Système d'administration de médicament à double réponse photothermique/pH de rGO modifié par HBP à terminaison amino et la thérapie chimio-photothermique sur des cellules tumorales

Introduction

La thérapie photothermique (PTT) sous irradiation proche infrarouge (NIR) a attiré une attention croissante pour l'inhibition de la tumeur, en raison du faible effet secondaire et des propriétés invasives minimales [1]. La lumière NIR (700 ~ 1100 nm) pénètre plus profondément dans les tissus corporels sans beaucoup d'absorption ni aucun dommage aux tissus ou aux cellules sains [2, 3]. Ainsi, sous irradiation laser NIR, l'agent photothermique peut augmenter la température dans l'emplacement implanté via sa capacité de conversion photothermique. De plus, l'agent photothermique appliqué nécessite une bonne biocompatibilité, une efficacité de conversion photothermique et une stabilité.

Pour les recherches de ces dernières années, une variété de matériaux ont été conçus et préparés pour guérir les tissus tumoraux en tant qu'agents PTT, tels que les métaux précieux (nanotiges d'or [4], nanoplaques d'or [5]), les nanomatériaux semi-conducteurs (CuS [6], MoS₂ [7], FeS [8]), des matériaux organiques (polydopamine [9], nanoparticules de polypyrrole [10]), des nanomatériaux de carbone (nanotube de carbone [11], nanoparticules de carbone [12] et graphène [13]). En tant que type de nanomatériau de carbone prometteur, le graphène a été largement utilisé dans l'inhibition des tumeurs par la méthode PTT en raison de ses nanofeuilles bidimensionnelles spéciales, qui obtiennent une surface spécifique ultra-élevée et un grand potentiel pour une efficacité élevée de chargement de médicament [14, 15]. Cependant, l'oxyde de graphène réduit (rGO) préparé via des méthodes normales, y compris l'urée et l'hydrate d'hydrazine, le processus hydrothermal montre toujours une forte hydrophobie, ce qui n'est pas bénéfique pour l'application dans le phénomène de l'eau des tissus corporels [16].

Dans ce cas, nous avons proposé une nouvelle idée d'utiliser un polymère hydrosoluble avec une capacité réductrice pour préparer rGO hydrophile. Dans nos travaux précédents, nous avons synthétisé un polymère hyperramifié à terminaison amino (NHBP) et essayé de l'utiliser pour traiter des nanoparticules d'oxyde métallique et préparer des nanosphères métalliques, qui sont hautement hydrophiles sans agglomération évidente, telles que les nanoparticules d'argent modifiées par HBP et son application en anti -champ de bactéries [17, 18].

Afin d'améliorer la capacité d'inhibition des tumeurs, des médicaments antitumoraux sont généralement chargés sur des agents photothermiques pour fabriquer un système chargé de médicaments [19]. D'une part, l'agent photothermique peut présenter un effet PTT sous irradiation laser NIR. D'un autre côté, la température élevée peut accélérer la vitesse d'administration du médicament en raison de la vitesse de mouvement moléculaire améliorée. Ainsi, l'agent photothermique chargé de médicament peut exercer un effet de thérapie synergique chimio-photothermique sur l'inhibition de la tumeur [20, 21]. Ici, nous avons utilisé du HBP à terminaison amino pour préparer du rGO hydrophile (NrGO, Fig. 1), et les propriétés physico-chimiques ainsi que la capacité photothermique ont été caractérisées. Ensuite, un médicament anti-tumoral (doxorubicine, DOX) a été incorporé sur NrGO, puis le comportement d'administration du médicament dans différentes conditions et l'efficacité d'inhibition de la tumeur ont été testés in vitro.

Illustration schématique de la préparation et de la thérapie chimio-photothermique de DOX@NrGO

Méthodes/Expérimental

Matériaux

L'oxyde de graphène (GO, 0,8 à 1,2 nm d'épaisseur et 0,5 à 5 µm de largeur) a été fourni par XFNANO Co., Ltd. Les DOX ont été achetés auprès de HuaFeng United Technology Co., Ltd. Milieu d'Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, bovin fœtal le sérum (FBS), la trypsine, la pénicilline (100 U/ml) et la streptomycine (100 μg/ml) ont tous été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific Inc. Méthyl thiazolyl tétrazolium (MTT), 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI ) et l'iodure de propidium (PI) ont été obtenus auprès de Beyotime Biotechnology Co., Ltd. Tous les autres réactifs ont été achetés auprès de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. sans autre purification.

Préparation du polymère hyperramifié à terminaisons aminés (NHBP)

Le polymère hyperramifié à terminaison amino a été synthétisé comme dans nos travaux précédents [16]. De la tétraéthylènepentamine (94 ml, 0,5 mole) a été ajoutée à un ballon en verre à fond rond à trois cols de 250 ml équipé d'une protection contre l'azote gazeux et d'une agitation magnétique. Le mélange réactionnel a été agité avec un agitateur magnétique chauffant et refroidi avec un bain de glace, tandis qu'une solution d'acrylate de méthyle (43 ml, 0,5 mole) dans du méthanol (100 ml) a été ajoutée goutte à goutte dans le ballon. Ensuite, le mélange a été retiré du bain de glace et laissé sous agitation pendant 4 h supplémentaires à température ambiante. Le mélange a été transféré dans un ballon en forme d'aubergine pour une évaporation rotative automatique sous vide, et la température a été élevée à 150 °C à l'aide d'un bain d'huile, et laissée pendant 4 h jusqu'à ce qu'une échelle HBP visqueuse jaunâtre soit obtenue avec un poids moléculaire moyen en poids d'environ 7759 .

Préparation du GO NHBP-Réduit (NrGO)

Le GO a d'abord été dispersé dans de l'eau déminéralisée et mélangé aux ultrasons avec du HBP approprié (le rapport pondéral du GO et du NHBP est de 1:10, 1:20 et 1:30) pendant 10 min, maintenu sous agitation et mis à réagir à 90 °C pendant 1 h. Ensuite, le résultat (marqué comme NrGO-10, NrGO-20 et NrGO-30) a été centrifugé et lavé trois fois avec de l'eau déminéralisée.

Préparation de NrGO DOX-Loaded (DOX@NrGO)

La suspension de NrGO telle que préparée a été dispersée dans une solution de DOX avec un rapport pondéral de 1:1, et maintenue sous agitation pendant 24 h à température ambiante. Ensuite, la solution composite a été centrifugée et lavée pour collecter DOX@NrGO.

Mesures

La morphologie de surface a été caractérisée par microscopie électronique à transmission (TEM, JEM-2100, JEOL, Japon). Une spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR, Nicolet iS10, Thermo Scientific, America) a été réalisée pour illustrer le changement de composant chimique entre GO et NrGO. Tous les spectres ont été mesurés dans une plage de longueurs d'onde de 400 à 4000 cm ⁻¹ avec une résolution de 4 cm ⁻¹ . Le potentiel de surface et la taille des particules ont été étudiés à l'aide d'un analyseur granulométrique potentiel Zeta (NanoBrook 90plus Zeta, Brookhaven, États-Unis). L'absorption de NrGO dans la région NIR a été étudiée par UV-vis (Evolution 300, Thermo Fisher, USA) avec une gamme de longueurs d'onde de 400~900 nm et une résolution de 1 cm ⁻¹ .

Les propriétés photothermiques ont été mesurées en utilisant un dispositif laser NIR (SFOLT Co., Ltd., Shanghai, Chine) et un thermomètre à thermocouple (DT-8891E, Shenzhen Everbest Machinery Industry Co., Ltd., Chine). La propriété photothermique de NrGO a été mesurée sous irradiation laser à 808 nm. La zone du spot du laser est d'environ 0,25 cm ² , et le changement de température de la suspension de l'échantillon testé a été surveillé en temps réel. Ici, de l'eau pure et une suspension GO ont été appliquées en tant que groupes témoins :(1) 0,2 ml d'eau pure, GO et suspension NrGO (NrGO-10, NrGO-20 et NrGO-30) ont été placés dans un tube Eppendorf de 0,25 ml, puis NIR le laser a été irradié avec une densité de puissance de 1 W/cm ² pendant 5 minutes ; (2) 0,2 ml de suspension NrGO-30 avec différentes concentrations (100, 200 et 300 μg/ml) a été irradié (1 W/cm ² ) pendant 5 minutes ; (3) 0,2 ml de suspension NrGO-30 (200 μg/ml) a été irradié avec différentes densités de puissance (1, 1,5 et 2 W/cm ² ) pendant 5 minutes ; (4) 0,2 ml de suspension NrGO-30 (200 μg/ml) a été irradiée (1 W/cm ² ) pour trois cycles marche/arrêt.

Le DOX@NrGO collecté a été divisé en trois groupes pour un traitement différent afin d'étudier le comportement d'administration du médicament :(1) dispersion dans une solution de PBS avec un pH =7,4, marqué comme groupe témoin ; (2) dispersion dans une solution de PBS à pH =4,0, marqué comme groupe acide; (3) dispersion dans une solution de PBS avec pH =7,4 et irradié avec un laser NIR, marqué comme groupe NIR. Les trois groupes ci-dessus (chaque groupe a été placé trois parallèles) ont été placés dans un sac de dialyse (5 ml) avec un poids moléculaire de coupure de 8000, puis placés dans un tube à centrifuger avec 20 ml de solution PBS correspondante. Après cela, tous les tubes ont été placés dans un agitateur à 37 °C avec 100 tr/min, 10 ml de solution de PBS de chaque tube ont été retirés à des moments prédéterminés pour l'analyse de la libération du médicament, et un volume égal de PBS frais correspondant a été rajouté. De plus, le groupe NIR a été traité comme cette lumière NIR a été irradiée pendant 5 minutes après chaque point de temps prédéterminé. Toutes les solutions retirées ont été analysées par spectrophotométrie UV-vis et le profil d'administration du médicament a été obtenu.

La cytotoxicité de NrGO contre les cellules tumorales (HeLa) a été étudiée par dosage MTT. Brièvement, les cellules HeLa ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à une densité de 5 × 10 ³ cellules par puits et ont continué à incuber jusqu'à ce que 80 % du puits soit recouvert. Ensuite, l'ancien milieu a été changé en milieu frais avec NrGO (3,125, 6,25, 12,5, 25 et 50 μg/ml), le milieu sans NrGO a été défini comme groupe témoin. Après incubation pendant 24 et 48 h, le test MTT a été utilisé pour mesurer la viabilité cellulaire relative via l'Eq. (1) :

où OD_échantillon et OD_contrôle représentait l'absorbance mesurée des cellules traitées avec NrGO dans différentes concentrations et groupes de contrôle, respectivement.

Ensuite, la thérapie synergique chimio-photothermique a été étudiée en traitant les cellules HeLa avec DOX@NrGO (3,125, 6,25, 12,5, 25 et 50 μg/ml) sous irradiation NIR. Après incubation avec DOX@NrGO pendant 4 h, les cellules HeLa ont été irradiées avec un laser NIR pendant 5 min et maintenues en incubation pendant 20 h supplémentaires. Par la suite, la viabilité cellulaire a été à nouveau testée via un test MTT. Pour l'observation des cellules, les cellules HeLa ont ensuite été colorées au DAPI et au PI, respectivement, et observées au microscope CLSM et à fluorescence.

Résultats et discussion

Caractérisation physique et chimique

Après avoir réagi avec le NHBP, la solution de GO est passée du brun au noir, ce qui indique que le GO a été réduit avec succès en rGO et dispersible dans l'eau. Comme le montrent les figures 2a, b, des images MET de GO et NrGO-30 ont été présentées respectivement, alors qu'aucune crispation ou agglomération évidente n'a été découverte sur NrGO, révélant que le traitement HBP ne provoquerait aucun changement de morphologie lors de la réaction de réduction. Sur la base des spectres FT-IR de la figure 3, la courbe de transmission de NrGO-30 était très similaire à celle de NHBP. De manière significative, le pic à 1725 cm ⁻¹ de GO a disparu après la réaction de réduction, ce qui a été suggéré comme étant l'absorption des vibrations de C =O du groupe carboxy [22]. Selon la structure moléculaire de la NHBP à terminaison amino, le groupe amino réducteur a réagi avec GO et un nouveau pic FT-IR a été généré à 1633 cm ⁻¹ , qui est censé être C-N de la liaison amido. Le résultat du potentiel zêta a été présenté sur la figure 4, de toute évidence, tous les échantillons de NrGO avaient un potentiel positif tandis que GO était négatif, indiquant que le groupe carboxy de GO a réagi avec le groupe amino de HBP. Les spectres UV-vis-NIR (Fig. 5) ont été utilisés pour illustrer l'absorption NIR de NrGO ; les courbes des échantillons NrGO avec différents ratios de matières premières ont montré une tendance similaire avec une absorption élevée dans la région NIR, ce qui est bénéfique pour l'application en PTT. Alors que les solutions GO et HBP ont à peine montré une absorption dans la région NIR, suggérant la fabrication réussie d'un agent photothermique à partir de GO et NHBP. De plus, la taille nanométrique de NrGO a également été mesurée (Fig. 6), qui n'a pas montré de changement évident avec l'augmentation du rapport NHBP.

Images TEM de GO (a ) et NrGO (b ). L'image en médaillon est une photographie optique correspondant à la dispersion de l'échantillon avec une concentration de 1 mg/ml

Spectres FT-IR de GO, NrGO et NHBP

Test de potentiel Zeta des échantillons GO et NrGO

Spectres UV-vis-NIR des échantillons GO, HBP et NrGO

Mesure nanométrique d'échantillons NrGO

Mesure des propriétés photothermiques

Sur la base du NrGO obtenu, les propriétés photothermiques ont été étudiées sous irradiation laser à 808 nm. Comme le montre la figure 7, les courbes de chauffe de l'eau, GO et NrGO présentent une tendance différente. La température de l'eau pure n'a presque pas augmenté, et le GO n'a augmenté que de moins de 5 °C, tandis que le NrGO s'est amélioré jusqu'à 40 °C et NrGO-20 et NrGO-30 ont même atteint plus de 45 °C. NrGO pourrait absorber le laser NIR pour déclencher un comportement photothermique, et l'efficacité de la conversion photothermique a été améliorée avec l'augmentation du rapport HBP ; par conséquent, NrGO-30 a été choisi pour compléter l'enquête suivante. Comme illustré sur les Fig. 7b, c, la température atteinte a été augmentée avec la concentration de NrGO ou l'augmentation de la puissance du laser, et ce dernier facteur a été plus fortement affecté. 41-43 °C s'est avéré approprié dans l'inhibition des cellules tumorales avec peu d'effet négatif sur les cellules normales ; ainsi, le NrGO préparé pourrait répondre aux exigences du PTT dans un faible dosage et une poudre laser. Ensuite, la stabilité photothermique a été testée et a montré sur la Fig. 7d, il n'y a pas de différence évidente après trois cycles marche/arrêt. Ainsi, NrGO a obtenu de grandes propriétés photothermiques dans la région NIR. Pour confirmer la stabilité d'absorption de NrGO avant et après l'irradiation laser NIR, les spectres UV-vis ont été montrés sur la Fig. 8. De toute évidence, la courbe n'a pas changé après l'irradiation NIR, révélant que l'irradiation NIR n'affecterait pas l'absorption de NrGO.

Mesure des propriétés photothermiques. un Courbes de chauffe des échantillons d'eau, GO et NrGO (200 μg/ml) sous irradiation laser à 808 nm (1 W/cm ² ). b Courbes de chauffe du NrGO-30 avec différentes concentrations sous irradiation laser à 808 nm (1 W/cm ² ). c Courbes de chauffe du NrGO-30 (200 μg/ml) sous irradiation laser à 808 nm à différentes densités de puissance. d Courbe de changement de température de NrGO-30 (200 μg/ml) sous une irradiation laser de 808 nm pour un cycle d'irradiation de trois fois (1 W/cm ² )

Spectres UV-vis-NIR de NrGO avant et après irradiation laser NIR

Test de comportement d'administration de médicaments

Après le chargement de la DOX sur NrGO, l'expérience d'administration du médicament a été réalisée. En raison de l'environnement légèrement acide du tissu tumoral, l'influence de l'irradiation NIR et du pH a été étudiée. Ici, du PBS avec un pH de 7,4 ou 4,0 a été appliqué pour imiter le tissu normal ou tumoral, respectivement. Comme le montre la figure 9, la vitesse d'administration du médicament a été évidemment accélérée sous un faible pH et une irradiation NIR. D'une part, le groupe aminé de NrGO serait ionisé à faible pH, puis la force de répulsion entre la DOX et les groupes aminés ionisés serait améliorée dans des conditions de faible pH, ce qui accélérait l'administration du médicament et montrait une sensibilité au pH. En outre, la bonne solubilité de la DOX dans des conditions de faible pH pourrait également augmenter le taux d'administration du médicament [23]. D'autre part, avec l'irradiation laser NIR, la température locale a été augmentée et la vitesse de mouvement moléculaire a été accélérée. Ainsi, le DOX@NrGO était sensible au pH/photothermique dans le comportement d'administration du médicament, ce qui est bénéfique pour contrôler le taux d'administration du médicament dans le tissu tumoral et a exercé une thérapie synergique chimio-photothermique.

Profils de libération de médicament in vitro de DOX@NrGO dans différentes conditions

Cytotoxicité de NrGO

La biocompatibilité est la propriété de base requise dans les biomatériaux ; ainsi, la cytotoxicité de NrGO avec une concentration différente a été initialement testée au cours d'une expérience in vitro via un test MTT. Comme le montre la Fig. 10a, les résultats du test MTT sur 24 h ont indiqué que la viabilité cellulaire restait supérieure à 80 % lorsque la concentration de NrGO atteignait 50 μg/ml, ce qui peut prouver que NrGO était bien biocompatible et considéré comme un agent PTT biocompatible prometteur dans la tumeur. inhibition.

un Test de cytotoxicité de NrGO à différentes concentrations pendant 24 h et 48 h. b Investigation de l'inhibition des cellules tumorales de DOX@NrGO avec différents traitements

Inhibition synergique de DOX@NrGO sur les cellules tumorales

Sur la base de la biocompatibilité de NrGO, l'efficacité d'inhibition tumorale de DOX@NrGO a été étudiée in vitro. Afin d'examiner l'influence du comportement photothermique, le laser NIR a été irradié sur les cellules tumorales correspondantes pendant 5 min avec une densité de puissance de 0,5 W/cm ² . Comme le montre la figure 10b, lorsque les cellules tumorales ont été traitées avec DOX@NrGO pendant 24 h, la viabilité diminuait manifestement avec l'augmentation de la concentration, révélant que la DOX libérée pouvait inhiber la prolifération des cellules tumorales. De plus, la viabilité diminuait beaucoup plus rapidement lorsque l'irradiation NIR était également appliquée, ce qui indique que la température élevée et le taux de libération de DOX pourraient jouer un rôle dans la thérapie synergique chimio-photothermique.

Après coloration au DAPI, les cellules ont été observées au microscope confocal à balayage laser (CLSM), le noyau a été coloré en bleu et les images des différents traitements ont été affichées sur les figures 11a–c, respectivement. Les cellules cultivées avec NrGO étaient étalées en grande quantité (Fig. 11a) sur la plaque de culture, tandis que leur nombre diminuait lorsqu'elles étaient traitées avec DOX@NrGO (Fig. 11b), révélant que la DOX libérée pouvait inhiber la prolifération tumorale. De manière significative, les cellules tumorales dans la région d'exposition au laser NIR ont été efficacement détruites et sont tombées, ce qui a entraîné une zone sombre sur l'image (Fig. 11c).

Images CLSM de noyaux cellulaires colorés au DAPI (bleu) après traitement avec NrGO (a ), DOX@NrGO (b ), et DOX@NrGO+NIR (c ). (× 400)

De plus, le PI a été appliqué pour observer l'inhibition des cellules tumorales après un traitement synergique chimio-photothermique, qui est une sorte de petit colorant moléculaire pour colorer les cellules mortes en fluorescence rouge. Comme le montre la figure 12, des cellules mortes rarement (point rouge sur l'image) ont été observées sur la figure 12a lorsqu'aucun traitement n'a été effectué, alors qu'après un traitement chimio-photothermique, les cellules tumorales hors de la zone d'exposition ont subi les dommages de la DOX et température élevée pour réduire davantage la viabilité cellulaire (Fig. 12b). Selon les résultats ci-dessus, DOX@NrGO s'est avéré être un candidat recherché pour le traitement des tumeurs.

Coloration PI de cellules tumorales avec différents traitements. un Contrôler. b DOX@NrGO+NIR

Conclusions

En résumé, un nouveau NrGO hydrophile a été conçu et préparé avec succès via une simple réaction de GO et de HBP à terminaison amino. Une caractérisation variée a montré que NrGO a obtenu une propriété photothermique stable et exceptionnelle. Après le chargement de DOX, l'administration du médicament a présenté un comportement à double réponse au pH et photothermique, qui pourrait être accéléré à une faible valeur de pH et à une irradiation NIR. De plus, le résultat de l'expérience cytotoxique in vitro a montré que le NrGO tel que préparé était bien biocompatible. En raison de cet avantage, les cellules tumorales pourraient être efficacement inhibées sur la base d'une thérapie synergique chimio-photothermique, et le NrGO chargé de médicaments anti-tumoraux a obtenu une application prometteuse dans le traitement des tumeurs.

Abréviations

CLSM :

Microscopie confocale à balayage laser

DAPI :

4′,6-diamidino-2-phénylindole

DOX :

Doxorubicine

DOX@NrGO :

NrGO chargé DOX

FTIR :

Infrarouge à transformée de Fourier

GO :

Oxyde de graphène

RAP :

Polymère hyperbranché

MTT :

Méthyl thiazolyl tétrazolium

NHBP :

HBP à terminaison amino

NIR :

Proche infrarouge

NrGO :

Oxyde de graphène réduit en polymère hyperramifié à terminaisons aminés

IP :

Iodure de propidium

PTT :

Thérapie photothermique

rGO :

Oxyde de graphène réduit

SEM :

Microscopie électronique à balayage

TEM :

Microscope électronique à transmission