azote uréique et de créatinine dans le sang. Les taux de bilirubine totale et de phosphatase alcaline dans le sang pourraient être testés comme mesure de la fonctionnalité hépatique et biliaire. De plus, les niveaux d'acide urique et des études hématologiques pour évaluer les changements dans les niveaux de globules rouges, de globules blancs et d'hémoglobine seront déterminés. Enfin, afin de rechercher plus en détail d'éventuels effets toxiques, un examen histologique de divers tissus (rein, foie, rate, cerveau ou poumons) sera réalisé [39]. La localisation des MNP fonctionnalisés dans le sang, l'urine et différents organes serait analysée à 24h, 72h, 1 semaine, 2 semaines et 1 mois après l'injection des anti-CHO-MNPs.

Une fois la concentration appropriée de MNP déterminée, la nanoplateforme sera injectée dans des souris témoins et 5XFAD, et son efficacité sera évaluée par IRM (Fig. 2c). Si l'anticorps de la nanoplateforme ne reconnaît pas l'antigène dans le système in vivo, les MNP pourraient être fonctionnalisés avec du cholestérol phényl-diyne, un composé qui, dans des études précédentes, s'est avéré capable de se lier aux accumulations de CHO in vivo [40] . La biocompatibilité de ce nanoconjugué sera évaluée comme décrit ci-dessus pour le nanoconjugué MNP-CHO. Si la voie d'administration intraveineuse n'est pas efficace pour traverser la BHE, il est proposé des voies d'administration alternatives comme l'administration intranasale ou l'application de champs magnétiques externes (Fig. 2c).

Implications de l'hypothèse

L'utilisation de MNP biofonctionnalisées pour détecter la MA in vivo par IRM a été largement démontrée dans de nombreuses études antérieures, en conjuguant les MNP à différents peptides :Aβ 1-40 [41], Aβ1-30 [42], Aβ1-42 [15] , et des anticorps anti-Aβ-1-42 [43]. Après administration intraveineuse dans des modèles animaux de MA, des plaques séniles et des dépôts amyloïdes vasculaires (angiopathie congophile) ont été détectés par IRM. Cependant, ces nanoconjugués sont toxiques en eux-mêmes puisque les fragments du peptide amyloïde utilisés sont neurotoxiques (Aβ1-40, Aβ 1-42). De plus, en raison de leur taille, ils nécessitent la co-administration de composés qui facilitent leur passage dans la BHE.

NANOCHOAD fonctionnerait comme un agent de contraste qui permettrait la localisation simultanée de deux biomarqueurs spécifiques de la MA :les plaques amyloïdes et la perte de CHO dans la substance blanche du cerveau [44], évitant ainsi la toxicité. En raison de la présence de PEG dans sa structure, il faciliterait également le passage de la nanoplateforme à travers BBB [43].

Comme on peut le voir, la plupart des études de ces caractéristiques sont orientées vers la détection des plaques séniles, l'un des principaux biomarqueurs de la MA mais pas le seul. Récemment, un article dans lequel des dépôts de ferritine et donc de fer ont été détectés par des nanoconjugués à base de MNP a été publié [16]. Cependant, cet agent de contraste pour la détection de la ferritine a une faible sensibilité puisqu'il n'est pas détecté par IRM et uniquement par quantification à des endroits précis du cerveau. La perte de substance blanche dans le cerveau est un phénomène massif [44], non localisé; par conséquent, on pense que l'agent de contraste proposé pourrait être plus sensible pour la détection précoce des biomarqueurs de la MA. Il est nécessaire de promouvoir le développement de nouveaux agents de contraste capables de détecter efficacement d'autres biomarqueurs associés à la MA aux premiers stades de la maladie.

D'autre part, la composition du nanoconjugué proposé pourrait résoudre deux des principaux obstacles pour surmonter l'efficacité des agents de contraste injectés par voie intraveineuse :la stabilité colloïdale dans la circulation sanguine et la capacité à traverser avec succès la BHE pour atteindre la cible. La fonctionnalisation de la nanoplateforme avec des chaînes PEG assurera la stabilité colloïdale des nanoconjugués dans la circulation sanguine [15, 21]. D'autre part, comme stratégie pour traverser la BHE, la conjugaison des MNP avec le peptide transferrine [25] facilitera la reconnaissance de la transferrine par des récepteurs spécifiques situés dans la BHE permettant au nanoconjugué de traverser la BHE et de se lier à sa cible finale. . Ce fait combiné à la taille réduite du nanosystème et à l'altération de la BHE chez les patients atteints de MA faciliterait le passage du nanoconjugué à travers la BHE.

En raison de la nouveauté dans la conception du nanoconjugué décrit, il sera nécessaire d'étudier en profondeur la biocompatibilité et la dose administrée de la nanoplateforme, notamment pour déterminer les voies d'élimination de l'agent de contraste de l'organisme.

Abréviations

AD :

Maladie d'Alzheimer

BBB :

Barrière hémato-encéphalique

CHO :

Cholestérol

MI :

Imagerie moléculaire

MNP :

Nanoparticules magnétiques d'oxyde de fer

IRM :

Imagerie par résonance magnétique

PEG :

Polyéthylène glycol