Effet du nano-SiO2 sur l'expression et la méthylation aberrante des gènes imprimés dans les poumons et les testicules

Contexte

Le dioxyde de silicium est un oxyde de silicium de formule chimique SiO₂ , le plus souvent trouvé dans la nature sous forme de quartz et dans divers environnements organiques [1]. Les nanoparticules manufacturées se sont répandues dans la croissance rapide et l'application de la nanotechnologie dans les industries de haute technologie. Cette nanoparticule particulière est largement utilisée dans une gamme de produits de consommation, y compris l'électronique, les produits en plastique, les matériaux médicaux, cosmétiques et de revêtement en raison de leurs propriétés scientifiques physiques telles qu'une grande surface spécifique, des sites réactifs abondants, une énergie de surface élevée, des liaisons chimiques insaturées, forte capacité d'adsorption et forte tendance à interagir avec les métaux et la matière organique, altérant ainsi les contaminants et leur transport dans l'environnement [2]. La présence de SiO₂ les nanoparticules (NP) dans une large gamme de consommables augmentent leur probabilité d'être libérées dans l'environnement et d'entrer en contact avec la population humaine.

Des études expérimentales antérieures ont montré qu'une instillation intratrachéale à dose unique ou des injections intrapéritonéales multiples d'espèces de nanoparticules de métal et d'oxyde métallique provoquent des effets toxiques du niveau cellulaire au niveau systémique et organisme [3]. Traitement de SiO₂ Les NP répriment la croissance des lignées cellulaires du cancer du sein en augmentant l'apoptose et en réduisant la motilité cellulaire. De plus, l'exposition au SiO₂ Les NPs perturbent significativement le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) [4]. Lorsque des modèles de rats ont été traités avec trois tailles différentes de TiO₂ NPs et par rapport aux témoins, le traitement au liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF) avec de gros aérosols agglomérés (> 100 nm) a induit une réponse inflammatoire aiguë, tandis que les petits aérosols agglomérés (<100 nm) ont produit des dommages importants liés au stress oxydatif et à la cytotoxicité [5].

L'étude de la toxicité des nanoparticules sur la reproduction est un domaine en pleine expansion. Une étude a démontré que sous la même dose de traitement, les NP de Ni induisaient une toxicité reproductive plus élevée en C. elegans que les Ni MP (microparticules). Ces toxicités pour la reproduction observées chez C. elegans incluaient une réduction de la taille du couvain, des œufs fécondés et une activation des spermatides [6]. Il existe de plus en plus de preuves que certains effets environnementaux peuvent être transmis à la progéniture par des voies paternelles sans modification du génome du sperme [7, 8]. L'information paternelle existe non seulement dans le génome, mais aussi dans les marqueurs épigénétiques spécifiques associés, la teneur en ARNm et l'ARN non codant.

Le stress oxydatif est un mécanisme important dans la toxicité des nanoparticules, qui peut déclencher des dommages à l'ADN, une inflammation, une dénaturation des protéines et une peroxydation lipidique [9]. Ces effets biologiques sont influencés par les propriétés physicochimiques des nanoparticules, notamment leur taille, leur surface, leur forme, leur chimie de surface, leur fonctionnalisation et leur solubilité [10, 11]. De plus en plus de preuves démontrent clairement que l'exposition aux nanoparticules peut déclencher des altérations épigénétiques dans les tissus et les cellules, même à de faibles doses non cytotoxiques [12, 13]. L'épigénétique est l'étude des modifications héréditaires de la fonction des gènes qui n'impliquent pas de modifications de la séquence d'ADN, notamment la méthylation de l'ADN, l'empreinte génétique, les modifications des histones et la régulation par des ARN non codants [14]. De telles altérations épigénétiques sont associées au développement et à la progression de nombreux états pathologiques et maladies [15]. Par conséquent, les effets épigénétiques sont un élément crucial du dépistage de l'évaluation des risques des patients au niveau cellulaire.

Le domaine imprimé Dlk1/Dio3 contient trois régions méthylées différentiellement (DMR) connues qui sont méthylées paternellement :la DMR intergénique (IG-DMR), la 3-DMR exprimée par la mère (Gtl2-DMR) et la Dlk1-DMR [16]. Des études antérieures suggèrent que l'IG-DMR dicte le statut de méthylation allélique de la Gtl2 le promoteur DMR, qui contrôle ensuite l'expression des gènes dans l'ensemble du cluster [17]. Le génome de la souris a un grand nombre de gènes imprimés dans le domaine Dlk1/Dio3 dans la région distale du chromosome 12. L'IG-DMR situé entre le gène imprimé Dlk1 et Gtl2 est spécifiquement méthylé dans la lignée germinale mâle et régule l'expression spécifique de l'allèle parental de la région du gène imprimé [18]. Le statut de méthylation de l'IG-DMR est établi avant la naissance et est donc maintenu tout au long de la vie d'un mâle dans la lignée germinale mâle pendant la différenciation des cellules germinales mâles, ce qui signifie que la méthylation de l'IG-DMR est maintenue dans les spermatogonies et les spermatocytes des testicules matures.

Notre objectif était de trouver les changements dans l'expression des gènes de la lignée germinale mâle au cours de la spermatogenèse avant le silence transcriptionnel et traductionnel afin d'expliquer l'influence paternelle sur la progéniture à travers les changements environnementaux. Les facteurs environnementaux peuvent modifier les modifications transcriptionnelles des spermatozoïdes, ce qui peut entraîner des altérations du développement de la descendance. Pour mener à bien cette enquête dans notre travail, nous avons utilisé des lignées cellulaires et des souris comme modèles de criblage des effets toxiques de SiO₂ NPs. À notre connaissance, il s'agit de la première étude démontrant les mécanismes épigénétiques des régions imprimées Dlk1/Dio3 selon lesquelles les nanoparticules causent des dommages aux tissus pulmonaires et testiculaires.

Méthodes

Animal expérimental

La manipulation des animaux a été effectuée conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire dans le cadre du protocole d'utilisation des animaux correspondant à l'Université médicale de Nanjing. Les souris ont été obtenues auprès de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Tous les animaux ont été hébergés à 23 °C avec un cycle lumineux de 12 h. De l'eau stérilisée et de la nourriture pour rongeurs ont été consommées à volonté par les souris. L'activité et le comportement des souris ont été surveillés quotidiennement. Après 2 semaines, des souris ont reçu une injection de SiO₂ de taille nanométrique 12,5 mg/kg.

Produits chimiques

SiO₂ de taille nanométrique (99,5 % sur la base des métaux traces, taille des particules de 10 à 20 nm) ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, États-Unis). Les nanoparticules ont été mises en suspension dans du milieu RPMI 1640 pour créer une solution mère, dispersées par vibration ultrasonique pendant 20 min, diluées à des concentrations appropriées et dispersées pendant 20 min supplémentaires.

Caractéristiques de SiO₂ NP

La taille et le potentiel zêta ont été enregistrés à l'aide d'un Malvern Zetasizer Nano ZSP.

Extraction d'ARN et qRT-PCR

Les échantillons de poumons et de testicules ont été congelés rapidement dans de l'azote liquide, puis stockés à 80 °C après environ 4 h. Nous avons décongelé les échantillons avant de les extraire.

L'ARN total a été isolé des échantillons en utilisant 1 mL de réactif TRIzol (Invitrogen Life Technologies Co, USA). Le mélange a été soumis aux ultrasons à une puissance de 80 % pendant 5 min, a ajouté 0,2 mL de chloroforme, puis a été centrifugé à 12 000g /min à 4 °C pendant 15 min. Ensuite, trois étapes de purification phénol/chloroforme ont été ajoutées afin de se débarrasser des protéines. Ensuite, nous avons utilisé l'absorbance UV pour mesurer la teneur en ARN et la qualité de chaque échantillon à 260 et 280 nm. Les séquences d'amorces des ARNm sont présentées dans le fichier supplémentaire 1 :Tableau S1 et S2. La qRT-PCR a été réalisée selon les instructions du fabricant, comme décrit précédemment [19]. La PCR en temps réel a été réalisée à l'aide de SYBR Green (Vazyme). Le cycle de PCR était le suivant :dénaturation initiale à 95 °C pendant 30 s, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 15 s, annelage à 60 °C pendant 15 s et extension à 72 °C pendant 30 s. La quantité de gènes cibles a été analysée à l'aide de la méthode 2^-ΔCt après normalisation avec la -actine.

Extraction d'ADN, traitement au bisulfite et PCR de séquençage au bisulfite

L'ADN a été isolé des tissus testiculaires et pulmonaires à l'aide d'un kit ADN (QIAamp DNA Mini Kit; Qiagen. No.51304; USA) en suivant les recommandations du fabricant. La conversion au bisulfite de 500 ng de tout l'ADN génomique a été obtenue à l'aide d'un kit (kit EpiTect® Bisulfite ; Qiagen. No. 59104 ; USA) suivant les recommandations du fabricant. Différents oligonucléotides de méthylation CpG ont été conçus à l'aide du logiciel Methyl Primer Express v1.0 et les séquences sont P1-F 5'-TTGGGTTTTGAGGAGT AGTA-3', P1-R 5'-ACATCCTATTCCCTAATAAAAATT-3'; P2-F 5′-TATTGGTTTGGTATATATGGATGTA-3′, P2-R 5′-ATAAAACACTTAACTCRTACCRTA-3′; P3-F 5′-TTTGTGTAGTTGTGTTATGGTATATTT-3′, P3-R 5′-ACCCATAACAAACCACAACA-3′; P4-F 5′-TTGTGGTTTGTTATGGGTAAGTT-3′, P4-R 5′-TCAAAACATTCTCCATTAACAAAA-3′.

Chaque échantillon d'ADN a été amplifié par PCR comme suit :2,5 μl 10 × PCR tampon PCR mélange réactionnel avec 500 ng d'ADN traité au bisulfite, 0,5 μl chacune d'amorces directes et inverses, 0,5 μl de mélange dNTP, 0,5 μl de rTaq (500 U, dNTP , Mg ²⁺ ) (Takara Bio, Tokyo, Japon), ajout de ddH₂ O jusqu'à un volume de 25 μl. Après activation de la polymérase à 94 °C pendant 10 min, elle a été suivie de 40 cycles de la séquence suivante :30 s à 94 °C, 30 s à 58 °C, 1 min à 72 °C et extension finale à 72 ° C pendant 10 minutes.

Culture cellulaire et traitement

Les cellules A549 ont été achetées auprès d'ATCC (Manassas, VA, USA) et ont été cultivées en 1640 additionnées de 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) à 37 °C et 5 % de CO₂ dans un incubateur humidifié. Les cellules ont été étalées sur des plaques 96 puits, incubées avec différentes concentrations de SiO₂ NP :62,5, 125, 250, 500, 1 000 et 2 000 μg/ml pendant 24 h.

Test de viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire a été évaluée par le test de prolifération CCK8. Les cellules ont été plaquées à une densité de 1,5 × 10 ⁴ par puits dans une plaque à 96 puits et incubé pendant la nuit. Après exposition au SiO₂ NPs à différentes concentrations, 100 μl de CCK8 ont été ajoutés à chaque puits, et les cellules ont été incubées pendant 30 min à 37 °C pour permettre le métabolisme de CCK8. Enfin, l'absorbance a été déterminée à 450 nm. Les taux d'inhibition cellulaire ont été calculés et transformés en IC₅₀ en utilisant SPSS 15.0.

Analyse statistique

Tous les calculs ont été effectués à l'aide du logiciel SPSS 15.0. Les comparaisons entre les groupes ont été faites à l'aide de t non liés tests et un test du chi carré de Pearson pour BSP. Les données sont présentées sous forme de moyenne  ± SD. Dans tous les cas, une valeur de p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

Caractérisation de SiO₂ NP

Nous avons caractérisé SiO₂ NPs dans des conditions expérimentales. Le rayon hydrodynamique moyen et le potentiel zêta de SiO₂ Les NP dans le milieu de culture étaient respectivement de 371,77 ± 18,46 nm et 18,83 ± 2,12 mV (Fig. 1).

Caractérisation de SiO₂ NPs en suspension. Les particules ont été mises en suspension dans un milieu de culture cellulaire avec 10 % de FBS. a, b Taille et potentiel zêta de SiO₂ Les NP ont été évaluées par Zetasizer Nano ZSP. c La viabilité cellulaire a été déterminée par dosage CCK8 après exposition à diverses concentrations de SiO₂ NPs pendant 24 h. Moyennes ± SD des expériences en double, chacune composée de trois répétitions techniques. *** p < 0.001

Effet de SiO₂ NPs sur la lignée cellulaire A549

Pour déterminer la toxicité du SiO₂ NPs, nous avons effectué un test de prolifération avec des cellules A549, pour déterminer l'IC₅₀ de SiO₂ NPs sur les cellules A549. Comme illustré dans la Fig. 1c, SiO₂ Les NP diminuent la viabilité des cellules A549 d'une manière dépendante de la concentration. La réduction de la viabilité cellulaire est significative à SiO₂ Concentration de NP supérieure à 62,5 μg/ml (p < 0,001). L'IC₅₀ 24 h d'un produit chimique est défini comme une concentration qui affecte 50 % de la cellule après 24 h d'exposition. L'IC₅₀ 24 h déterminé pour SiO₂ Le NP était de 4942 μg/ml.

Effets de SiO₂ NPs sur les poumons et les testicules murins

Nous avons déterminé si l'exposition au SiO₂ Les NP à une dose de 12,5 mg/kg de poids corporel entraîneraient des lésions de la membrane pulmonaire et même des lésions des testicules dans notre modèle murin. Comme le montrent les figures, SiO₂ L'exposition aux NP a entraîné une rupture du corps lamellaire dans les coupes histologiques du poumon (Fig. 2a, b) et une lésion des crêtes mitochondriales par rapport au groupe témoin dans les testicules (Fig. 2c, d). Nous avons ensuite étudié les effets pulmonaires et testiculaires du SiO₂ NPs sur l'activation de l'impression sur la région imprimée Dlk1/Dio3.

Images MET de tissus pulmonaires et testiculaires de rats exposés au SiO₂ NPs. un La morphologie a été évaluée dans les tissus pulmonaires par SEM chez les témoins. b La morphologie a été évaluée dans les tissus pulmonaires par SEM dans le groupe traité. c La morphologie a été évaluée dans les tissus des testicules par SEM chez les témoins. d La morphologie a été évaluée dans les tissus des testicules par SEM dans le groupe traité. Les barres d'échelle représentent 2,0 μm

Expression des gènes imprimés sur le poumon et le testicule murins

Afin d'illustrer les changements dans les poumons et les testicules, nous avons détecté les gènes imprimés dans ces tissus. Nous choisissons les 24 gènes imprimés; ils étaient Dio3 , Ddc , Dlk1 , Gpr1 , Gtl2 , H19 , Igf2, Igf2as , Igf2r , Inpp5f , Magel2 , Magi2 , Mest , Mir296 , Mir298 , Sdn , Nnat , Peg10 , Plagl1 , Pwcr1 , Rasgrf1 , Rtl1 , Snrpn , et Snurf. Treize de ces gènes sont exprimés à la fois dans les poumons et les testicules :Dio3 , Dlk1 , Gpr1 , Gtl2 , Igf2r , Igf2 , Inpp5f , Peg10, Ndn , Nnat , Rasgrf1 , Rtl1 , et Snrpn (Fig. 3a, b). Les gènes différentiellement exprimés de l'accent principal étaient sur la région imprimée Dlk1/Dio3, qui contient Dlk1 , Gtl2 , Rtl1 , et Dio3 .

Expression de gènes imprimés dans les poumons et les testicules. un L'expression des gènes imprimés dans le poumon. b L'expression de gènes imprimés dans les testicules. *P < 0,05. **P < 0,01. t de l'étudiant tester

Expression de la région imprimée Dlk1/Dio3

La région Dlk1/Dio3 imprimée contient trois gènes codant pour des protéines (Dlk1 , Gtl2 , Rtl1 , et Dio3 ) sur l'allèle hérité [20] (Fig. 4c). Élucider le rôle de la région Dlk1/Dio3 dans la réponse des tissus pulmonaires et testiculaires à SiO₂ Traitement NP, nous avons analysé le schéma de méthylation du DMR par rapport aux témoins. Différents gènes sont ciblés par méthylation dans le poumon et le testicule. L'expression du Dlk1 et Dio3 étaient régulés à la hausse dans les poumons et les testicules, tandis que Rtl1 n'était régulé à la hausse que dans les testicules (Fig. 4a, b).

L'expression de la région imprimée Dlk1/Dio3. un Les gènes de la région Dlk1/Dio3 exprimés dans le poumon. b Les gènes de la région Dlk1/Dio3 exprimés dans le testicule. c Schéma de la région Dlk1/Dio3. *P < 0,05. **P < 0,01. t de l'étudiant tester

La méthylation des régions DMR Dlk1/Dio3

Pour étudier davantage si l'expression des gènes change en réponse à la méthylation de l'ADN, nous avons examiné l'état de méthylation de cette région dans les poumons et les testicules de souris. Dans l'analyse de la méthylation de l'ADN, nous avons déterminé les séquences des trois sections d'îlots CpG. Dans les testicules, ils sont hypométhylés; cependant, dans l'îlot CpG 1, ils sont significativement hyperméthylés (Fig. 5). Dans le poumon, toute la méthylation est la même que dans le testicule, tandis que l'îlot CpG 2 montrait une hyperméthylation (Fig. 6).

La méthylation des régions Dlk1/Dio3 DMR dans les testicules. un La méthylation de CpG island 1 dans les tissus témoins et traités. b La méthylation de CpG island 2 dans les tissus témoins et traités. c La méthylation de l'îlot 3 de CpG dans les tissus témoins et traités

La méthylation des régions DMR Dlk1/Dio3 dans les poumons. un La méthylation de CpG island 1 dans les tissus témoins et traités. b La méthylation de CpG island 2 dans les tissus témoins et traités. c La méthylation de l'îlot 3 de CpG dans les tissus témoins et traités

Discussion

L'utilisation croissante des nanomatériaux a suscité des inquiétudes quant aux impacts potentiels sur la santé humaine et les impacts environnementaux. Des études antérieures ont démontré que SiO₂ Les NP peuvent provoquer des lésions pulmonaires et cardiovasculaires, telles qu'une inflammation pulmonaire et des lésions ischémiques myocardiques chez les rats âgés [21]. De plus, les nanoparticules peuvent avoir un effet sur les lignées germinales, car ces cellules semblaient plus sensibles aux effets toxiques des Ag NP et présentaient des effets indésirables après une exposition à des doses plus faibles. L'exposition à l'Ag NP a augmenté le nombre d'anomalies observées dans les cellules spermatiques de rat et a réduit l'intégrité de l'acrosome et de la membrane plasmique en plus de réduire l'activité mitochondriale [22]. Notre enquête fait partie d'une série d'études utilisant une plateforme expérimentale pour évaluer le potentiel des nanoparticules à cibler les organismes mâles et même leur progéniture non exposée.

Dans notre précédente étude in vitro, nous avons signalé qu'une exposition à court terme à certaines nanoparticules entraîne une apoptose cellulaire et une expression aberrante des gènes imprimés dans les cellules TM-4 de Sertoli. Ces résultats démontrent que l'expression anormale de gènes imprimés peut être un mécanisme sous-jacent pour que les nanoparticules induisent une toxicité pour la reproduction [23]. De plus, dans notre précédente étude in vivo, certains facteurs environnementaux, tels que les perturbateurs endocriniens, favorisent également un phénotype ou un état pathologique non seulement chez l'individu exposé mais aussi dans les générations successives de descendance. Des épimutations dans la lignée germinale qui deviennent définitivement programmées peuvent permettre la transmission de phénotypes épigénétiques transgénérationnels [19]. Le but de cette étude était d'étudier les changements apportés à l'état épigénétique par SiO₂ Traitement NP dans un modèle murin afin de jeter les bases mécanistiques des effets transgénérationnels masculins.

L'état épigénétique est un terme utilisé pour définir les modifications chimiques qui se produisent dans un génome sans changer la séquence d'ADN [24]. Les mécanismes épigénétiques, y compris la méthylation de l'ADN, les gènes imprimés, les modifications des histones et l'expression de l'ARN non codant, peuvent affecter la fonction génomique dans un environnement exogène [25]. A notre connaissance, notre étude est la première à étudier SiO₂ NPs induisant une toxicité pulmonaire et testiculaire au niveau épigénétique.

Nous avons d'abord examiné la toxicité aiguë du SiO₂ NPs dans les cellules A549, une lignée cellulaire épithéliale pulmonaire humaine. Cependant, nos découvertes chez des souris expérimentales ont révélé une lésion des cellules épithéliales pulmonaires laminaires de type II et une lésion de la crête mitochondriale testiculaire après contact avec SiO₂ NPs à des concentrations environnementales [26]. Afin de mieux comprendre le mécanisme de la pathologie pulmonaire et testiculaire, nous avons exprimé des gènes imprimés. L'empreinte génomique fait référence au silence d'un allèle parental dans les zygotes des gamètes en fonction du parent d'origine ; ce silence se produit via des processus épigénétiques tels que la méthylation de l'ADN et/ou la modification des histones [27]. Des études antérieures ont montré que l'expression des gènes imprimés dans le domaine Dlk1/Dio3 est importante pour la croissance fœtale [28], le moment de la puberté humaine [29] et la susceptibilité aux maladies métaboliques [30]. Des études ont suggéré que l'IG-DMR dicte le statut de méthylation allélique du promoteur Gtl2 DMR, qui contrôle ensuite l'expression des gènes dans toute la région Dlk1/Dio3 [17]. La fonction principale de cette région de contrôle imprimée est d'hériter de la méthylation de l'ADN induite par les cellules germinales en tant que signal gamétique, et plus tard de maintenir les modèles de méthylation de l'ADN spécifiques à l'allèle dans les cellules somatiques [31]. Notre étude a démontré que SiO₂ Les NP induisent des modifications de l'expression de la région Dlk1/Dio3 à la fois dans les tissus pulmonaires et testiculaires. Dans la région Dlk1/Dio3, les gènes paternels exprimés (Dlk1 , Rtl1 , et Dio3 ) sont particulièrement anormaux par rapport aux témoins après traitement par NP. Les résultats du séquençage au bisulfite affichent différents niveaux d'hypométhylation dans les poumons et les testicules. L'état de méthylation de l'IG-DMR est généralement plus faible dans les tissus traités, et cette hypométhylation peut représenter le mécanisme d'expression différentielle des gènes imprimés.

Conclusions

En conclusion, nos résultats indiquent que SiO₂ L'exposition aux NP peut induire d'importants changements de méthylation de l'ADN qui déclenchent des dommages cellulaires et que ces changements sont très importants pour l'expression du groupe de gènes imprimés Dlk1/Dio3. Il est important de noter que les changements dans la méthylation de l'ADN affectent à la fois les tissus pulmonaires et testiculaires. Ces résultats jouent un rôle important dans nos futures recherches examinant les effets épigénomiques des nanoparticules héritées par la progéniture des modèles exposés et la clarification des mécanismes moléculaires qui interviennent dans de telles altérations épigénétiques.

Abréviations

BALF :

Liquides de lavage broncho-alvéolaire

CCK-8 :

Kit de comptage cellulaire-8

DMR :

Régions à méthylation différentielle

EGFR :

Récepteur du facteur de croissance épidermique

IG-DMR :

DMR intergénique

MP :

Microparticules

NP :

Nanoparticules