Effets toxiques induits par les nanoparticules de zircone dans les cellules 3T3-E1 de type ostéoblaste

Introduction

Au cours des dernières décennies, l'application des nanoparticules manufacturées (NP) s'est développée dans divers domaines, tels que l'électronique, les applications biomédicales et les produits pharmaceutiques. Zircone (ZrO₂ ) Les NP sont l'un des principaux nanomatériaux utilisés pour la synthèse des réfractaires, des sables de fonderie et des céramiques. En raison de sa résistance mécanique préférable, ce matériau est également utilisé dans le domaine biomédical, notamment les biocapteurs, le traitement du cancer, les implants, les endoprothèses articulaires et la dentisterie [1, 2]. Cependant, la large application des particules a suscité des inquiétudes quant à leurs risques potentiels pour la santé et l'environnement, dont la sécurité au travail et des consommateurs est une préoccupation essentielle. Jusqu'à présent, les études toxicologiques sur le ZrO₂ Les NP sont limitées et les résultats sont controversés.

Certaines études ont rapporté que ZrO₂ Les NP ont montré une meilleure biocompatibilité par rapport à d'autres nanomatériaux, y compris l'oxyde ferrique, le dioxyde de titane (TiO₂ ), et l'oxyde de zinc (ZnO) [3,4,5,6]. En accord avec ces résultats, d'autres ont rapporté ZrO₂ La NP pouvait induire des effets cytotoxiques légers [3, 7] ou nuls [8, 9, 10], et seules quelques études ont indiqué un potentiel cytotoxique léger. Cependant, Stoccoro et al. [11] ont développé les effets toxiques du ZrO₂ NPs et TiO₂ NP enrobées ou non, ils ont découvert que toutes sortes de NP présentaient des effets toxiques à différents degrés. De plus, des changements de morphologie cellulaire et des fissures à la surface des cellules ont été observés dans une autre étude après ZrO₂ Traitement NP à des concentrations allant jusqu'à 1 mg/mL dans les globules rouges [12]. Ainsi, dans cette étude, nous avons évalué les effets cytotoxiques du ZrO₂ NPs, fournissant des informations utiles pour leur future application in vivo. Pendant ce temps, nous avons traité les cellules avec TiO₂ NPs comme groupe témoin, dont le profil toxicologique a été bien développé [13].

Des études antérieures ont montré que les NP ont été largement utilisées comme matériaux d'ingénierie tissulaire et ont la capacité d'améliorer la différenciation ostéogénique des ostéoblastes [14,15,16,17]. Un rapport a indiqué que les NP de silice (Si) pourraient inverser la perte osseuse associée à l'âge chez la souris, probablement en raison de la formation osseuse induite par les NP de Si [16]. Liu et al. [14] ont découvert que l'alliage d'acier inoxydable revêtu d'argent (Ag) NPs/poly (DL-acide lactique-co-glycolique) a une forte capacité antibactérienne et pourrait favoriser la prolifération et la maturation ostéoblastiques des cellules MC3T3-E1 in vitro. De plus, il a été rapporté que les nanotubes de carbone induisaient une calcification osseuse, résultant très probablement de leurs structures nanométriques qui sont similaires à la taille des organites intracellulaires [18].

ZrO₂ Les NP ont été utilisées comme composant principal des implants en biocéramique, en raison de leur biocompatibilité et de leur résistance à la biocorrosion [19]. Bien que la majorité des études se soient concentrées sur les propriétés avantageuses du ZrO₂ NPs, les effets biologiques néfastes sont impossibles à négliger. Par conséquent, dans cette étude, nous avons utilisé TiO₂ , en tant que groupe témoin, qui est un nanomatériau traditionnel qui a montré des propriétés physico-chimiques similaires. Nous avons cherché à étudier les effets du TiO₂ et ZrO₂ NPs sur la viabilité cellulaire, le stress oxydatif, la morphologie cellulaire et les réponses ostéogéniques des ostéoblastes MC3T3-E1 après co-culture et ainsi révéler l'ostéoinductivité du TiO₂ et ZrO₂ Traitement NP.

Matériaux et méthodes

Préparation et caractérisation des matériaux

TiO₂ NPs (numéro CAS 637262) et ZrO₂ Les NP (numéro CAS 544760) ont été achetées auprès de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) et caractérisées par microscope électronique à transmission (TEM, MFP-3D-S, Asylum Research, Santa Barbara, CA, USA) Mesures d'analyse de la taille des particules, du potentiel Zeta et de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) (Zetasizer Nano ZS, Malvern, Royaume-Uni). Les NP ont été dispersées dans de l'alcool pour la détection par MET, ce qui pourrait montrer plus clairement la morphologie et la taille des particules des NP. De plus, la taille agrégée des particules a été détectée via DLS, où un milieu de culture complet a été utilisé pour mettre en correspondance les caractères des particules appliqués en culture cellulaire. Avant le traitement cellulaire, la solution mère a été dispersée par Ultrasonic Cell Disruption System (Ningbo Xinzhi Biotechnology, Chine) pendant 30 minutes accompagnée d'un refroidissement par de la glace et diluée à différentes concentrations avec un milieu de culture complet avant les expériences cellulaires.

Culture cellulaire 3T3-E1

La lignée cellulaire 3T3-E1 (la banque de cellules de l'infrastructure de Shanghai pour la recherche et le développement publics de l'Académie chinoise des sciences médicales, Shanghai, Chine) a été cultivée dans un milieu essentiel minimum alpha (α-MEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA , États-Unis) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, Thermo Fisher Scientific, États-Unis) et 1 % d'antibiotique/antimycosique (Thermo Fisher Scientific, États-Unis). Les cellules ont été incubées à 37 °C avec 5% de CO₂ dans une atmosphère humidifiée à 95%, et le milieu de culture a été remplacé tous les deux jours.

Test de prolifération cellulaire

La viabilité cellulaire a été détectée en utilisant le test CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, ville de Kumamoto, Japon). Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à 5000 cellules par puits. TiO₂ NPs et ZrO₂ Les NP ont ensuite été ajoutées aux plaques à 96 puits à des concentrations en série de 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 et 150 μg/mL suivies d'une incubation pendant 24 et 48 h à 37 °C avec 5 % de CO2 , accompagné de N -acétyl-l-cystéine (NAC) ou non, qui ont été utilisées pour inhiber la production de ROS. Le groupe témoin n'a pas été traité. Ensuite, le test CCK-8 a été réalisé en ajoutant 110 μL de réactifs de détection à chaque puits, et les plaques à 96 puits ont ensuite été incubées pendant 2 h supplémentaires à 37 °C. Pour éviter que les NP n'interfèrent dans ce test analytique, les réactifs à tester dans les plaques à 96 puits ont été transférés dans une nouvelle plaque à 96 puits après 2 h de temps de réaction ; les NP et les cellules déposées ont été laissées dans la plaque primaire. La densité optique (DO) de chaque puits a été mesurée à une seule longueur d'onde de 450 nm avec le lecteur de microplaques (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Chaque traitement a été effectué en six répétitions.

Analyse de l'apoptose de l'annexe V par cytométrie en flux

Les cellules ont été cultivées dans une plaque à 12 puits à une densité de 30 000 cellules/puits pour la confluence. Après TiO₂ NP et ZrO₂ Traitement NP pendant 48 h, les cellules ont été lavées avec du PBS et collectées à l'aide d'un tampon EDTA exempt de trypsine. Les cellules ont été remises en suspension avec du tampon PBS à une concentration de 25 000 cellules/mL et centrifugées à 1000 ×g . Ensuite, les cellules ont été colorées avec FITC Annexine V et PI (Invitrogen™, USA) à température ambiante sans exposition à la lumière. Enfin, les cellules ont été mélangées avec 400 μL de tampon de liaison et analysées immédiatement par cytométrie en flux (BD FACSAria III, BD, Franklin Lakes, NJ, États-Unis).

Analyse de génération de ROS

La formation de ROS intracellulaires a été déterminée à l'aide du Reactive Oxygen Species Assay Kit (Beyotime, Shanghai, Chine). Brièvement, après lavage au PBS, les cellules ont été ensemencées dans une plaque 6 puits à 20 000 cellules/puits dans 2 mL de milieu de culture et traitées avec TiO₂ NPs et ZrO₂ NPs à une concentration de 0, 10, 50 et 100 μg/mL pendant 48 h, accompagnées ou non de NAC. Après traitement avec TiO₂ NPs et ZrO₂ NPs, les cellules ont été collectées et incubées avec 10 μM de DCFH-DA pendant 30 min à 37 °C et 5 % de CO₂ . Les intensités de fluorescence ont été analysées sur un BD FACSAria III (BD, Franklin Lakes, NJ, USA).

Microscopie confocale

En raison d'une grande proportion de cellules devenues apoptotiques, nous avons choisi 24 h comme moment pour observer les changements de structure du cytosquelette des cellules dans notre étude. Les cellules 3T3-E1 ont été ensemencées sur des lamelles de verre et cultivées en présence de TiO₂ NPs et ZrO₂ NPs pendant 24 h. Les cellules ont été lavées immédiatement après le traitement avec du tampon PBS trois fois et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 %, perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,1 % et bloquées avec du PBS contenant 5 % de BSA. Ensuite, les cellules ont été incubées pour la -tubuline (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, 1:4000) à 4 °C pendant la nuit et chargées avec l'anticorps secondaire lié au FITC à 37 °C pendant 1 h le lendemain laver trois fois avec du PBS. Par conséquent, le cytosquelette a été coloré à la rhodamine-phalloidine (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, 1:1000) pendant 1 h dans l'obscurité, et les noyaux ont été colorés avec Hoechst 33342 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) pendant 20 min. Les lamelles ont été examinées à l'aide d'un microscope confocal FV10i (Olympus, Tokyo, Japon).

Détection d'induction de minéralisation

Les cellules 3T3-E1 ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits à une densité de 15 000 cellules/puits. Les cellules ont été traitées avec TiO₂ NPs et ZrO₂ NPs à des concentrations de 10 et 100 μg/mL, et le milieu de culture contenant les nanomatériaux a été remplacé tous les deux jours ; les cellules ont été lavées doucement via PBS pour éliminer les nanomatériaux résiduels avant chaque changement de milieu de culture. Après une culture de 7, 14 et 21 jours en présence de TiO₂ NPs et ZrO₂ NPs, les cellules ont été colorées par du rouge d'alizarine S. En bref, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 30 min et colorées avec une solution de rouge d'alizarine S (40 mM, pH 4,1) à température ambiante pendant 20 min supplémentaires. Après trois lavages à l'eau distillée, des nodules minéralisés ont été observés au microscope optique (Olympus, Japon).

Extraction d'ARN et RT-PCR

L'ARN total a été extrait via le réactif TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Ensuite, la concentration d'ARN a été évaluée à l'aide d'un spectrophotomètre ultraviolet. L'ARN isolé a été rétrotranscrit en ADNc en utilisant un kit de réactifs RT (TaKaRa Bio, Dalian, Chine). La PCR en temps réel a été réalisée en utilisant le réactif vert SYBR (TaKaRa Bio, Dalian, Chine). Des gènes liés à l'ostéogenèse ont été détectés, notamment le facteur de transcription 2 lié au runt (RUNX2), le collagène 1α1 (Col1α1), la phosphatase alcaline (ALP), l'ostéopontine (OPN), l'ostéocalcine (OC) et la sialoprotéine osseuse (BSP). Les données ont été analysées en utilisant le 2 ^−ΔΔ méthode CT. Les amorces utilisées étaient répertoriées dans le tableau 1.

Analyse statistique

Les résultats ont été représentés par les moyennes  ± SEM. Toutes les données ont été analysées statistiquement par un test ANOVA. Le test d'homogénéité de la variance a été effectué et les tests T3 de Bonferroni et Dunnett ont été utilisés lorsque la variance égale était supposée et lorsqu'il n'y avait pas d'homogénéité, respectivement. p une valeur inférieure à 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Caractérisation du TiO₂ et ZrO₂ NP

Nous avons d'abord caractérisé le TiO₂ NP et ZrO₂ Poudres de NP par microscopie électronique à transmission (MET) et diffusion dynamique de la lumière (DLS) (Fig. 1a, b, Tableau 2). Les images MET et SEM ont révélé la forme et la taille des particules. Le TiO₂ Les NP étaient de petites sphères en forme de tige avec une taille moyenne de 25,4 ± 2,8 nm. Le ZrO₂ Les NP étaient de petites sphères en forme de tige avec une taille moyenne de 31,9 ± 1,9 nm. Pour mesurer la taille de TiO₂ NPs et ZrO₂ NPs en solution, DLS a été utilisé et les particules de TiO₂ NPs et ZrO₂ Les NP se sont étendus à 81,2 nm et 93,1 nm, respectivement, ce qui indique un effet d'agglomération. Les potentiels zêta du TiO₂ NPs et ZrO₂ Les NP étaient respectivement de 32,9 ± 5,4 mV et 42,4 ± 7,4 mV.

Caractérisations du TiO₂ et ZrO₂ NPs. TiO₂ (un ) et ZrO₂ (b ) La morphologie et la taille des NP ont été détectées par MET. (c ) La situation de co-culture de cellules 3T3 et de nanomatériaux a été observée après TiO₂ et ZrO₂ Concentrations de traitement NP de 10, 50 et 100 μg/mL. (d ) Les résultats MET ont été obtenus après TiO₂ et ZrO₂ Traitement NP pendant 1 h

Ensuite, nous avons observé la photographie des cellules 3T3 après TiO₂ NP et ZrO₂ Exposition aux NP à diverses concentrations. Nous avons constaté que les NP se répartissaient uniformément sur les cellules ou se répandaient autour. Les NP ont montré une puissante capacité d'agrégation à des concentrations élevées en raison d'une petite fraction de NP à micro-échelle observée, tandis qu'une grande masse de NP était petite à l'échelle nanométrique et se translocation probablement dans des cellules difficiles à voir (Fig. 1c). De plus, les résultats TEM des cellules après TiO₂ et ZrO₂ Un traitement NP pendant 1 h a été obtenu ; nos données ont montré que les NP pouvaient être transloquées dans des vésicules cellulaires. Pendant ce temps, certains dommages aux organites sont également observés, par exemple, un gonflement mitochondrial et une vacuole se sont produits.

TiO₂ et ZrO₂ Effets toxiques induits par le NP dans la cellule 3T3-E1

Nous avons évalué la viabilité cellulaire après TiO₂ NP et ZrO₂ Traitement NP en séries de concentrations (10, 20, 40, 60, 80, 100, 150 μg/mL). Pour TiO₂ NPs (Fig. 2a), après 24 h d'incubation, nous avons trouvé que TiO₂ Les NP étaient non toxiques à des doses plus faibles (≤ 20 μg/mL), alors qu'une diminution évidente de la viabilité cellulaire a été observée à des concentrations plus élevées (> 20 μg/mL) (p < 0,001). Une diminution plus spectaculaire de la viabilité cellulaire dans le groupe de traitement 20 μg/mL a été observée après 48 h d'incubation ; TiO₂ Les NP à la concentration de 20 μg/mL ont induit une diminution de la viabilité cellulaire (p < 0,01). De plus, des doses plus élevées de TiO₂ Les NP (> 20 μg/mL) ont montré une diminution significative de la viabilité cellulaire à 48 h (p < 0,001). Cependant, la viabilité cellulaire est restée stable lorsqu'elle est traitée avec 10 μg/mL de TiO₂ NPs pendant 48 h. De plus, pour ZrO₂ NPs (Fig. 2b), des résultats similaires ont été observés par rapport au TiO₂ les IP ; des effets toxiques plus élevés ont été observés à la concentration de 150 μg/mL pendant 48 h, où la viabilité cellulaire diminue en dessous de 50 %. Ces résultats ont indiqué que TiO₂ et ZrO₂ Les NP étaient biocompatibles à des doses plus faibles. Cependant, ces deux nanomatériaux ont montré une légère cytotoxicité à des concentrations toxiques élevées.

TiO₂ et ZrO₂ Diminution de la viabilité cellulaire induite par NP dans les cellules 3T3-E1. Les cellules 3T3-E1 ont été traitées avec TiO₂ (un ) et ZrO₂ (b ) NPs à des concentrations de 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 et 150 μg/mL pendant 24 et 48 h, puis la viabilité cellulaire a été détectée via le test CCK-8. Pendant ce temps, les changements de viabilité cellulaire ont été détectés après le traitement à la NAC, ce qui pourrait éliminer les ROS intracellulaires. Les résultats représentent les moyennes  ± SEM. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0.001, par rapport au témoin

Effets d'inhibition du NAC sur le TiO₂ et ZrO₂ Cytotoxicité induite par les NP

Nous avons ensuite détecté les effets d'inhibition de la NAC qui est un agent de piégeage des ROS. Les résultats ont montré que la NAC inhibait potentiellement TiO₂ (Fig. 2a) et ZrO₂ Les NP (Fig. 2b) ont induit la viabilité cellulaire après 24 h et 48 h de traitement. Après inhibition de la NAC, la viabilité cellulaire a été maintenue pendant 24 h à toutes les concentrations de TiO₂ et ZrO₂ Traitement NP à l'exception de la concentration la plus élevée (150 μg/mL). Bien que l'effet d'inhibition ait été légèrement diminué dans les cellules traitées avec des concentrations élevées de TiO₂ (100 et 150 μg/mL) et ZrO₂ NPs (80, 100 et 150 μg/mL) à 48 h, aucun changement important de la viabilité cellulaire n'a été observé pour des concentrations inférieures à 80 μg/mL, où la viabilité cellulaire était significativement plus élevée que celles sans NAC.

TiO₂ et ZrO₂ Génération de ROS induite par les NP dans la cellule 3T3-E1

Nous avons en outre détecté la génération de ROS après TiO₂ et ZrO₂ Exposition aux NPs dans les cellules 3T3-E1 (Fig. 3). Nos résultats ont montré que TiO₂ et ZrO₂ Les NP ont induit la génération de ROS après 24 h, qui était la plus importante à la concentration de 100 μg/mL. Il n'y a pas eu de génération de ROS significative pour TiO₂ NPs à une concentration de 10 μg/mL, tandis que ZrO₂ Les NP induisaient une puissante génération de ROS à la même concentration. Pendant ce temps, le NAC pourrait inhiber considérablement le TiO₂ et ZrO₂ Génération de ROS induite par NP dans les cellules 3T3-E1 à toutes les concentrations.

TiO₂ et ZrO₂ Génération de ROS induite par NP dans les cellules 3T3-E1. Les cellules 3T3-E1 ont été traitées avec TiO₂ et ZrO₂ Les NP à diverses concentrations pendant 48 h et la NAC (10 mM) ont été incubées simultanément, puis les niveaux de ROS dans les cellules 3T3-E1 ont été détectés. Les résultats représentent les moyennes  ± SEM. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0.001, par rapport au témoin

TiO₂ et ZrO₂ Apoptose et nécrose induites par les NP dans les cellules 3T3-E1

L'apoptose et la nécrose cellulaire ont été détectées après différentes concentrations de TiO₂ et ZrO₂ Exposition aux NP à 48 h (Fig. 4). Les points rouges situés dans le troisième quadrant représentaient les cellules normales, tandis que les points rouges situés dans le premier quadrant et le quatrième quadrant représentaient les cellules apoptotiques précoces et les cellules apoptotiques tardives ou nécrotiques, respectivement. Fait intéressant, nos résultats ont indiqué que TiO₂ et ZrO₂ Les NP pourraient induire l'apoptose de manière dépendante de la concentration et du temps. Suivre le TiO₂ Exposition aux NP pendant 48 h, aucune apoptose cellulaire significative n'a été détectée à des concentrations de 10 μg/mL ; cependant, à des concentrations de 50 et 100 μg/mL, le pourcentage de cellules apoptotiques tardives ou nécrotiques a atteint des niveaux élevés. Après le ZrO₂ Exposition NP pendant 48 h, nous n'avons pas trouvé d'apoptose cellulaire à la concentration de 10 μg/mL également, mais le pourcentage de cellules apoptotiques tardives ou nécrotiques était de 43,7% dans le groupe 50 μg/mL. Plus intéressant encore, une apoptose précoce significative a été observée (34,1%) à la concentration de 100 μg/mL après 48 h de traitement. Nous avons constaté que les niveaux d'apoptose précoce de TiO₂ Les NP étaient significativement plus élevés que ZrO₂ les IP ; cependant, les niveaux apoptotiques ou nécrotiques tardifs étaient en vers.

TiO₂ et ZrO₂ Apoptose induite par NP dans les cellules 3T3-E1. un Après que les cellules 3T3-E1 aient été traitées avec le TiO₂ et ZrO₂ NPs à diverses concentrations pendant 48 h, les niveaux d'apoptose cellulaire ont été détectés. b Les niveaux d'apoptose comprenant les niveaux d'apoptose précoce et d'apoptose tardive ont été calculés, puis les données ont effectué les statistiques. Les résultats représentent les moyennes  ± SEM. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0.001, par rapport au témoin

TiO₂ et ZrO₂ Changements morphologiques induits par NP dans les cellules 3T3-E1

Etudier les changements morphologiques des cellules 3T3-E1 après exposition au TiO₂ et ZrO₂ NPs, nous avons effectué une coloration par fluorescence suivie d'une microscopie confocale (Figs. 5 et 6). Par rapport aux cellules témoins non traitées, il n'y a eu aucun changement morphologique après 10 μg/mL de TiO₂ et ZrO₂ Traitement NP à 24 h, tandis que les cellules devenaient rondes et plus petites après 100 μg/mL de TiO₂ et ZrO₂ traitement NP. Plus intéressant encore, une légère diminution de la surface cellulaire a été observée après 50 μg/mL de TiO₂ et ZrO₂ Traitement NP, où TiO₂ a montré une diminution de la surface cellulaire plus puissante. De manière cohérente, les résultats quantitatifs ont confirmé une diminution significative de la surface cellulaire après 100 μg/mL de TiO₂ et ZrO₂ Traitement NP (Fig. 5).

TiO₂ et ZrO₂ Modifications de la surface cellulaire induites par NP dans les cellules 3T3-E1. Après que les cellules 3T3-E1 aient été traitées avec le TiO₂ (un ) et ZrO₂ (b ) NPs à des concentrations de 10 et 100 μg/mL pendant 24 h, les cellules ont été chargées de tubuline (vert), d'actine (rouge) et de Hoechst 33342 (bleu). La morphologie cellulaire a été observée sur la base des altérations des systèmes d'actine (rouge) et de tubuline (vert), et les changements de distribution de la surface cellulaire ont été calculés

TiO₂ et ZrO₂ Modifications du cytosquelette induites par NP dans les cellules 3T3. Après que les cellules 3T3-E1 aient été traitées avec le TiO₂ (un ) et ZrO₂ (b ) NPs à des concentrations de 10 et 100 μg/mL pendant 24 h, les modifications du cytosquelette ont été évaluées sur la base des altérations des systèmes actine (rouge) et tubuline (vert)

Nous avons ensuite étudié les modifications du cytosquelette des filaments d'actine et des niveaux de microtubules (Fig. 6). De même, aucune différence significative n'a été observée entre le groupe témoin et 10 μg/mL de TiO₂ et ZrO₂ Le traitement NP et les cellules des deux groupes ont révélé des structures explicites des filaments d'actine et du système de microtubules. En revanche, 100 μg/mL de ZrO₂ Le traitement par NP a induit un rétrécissement des cellules 3T3-E1, ainsi qu'un noyau de type pycnose et des filaments d'actine et des structures de microtubules condensés et peu clairs. Pour TiO₂ NPs, autant de points d'actine ont été observés, et les filaments d'actine situés au niveau de la membrane cellulaire étaient brumeux et rugueux. Pour ZrO₂ NPs, une perturbation du cytosquelette plus puissante a été détectée, et la structure de l'actine et des microtubules était rugueuse et défectueuse.

TiO₂ et ZrO₂ Minéralisation induite par NP dans les cellules 3T3

Ensuite, nous avons détecté l'état de minéralisation des cellules 3T3 par coloration au rouge alizarine et observé la formation de nodules minéralisés en microscopie optique (Fig. 7). Les cellules ont été colorées après induction ostéogénique pendant 7, 14 et 21 jours en présence de diverses concentrations de TiO₂ et ZrO₂ NPs. Nous avons constaté que les nodules minéralisés devenaient visibles après 14 et 21 jours d'induction. Il n'y avait pas de différence significative sur la minéralisation après 14 et 21 jours d'induction entre le groupe témoin et TiO₂ et ZrO₂ Traitement NP à 10 μg/mL. Cependant, une diminution de la minéralisation a probablement été observée après TiO₂ et ZrO₂ Traitement NP à 100 μg/mL, en raison du nodule minéralisé qui est devenu plus petit et flou.

TiO₂ et ZrO₂ Effets de la minéralisation induite par les NP dans les cellules 3T3. Après que les cellules 3T3-E1 aient été différenciées à l'aide d'une solution minéralisée pendant 7 j, 14 j et 21 j, accompagnée de TiO₂ (un ) et ZrO₂ NP (b ) à différentes concentrations. La coloration au rouge alizarine a été utilisée pour détecter le nodule minéralisé (flèche noire)

TiO₂ et ZrO₂ Expression induite par NP de gènes liés à l'ostéogenèse dans les cellules 3T3

Afin d'étudier le mécanisme de TiO₂ et ZrO₂ Ostéogenèse induite par NP dans les cellules 3T3, nous avons détecté les niveaux de gènes liés à l'ostéogenèse dans les cellules 3T3 après TiO₂ et ZrO₂ Traitement NP, y compris les gènes qui se sont préférentiellement régulés à la hausse au début (Runx2 , Col1α1 , et Alp ) et en retard (Opn , Ocn , et Bsp ) phases d'ostéogenèse (Fig. 8). Nous avons constaté que 10 μg/mL de TiO₂ et ZrO₂ Les NP ont induit le plus haut niveau d'expression de Runx2 après 3 jours de traitement, alors qu'au jour 7, Runx diminué au niveau le plus bas après ZrO₂ Traitement NP à 100 μg/mL. Col1α1 augmenté après 10 μg/mL de TiO₂ et ZrO₂ Traitement NP aux jours 3 et 7, tandis que pour les cellules traitées avec 100 μg/mL de TiO₂ et ZrO₂ NPs, Col1α1 d'abord augmenté de manière significative au jour 3, mais a diminué de façon spectaculaire après 7 jours. Nous avons également détecté une diminution significative de Alp expression après TiO₂ et ZrO₂ Traitement NP à 100 μg/mL pendant 3 jours.

TiO₂ et ZrO₂ Modifications des gènes liés à l'ostéogenèse induites par les NP dans les cellules 3T3. Après que les cellules 3T3-E1 aient été différenciées à l'aide d'une solution minéralisée pendant 3, 7, 14 et 21 jours, accompagnée de TiO₂ et ZrO₂ NPs à diverses concentrations. Les modifications génétiques liées à l'ostéogenèse ont été détectées par RT-PCR. Les résultats représentent les moyennes  ± SEM de trois expériences indépendantes. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0.001, par rapport au témoin

Pour les gènes régulés à la hausse dans la phase tardive de l'induction ostéogénique, les niveaux d'expression de Opn , Ocn , et Bsp augmenté significativement après 10 μg/mL de TiO₂ et ZrO₂ Traitement NP pendant 14 jours, et Opn continuellement augmenté à un niveau plus élevé au jour 21. Ces résultats suggèrent que par rapport à Ocn et Bsp , Ouvrir était un marqueur de stade ultérieur de TiO₂ et ZrO₂ Ostéogenèse induite par les NP. Fait intéressant, 100 μg/mL de TiO₂ et ZrO₂ Les NP n'ont pas réussi à améliorer l'expression de Opn , Ocn , ou Bsp au jour 14 ; de plus, ces gènes ont montré une régulation négative significative au jour 21.

Discussion

ZrO₂ Les NP étaient des composants importants dans les réfractaires, les céramiques et les appareils biomédicaux, y compris les implants, les endoprothèses articulaires et les matériaux dentaires. Jusqu'à présent, TiO₂ NPs comme l'une des autres NPs ayant des propriétés physico-chimiques similaires, de nombreuses études se sont concentrées sur ses données toxicologiques. Ils ont découvert que TiO₂ Les NP pouvaient se déplacer dans les cellules et présentaient des dommages cellulaires potentiels en raison de différentes caractéristiques physico-chimiques [20, 21]. Pendant ce temps, les données toxicologiques pour les NP de ZrO2 manquaient. Dans notre étude, nous avons considéré TiO₂ NPs comme groupe témoin et a exploré les effets toxicologiques du TiO₂ et ZrO₂ NPs sur les cellules 3T3-E1. Les propriétés physicochimiques des NP, en particulier la taille et la morphologie, sont connues pour avoir un impact efficace sur la biosécurité. Certaines études ont montré que les particules nanométriques étaient significativement plus toxiques que les particules micrométriques [22, 23]. Dans la plupart des cas, la morphologie des particules a également été signalée comme affectant la toxicité [24,25,26]. Dans notre étude, nous avons montré que TiO₂ et ZrO₂ Les NP étaient des sphères en forme de bâtonnet. Par rapport aux rapports précédents [5, 27, 28], notre TiO₂ et ZrO₂ NPs had a relatively weaker agglomeration effect in water where the particles enlarged to 81.2 and 93.1 nm in size, while we also could observe some microscale materials in culture medium after NP exposure with concentration-dependent manner, which confirm the agglomeration effect in this study even after using ultrasonic dispersion technology. However, the agglomeration effect could not inhibit the NP translocation into the cytoplasm, due to potent NPs were detected in intracellular vesicles. Organelles, like mitochondria, probably was one main target.

We have detected the viability of 3T3-E1 cells at various concentrations of TiO₂ and ZrO₂ NP treatment. Our results showed that 10 μg/mL of TiO₂ and ZrO₂ NPs is a biosafety concentration for 3T3-E1 cells. The cell viability decreased in time- and concentration-dependent manner, which implied that TiO₂ and ZrO₂ NPs were potentially cytotoxic after longer exposure of higher doses compared with other oxide metal nanoparticles, such as silicon dioxide and ZnO [4, 28, 29]. Moreover, ZrO₂ NPs showed more potent toxic effects than TiO₂ NPs in our study at high toxic concentrations.

Oxidative stress, a byproduct of outpaced ROS generation and decreased antioxidant factors, is known as one crucial factor in nanomaterial-induced cytotoxicity, and it is reported to trigger cell apoptosis through distinct mechanism [30, 31]. Furthermore, Kozelskaya et al. [12] observed that ZrO₂ NPs induced the increase of membrane microviscosity, cell morphology changes, and surface cracks on the red blood cells due to the oxidative stress. In agreement with these studies, we detected the ROS levels in 3T3-E1 cells after TiO₂ and ZrO₂ NP treatment and found that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce significant ROS generation in concentration-dependent manners, and ZrO₂ NPs induced more potent oxidative stress effects. Moreover, the elevated ROS levels could be eliminated by NAC which is a ROS scavenger. These results suggested the important role of ROS in TiO₂ and ZrO₂ NP-induced cell cytotoxicity.

Apoptosis is a type of cell death which clears the senescent and abnormal cells, so as to sustain the cell biological functions [32]. Some studies have reported that apoptosis was one of the main toxic responses after treating with oxide metal nanomaterials, such as TiO₂ , ZnO, Si, and Ag [33,34,35,36]. In our study, we found that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce apoptotic/necrotic body formation in 3T3-E1 cells in time/concentration-dependent manners, which was correlated with the decreased cell viability shown previously. Moreover, we found that when large parts of late apoptotic or necrotic cells were observed after ZrO₂ NP treatment, the cell status for TiO₂ NPs largely was early apoptosis. These phenomena applied that ZrO₂ NPs induced more rapid and potent apoptosis effects. Similarly, other studies also showed that ZrO₂ NPs induced significant apoptotic and necrotic processes in MSTO cells [4, 11].

The cytoskeleton metabolism is a dynamic biological process involving polymerization and depolymerization, which could sustain cell morphology and promote cell function. Some studies have shown that nanomaterials could affect the cell morphology and cytoskeleton system [37,38,39]. We found 3T3-E1 cells became smaller and rounded in the high-dose group of TiO₂ and ZrO₂ NPs (100 μg/mL), along with decreased cell area due to cytoskeleton disruptions. These findings were also supported by previous reports that ZrO₂ NP treatment could induce cell morphology changes in MSTO cells at higher concentration [4]. Another study showed the disrupted blood cell morphology after ZrO₂ NP treatment [12].

Alizarin red staining is a key indicator of osteogenic responses. In our study, no impact on osteogenic induction has been shown by TiO₂ and ZrO₂ NP treatment (10 μg/mL), except that cells treated with a cytotoxic dose of TiO₂ and ZrO₂ NPs (100 μg/mL) had a significant decrease of mineralized nodules due to the potential inhibition of osteoinductive properties. In addition, the expression level of osteogenesis-related genes was important biomarkers. Our results showed that lower concentration (10 μg/mL) of TiO₂ and ZrO₂ NPs promoted the expression of osteogenesis-related genes; however, TiO₂ and ZrO₂ NPs at high concentrations (100 μg/mL) could significantly inhibit gene expression for both early- and late phases of mineralization, indicating that TiO₂ and ZrO₂ NPs at high concentrations indeed inhibited osteoinductive properties. Other studies also obtained similar results; they claimed that TiO₂ NPs inhibited the osteogenesis of osteoblasts in a size-dependent manner while potentially promoted osteoclastogenic process [33]. Sengstock et al. [40] found that sub-toxic concentrations of Ag NPs and Ag ions could significantly impair the osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. More ongoing or newly initiated researches are focused on developing nanoparticles with acceptable biosafety and osteogenic potential to promote osseointegration for in vivo application [18, 41].

Conclusion

In conclusion, our data indicated that ZrO₂ NPs were nanoparticles with good biocompatibility, just like TiO₂ NPs, while they could induce toxic effects at high toxic concentrations on 3T3-E1 cells. ROS played a key role on TiO₂ and ZrO₂ NP-induced cytotoxicity, including cell viability, apoptosis and necrosis, and changes in cell morphology. Moreover, TiO₂ and ZrO2 NPs at high concentrations showed inhibitory effects on osteogenic differentiation of 3T3-E1 cells. Our findings could provide deep insights into the biocompatibility and potential application of ZrO2 NPs.

Abréviations

Ag:

Silver

ALP:

Phosphatase alcaline

Col1α1:

Collagen 1α1

DLS:

Diffusion dynamique de la lumière

FBS:

Fetal bovine serum

NAC:

N -acetyl-l-cysteine

NPs:

Nanoparticles

OC:

Osteocalcin

OD:

Optical density

OPN:

Osteopontin

PBS:

Phosphate-buffered saline solution

ROS:

Reactive oxygen species

RUNX2:

Runt-related transcription factor 2

Si:

Silica

TEM :

Microscope électronique à transmission

TiO₂ :

Titanium dioxide

ZrO₂ :

Zirconia

α-MEM:

Minimum essential medium-alpha