Biocapteurs plasmoniques améliorés d'un immunodosage sans marquage à base de nanoparticules d'or hybride et d'oxyde de graphène

Contexte

Matériaux à base de molécules de carbone tels que les nanotubes de carbone [1, 2], les billes de carbone (buckminsterfullerene, C60) [3], le graphène bidimensionnel [4,5,6] et l'oxyde de graphène (GO) [7,8,9 ,10,11] ont été largement utilisés dans les biocapteurs. Parmi eux, la structure en feuille bidimensionnelle du graphène est un matériau idéal pour permettre des films minces avec une conductivité élevée [12, 13] et d'excellentes caractéristiques de perméabilité optique [14] et une biocompatibilité élevée [15, 16]. Pour ces raisons, le matériau à base de graphène est largement utilisé dans la technologie de détection biomédicale et électrochimique [17, 18]. De plus, le type photoélectrique de la technologie de détection biologique est principalement basé sur GO [19,20,21]. Parce que les groupes oxyde peuvent être ajustés pour absorber et émettre une bande interdite lumineuse [22, 23], il est couramment utilisé en fluorescence [24], résonance plasmonique de surface (SPR) [8,9,10,11, 19,20,21 ] et la technologie de détection par résonance plasmonique de surface localisée (LSPR) [25, 26]. En particulier, GO possède des groupes fonctionnels chimiques uniques (ponts époxy, groupes hydroxyle, groupes carboxyle par paires (carboxyle et carbonyle)) qui améliorent l'affinité et la liaison covalente des biomolécules.

La synthèse de graphène combiné à des nanoparticules (telles que Pt, Au, Ag, Pd et ZnO) a été largement étudiée pour le développement de nouvelles technologies nanocomposites. En particulier, l'utilisation de nanoparticules d'or (AuNPs) a été utilisée comme mécanisme pour le transfert d'énergie de la spectroscopie colorimétrique et d'absorption. De plus, au cours de la dernière décennie, les recherches sur les AuNP dans la lumière visible ont mis en évidence les caractéristiques uniques de la résonance plasmonique. Étant donné que l'ajustement de la taille et de la forme des AuNPs peut modifier le décalage de longueur d'onde d'absorption optique, les AuNPs peuvent être utilisés pour améliorer l'absorption du plasma et l'amplification du signal [27, 28]. Par conséquent, les AuNP ont été largement utilisées dans un large éventail d'applications telles que les composants optoélectroniques en raison de leurs propriétés optiques et optoélectroniques spéciales pour améliorer l'extraction de la lumière [29, 30] et les réactions d'absorption de la lumière [31, 32, 33]. De plus, les AuNPs sont biocompatibles, et elles ont été étudiées pour leur utilisation dans la détection chimique, l'imagerie biomédicale, le traitement du cancer [34, 35], le support de médicament [32, 33], la thérapie photothermique [36,37,38], applications d'agent de contraste [39], de radiosensibilisateur [40] et de biodétection [33, 41, 42, 43].

La fonctionnalité des AuNPs a été modifiée en ajoutant l'agent de réticulation pour éviter l'oxydation et agir en tant que porteur de composés phytochimiques ou de vecteurs ; ainsi, cette combinaison peut augmenter la biocompatibilité et la bioactivité [44,45,46]. Les agents de réticulation tels que la cystamine (Cys) ou l'acide 8-mercaptooctanoïque (MOA) sont activés par des monocouches auto-assemblées de thiols à terminaison acide carboxylique (SAM) sur une surface d'Au modifiée. Le MOA se lie à la surface Au par l'intermédiaire du lieur thiol (extrémité -SH), ce qui donne des monocouches.

En outre, la recherche sur le matériau métallique plasmon a également été largement rapportée. Par exemple, il a été démontré que les nanoparticules à noyau métallique plasmonique [47], les nanoétoiles [48] et les nanoparticules d'oxyde d'étain dopé au fluor [49] améliorent la bande interdite énergétique, ce qui les rend souhaitables dans les applications de cellules solaires et de détection.

De plus, l'utilisation d'hybrides AuNP-GO basés sur la synthèse chimique [50,51,52] et l'auto-assemblage électrostatique [53] a été rapportée dans des applications de capteurs, d'énergie et catalytiques. Ces dernières années, de plus en plus de recherches se sont concentrées sur l'utilisation d'hybrides AuNP-GO dans les biocapteurs. Ces hybrides se sont avérés utiles dans le développement de la technologie de plate-forme électrochimique [54,55,56,57,58,59] et de diffusion Raman améliorée en surface (SERS) [56, 59] pour améliorer l'application dans les tests biologiques. Cependant, il n'y a actuellement aucun rapport pertinent sur l'utilisation de la technologie de biocapteur à l'œil nu ou à dosage immunologique rapide colorimétrique. Par exemple, des biocapteurs d'ADN électrochimiques basés sur des hybrides AuNP-GO ont été utilisés pour détecter des biomarqueurs du cancer du sein afin de permettre un diagnostic précoce. Avec ce biocapteur, la limite de détection (LOD) de 0,16 nM a été obtenue avec une sensibilité de 378 nA/nM pour le biomarqueur ERBB2 [54]. De plus, un aptacapteur électrochimique à base de nanocomposite à base d'oxyde de graphène à réduction pointillée AuNP (rGO-AuNP) a été utilisé pour détecter sélectivement une concentration de 3,3′4,4′-biphényles polychlorés (PCB77) entre 1 pg L ^{− 1} et 10 μg L ^− 1 , avec un LOD de 0,1 pg L ^− 1 [55]. De plus, les hybrides AuNP-GO ont été utilisés comme biocapteur électrochimique pour détecter le peroxyde d'hydrogène (H₂ O₂ ), avec des réponses dynamiques alimentaires allant de 0,1 à 2,3 mM et un LOD de 0,01 mM [57]. Un autre bon exemple est l'utilisation des hybrides AuNP-GO [56, 59] et AuNP-graphene [59] pour les biocapteurs basés sur SERS dans diverses applications, ainsi que la bio-imagerie mesurée par SERS.

Dans cette étude, nous proposons une méthode alternative de synthèse chimique et d'auto-assemblage électrostatique d'hybrides AuNP-GO en utilisant l'auto-assemblage couche par couche. Nous analysons également la sensibilité de détection biologique des feuilles AuNPs et GO combinées modifiées et leur réponse immunitaire protéique. Nous avons conçu deux types de dosages immunologiques sans marqueur protéique basés sur AuNP-GO et évalué leur temps de réponse et leur sensibilité dans les interactions antigène-anticorps. Les excellentes caractéristiques de détection des composites graphène-AuNP incluent une sensibilité ultra-élevée et l'affinité des interactions de biomolécules qui influencent la détection d'une gamme diversifiée de biomolécules avec une spécificité élevée. Ces caractéristiques impliquent que ces composites ont un rôle prometteur dans les applications futures, et le potentiel d'être la voie privilégiée de détection de maladies dans les applications de diagnostic clinique.

Méthodes/Expérimental

Matériaux

Le graphite a été acheté auprès de Graphene Supermarket (Graphene Laboratories Inc., Reading, MA, USA). Les feuilles GO ont été obtenues à partir de flocons de graphite en utilisant une méthode de Hummer modifiée [60] suivie d'un éclatement par ultrasons pendant 5 h pour une taille de flocon de 0,1 à 1 μm et une épaisseur de 1,1 nm. Dichlorhydrate de cystamine (Cys, 96 %), tétrachloroaurate d'hydrogène (III) trihydraté (HAuCl₄ ·3H₂ O), ACS, 99,99 % (base métaux) et Au 49,5 % min ont été achetés auprès d'Alfa Aesar Co. (États-Unis). Citrate de sodium (HOC(COONa)(CH₂ COONa)₂ ·2H₂ O) a été acheté auprès de J.T. Baker Chemical Co. (États-Unis). Sérum albumine bovine (BSA, SI-B4287, Sigma-Aldrich, USA), Anticorps anti-albumine bovine produit chez le lapin (antiBSA, SI-B1520, Sigma-Aldrich, USA), N -hydroxysuccinimide (NHS) et 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Inc. (USA). Les immunoglobulines (Ig) de structure d'anticorps antiBSA ont été produites par les lymphocytes B et sécrétées dans le plasma. Les formes monomériques des molécules d'Ig étaient des glycoprotéines d'un poids moléculaire d'environ 150 kDa. Chaque monomère d'Ig était capable de lier deux molécules d'antigène. Tous les réactifs et solvants ont été utilisés sans autre purification.

Nous avons utilisé trois conditions de température différentes à 550, 400 et 100 °C avec des temps d'ébullition de 5, 5 et 120 minutes, respectivement, pour contrôler la réduction des nanoparticules. Ces différentes températures ont réduit les nanoparticules pour obtenir le même spectre d'absorption à 520 nm, comme on le voit clairement dans le fichier supplémentaire 1 :Figure S1.

Synthèse des AuNP

La méthode utilisée pour obtenir des AuNPs était basée sur l'utilisation de citrate de sodium comme agent réducteur pour réduire les ions tétrachloroaurate taurine dans l'eau. Un volume de 15 mL de HAuCl₄ ·3H₂ Une solution d'O contenant 1 mM d'Au a été chauffée au reflux et 1,8 mL de 38,8 mM de citrate de sodium (Na₃ C₆ H₅ O₇ ) a été ajoutée à la solution bouillante (550 °C, 1 100 tr/min). La réduction des ions or par les ions citrate était complète après 5 min, et la solution a été encore bouillie pendant 30 min (400 °C, 900 rpm) puis laissée refroidir à température ambiante [36, 61, 62]. Cette méthode donne des AuNPs sphériques d'un diamètre moyen d'environ 15 nm, et une concentration réduite de 0,8 mL de citrate de sodium 38,8 mM peut être utilisée pour produire des AuNPs d'un diamètre moyen d'environ 60 nm [63, 64]. La réaction chimique est la suivante :HAuCl_4(aq) + C₆ H₅ O₇ Na_3(aq) → Au_(s) + CO₂ + HCOOH.

Préparation de GO basée sur une cible d'antigène

Nous avons conçu une méthode d'immunodosage pour préparer des feuilles GO comme le montre la figure 1. la formation pour immobiliser les chaînes hydrocarbonées a été réalisée en utilisant un mélange de 400 μM (EDC)/100 μM (NHS) à un rapport volumique de 1:1. La protéine BSA a été immobilisée sur les extrémités des feuilles GO en utilisant EDC/NHS pour activer et promouvoir les réactions de liaison covalente entre les groupes carboxyle sur GO et -HN₂ de BSA. La surface -COOH activée a ensuite été soumise à une forte immobilisation covalente via une amine (NH₂ )-réaction de couplage avec 20 μl de protéine BSA à une concentration de 100 μg/ml. Enfin, nous avons utilisé une centrifugeuse pour éliminer à plusieurs reprises la protéine BSA non immobilisée sur la surface GO. La procédure de cible d'antigène GO-BSA est illustrée à la figure 1.

Interaction GO-BSA. Le groupe carboxyle des feuilles GO peut être activé à l'aide de la réaction EDC/NHS et de la préparation du GO basé sur la cible d'antigène pour GO-BSA

Préparation des AuNPs et AuNP-GO sur la base d'une sonde d'anticorps

Nous avons effectué une fonctionnalisation de surface à l'aide de Cys avec des AuNP de 15 nm dans un volume de 200 μL. Les AuNPs ont été modifiées chimiquement à l'aide d'une monocouche auto-assemblée de thiol dérivé de Cys. Les AuNPs ont été immergés dans une solution de Cys (10 mM) pendant 2 h à température ambiante. En raison de la forte liaison AuNP-S (liaison thiol), Cys peut facilement se connecter aux AuNP et -NH₂ groupes exposés à la surface des AuNPs–Cys–NH₂ . Nous avons ensuite ajouté 20 μl d'anticorps (antiBSA) de 100 μg/ml de protéine pour immobiliser la surface des AuNPs, suivi d'une centrifugation répétée pour éliminer les Cys non immobilisées à la surface des AuNPs. De l'eau déminéralisée a ensuite été utilisée pour éliminer tous les AuNP non immobilisés (Cys est une structure aminothiol qui n'a pas besoin d'être activée par EDC/NHS). La Cys attachée aux AuNPs avait une amine (–NH₂ ) couplés de manière covalente avec des groupes carboxyle (-COOH) à la surface de l'antiBSA. Enfin, nous avons utilisé une centrifugation répétée pour éliminer la protéine antiBSA non immobilisée de la surface des AuNPs. Une série de concentrations de protéines antiBSA a été préparée par dilution en série de 100 μg/ml à 1 pg/ml. La préparation de la sonde AuNP-antiBSA à différentes concentrations d'anticorps est illustrée à la figure 2a.

Interactions AuNP-antiBSA et AuNP-GO-antiBSA. Préparation du a AuNPs et b AuNP-GO basé sur une sonde d'anticorps

Nous avons utilisé des AuNPs préparés à l'aide de la méthode de la feuille GO pour modifier le nanocomposite AuNP-GO. Les AuNPs ont été préparés à l'aide de la méthode de réduction du citrate de sodium, et la taille des AuNPs à 60 nm a été modifiée à l'aide de Cys (5 mM). Nous avons ensuite utilisé EDC/NHS pour activer les groupes -COOH à la surface des feuilles GO. Le Cys attaché aux AuNPs inclus –NH₂ groupes couplés de manière covalente avec des groupes -COOH à la surface des feuilles GO. Les AuNPs à la surface des feuilles GO s'immobilisaient à l'aide d'un linker Cys pour favoriser les réactions de liaison covalente entre les AuNPs et GO. Le couplage covalent offre une méthode stable et facile pour coller la fonctionnalisation de surface sur des feuilles GO. Les feuilles de GO ont été soigneusement rincées avec de l'eau déminéralisée pour éliminer les GO non liés à la surface du lieur AuNP. L'AuNP-Cys a formé un nouveau composite d'AuNP-GO, suivi d'une immobilisation avec différentes concentrations de dilution de 100 μg/ml à 1 pg/ml de protéine sonde d'anticorps (antiBSA) pour former AuNP-GO-antiBSA, comme le montre la Fig. 2b.

Caractérisation des AuNP et des feuilles GO

La dispersion et la morphologie des feuilles d'AuNP-GO ont été caractérisées à l'aide d'un microscope électronique à transmission à canon à émission de champ de 300 kV (FEG-TEM ; Tecnai G2F30S-Twin, Philips-FEI, Amsterdam, Pays-Bas) et d'un microscope électronique à transmission haute résolution ( HR-TEM) sur un système FEI Tecnai G20 (Hillsboro, OR, USA). La dispersion et la morphologie des feuillets AuNP-GO et GO ont été caractérisées à l'aide d'un microscope électronique à balayage par émission de champ analytique à résolution extrême JEOL JSM-7800F Prime (JEOL Inc., USA). Le spectre de transmittance ultraviolet-visible (UV-vis) d'un spectrophotomètre à double faisceau a été observé à l'aide d'un spectrophotomètre UV-vis (U-2900, Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Japon) avec une longueur d'onde de 200 à 1100 nm à température ambiante . Les mesures Raman ont été effectuées à l'aide d'un système Raman microscopique (MRI, Protrustech Co., Ltd., Taiwan). Un spectromètre refroidi à l'air (AvaSpec-ULS2048L) avec un réseau de 1800 lignes/mm et une fente de 50 μm a été utilisé comme détecteur. Les mesures du spectromètre infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) ont été effectuées à l'aide d'un spectromètre Bruker Vertex 80v en mode réflexion totale atténuée (ATR) et d'un détecteur DTGS (64 scans) avec une résolution de 2 cm ^− 1 sur une pastille de KBr sous vide à une pression d'environ 6 Pa. Le Centre d'instrumentation de l'Université nationale Tsing Hua a soutenu ce travail. La spectroscopie photoélectronique aux rayons X (XPS) a été réalisée en utilisant les installations du National Synchrotron Radiation Research Center, Hsinchu, Taiwan. Les expériences de spectroscopie photoélectronique ont été réalisées en utilisant une ligne de lumière de spectroscopie 09A2 U5 pour XPS. Des photons avec des énergies fixes de 380 et 900 eV ont été utilisés pour le C (1s) et le Co (2p) tout au long des expériences de spectroscopie photoélectronique au niveau du cœur. Les expériences ont été réalisées en mode rendement total d'électrons sur un monochromateur à réseau sphérique à haute énergie de 6 m. Les photons ont été incidents sur la surface normale et les photoélectrons ont été collectés à un angle de 58° par rapport à la surface normale. Les énergies de liaison dans tous les spectres se réfèrent à Au 4f ^7/2 niveau de base à 84,0 eV. Après avoir soustrait le fond linéaire, les spectres ont été ajustés avec des fonctions mixtes gaussiennes-lorentziennes basées sur un algorithme des moindres carrés non linéaire [65].

Résultats et discussion

Analyse de la structure et de la morphologie

La taille des AuNPs dépendait de la nature de l'agent réducteur et des conditions de formation et de stockage. L'analyse SEM a indiqué que les feuilles GO et les AuNPs étaient uniformément attachés à la surface GO, avec une taille moyenne d'AuNP de 60 nm (Fig. 3). La figure 3a montre des images SEM des feuilles GO sur le film Au et que les feuilles GO étaient inférieures à 1 μm. En comparant GO et AuNP-GO, un élément d'or a pu être observé dans le composite AuNP-GO. Cela indiquait que les AuNPs avaient été adsorbées avec succès sur la surface GO ridée. Les hybrides AuNP-GO synthétisés ont été caractérisés à l'aide de MET comme le montre la figure 3b. La figure 3b, c montre les conditions de synthèse. La concentration de 10 ml de solution de feuille GO était de 0,1 g/l et 200 μl de solution d'AuNP avaient une concentration de 2,2 nM. Les images MET de la figure 3a avec une barre d'échelle de 100 nm et de la figure 3b avec une barre d'échelle de 0,5 μm montrent différentes amplifications de la taille et montrent clairement que les AuNPs étaient immobilisées à la surface des feuilles GO. Les AuNP avaient une forme sphérique, ce qui suggère que la fonctionnalité carboxylique à la surface des feuilles GO peut jouer un rôle important dans la formation de liaisons chimiques covalentes avec les AuNP, comme le montre la figure 2b.

Analyse de la morphologie de surface du nanocomposite. un Images SEM d'une feuille GO et b Image MET du composite AuNP-GO. c L'image TEM du film ERGO AuNP-GO

Caractérisations de GO par spectroscopie XPS, Raman et FTIR

La figure 4a montre l'analyse spectrale C 1s XPS haute résolution des feuilles GO. Les C1 de l'intensité la plus élevée à une énergie de liaison de 284,6 eV correspondaient aux groupes fonctionnels carbonyle pour C-C (sp2), et les pics à 285,6, 286,6, 288,2 et 289,4 eV correspondaient à C-C (sp3) dans les cycles aromatiques , C–O dans les groupes hydroxyle et époxy, C=O dans les groupes carbonyle et O–C=O dans les groupes carboxyle, respectivement. Les spectres C 1s XPS des feuilles GO sur un substrat de film d'or ont montré que les pourcentages atomiques relatifs de C-C (sp2), C-C (sp3), C-O, C=O et O-C=O étaient 77,44, 2,16, 18,14, 1,77 et 0,49 %, respectivement [66]. La figure 4b montre l'analyse spectrale Raman des feuilles GO dans une solution de NaCl avec des pics de caractéristiques spectrales à 1614 cm ^− 1 (bande G), 1355 cm ^− 1 (bande D), 2714 cm ^− 1 (bande 2D), 2947 cm ^− 1 (bande G + D) et ~ 3240 cm ^− 1 (bande 2D’) [38, 67]. La formation des feuillets GO a été analysée plus avant pour élucider les propriétés de diverses espèces oxygénées à l'aide de spectres ATR-FTIR, comme le montre la figure 4c. Ce spectre ATR-FTIR a également révélé plusieurs pics caractéristiques de GO; C–O à 850 cm ^− 1 en raison des vibrations de l'époxyde (C–O–C), C–O à 1080 cm ^− 1 en raison de la vibration d'étirement alcoxy (C–O), C=C à 1500~1600 cm ^− 1 en raison des liaisons aromatiques C=C, et C–O à 1260 cm ^− 1 due aux vibrations asymétriques de l'époxyde (C–O–C). Les groupes carboxyliques sur les bords des feuilles GO ont montré des vibrations d'étirement -COOH, avec des pics à 1652 et 1731 cm ^− 1 correspondant à C=O étirant les vibrations des groupes carbonyle. Les spectres ont également montré trois pics à 2900 cm ^− 1 liés aux vibrations d'étirement asymétriques et symétriques de –CH₂ et un pic de déformation à 1462 cm ^− 1 en raison de groupes alcènes (C-H) situés sur le plan de GO. Les spectres FTIR de GO ont montré une large gamme de pics d'absorption à large bande de C–OH et H₂ O vibrations à 3370 cm ^− 1 en raison des vibrations d'étirement [67].

Analyse spectrale des feuilles GO. un Scan XPS haute résolution dans la région C1, b Raman, et c FTIR

Analyse de GO et AuNP avec les propriétés d'interaction des protéines

Les spectres UV-vis des GO et AuNPs aqueux avec des dispersions d'interaction protéique sont présentés sur la figure 5. Les AuNPs avaient des coefficients d'extinction élevés et une taille unique en fonction des bandes d'absorption des plasmons de surface (SP). Les AuNPs modifiés de deux dimensions différentes étaient de 15 et 60 nm pour 520 et 540 nm de spectres d'absorption SP [68, 69]. La figure 5a montre la solution AuNP (520 nm) modifiée avec du Cys à une concentration de 5 mM avec la bande d'extinction AuNP-Cys [69]. Les spectres UV-vis des dispersions aqueuses de GO ont donné deux pics d'absorption :le maximum à 230 nm correspondant au pic plasmonique π–π* des liaisons aromatiques C–C dans des amas aromatiques sp2 de tailles différentes, et l'épaulement à 300 nm correspondant à la pic plasmonique n–π* dû à la présence de liaisons époxyde et carbonyle (C=O) (Fig. 5b) [9, 20]. Les spectres UV-vis des solutions GO-EDC/NHS et GO-EDC/NHS-BSA (Fig. 5b) ont démontré que GO-EDC/NHS et GO-EDC/NHS-BSA montraient un pic à environ 270 nm, ce qui était probablement en raison de fortes interactions entre les groupes GO et amine [70, 71]. La figure 5c montre les spectres d'absorption des liaisons pour différentes concentrations d'antiBSA avec des AuNP (60 nm). La figure 1b montre la solution de synthèse de la sonde AuNP-antiBSA (échantillon B1). Les longueurs d'onde présentaient des pics d'absorption évidents à 540 et 755 nm, la longueur d'onde à 540 nm étant principalement causée par les AuNPs (60 nm) et le pic à 755 nm correspondant à un pic d'absorption combiné AuNP+Cys+antiBSA. Ce résultat a montré qu'une augmentation de la concentration d'antiBSA induit une augmentation progressive de l'absorbance à 540 nm et une augmentation continue de l'absorption proche infrarouge à 755 nm. Les différentes interactions de liaison antiBSA à la surface des AuNPs ont provoqué des changements dans l'indice de réfraction de surface, qui à son tour a été transduit en intensité d'absorbance du LSPR. La bande LSPR a été affectée par la taille des particules. Les AuNPs ont montré de fortes bandes SPR dans la région visible. Avec l'augmentation de l'indice de réfraction des particules de taille moyenne, le décalage des positions des pics SPR pourrait être réglé du visible au proche infrarouge. Dans les résultats expérimentaux d'interaction protéique, nous avons mélangé AuNP-antiBSA comme le montre la figure 5d. La sensibilité a été déterminée en traçant la longueur d'onde LSPR de la bande 500-760 nm en fonction de l'indice de réfraction mesuré. Nous avons ensuite utilisé différentes concentrations de dilution de protéine antiBSA de 1,45 nM à 145 fM et les avons mélangées dans un volume de 200 l. Les changements d'absorption à 540 et 760 nm ont été causés par les différentes concentrations d'antiBSA et d'AuNP. Des mesures spectrales ont ensuite été effectuées 5 min plus tard, qui ont montré différentes concentrations d'absorption d'intensité lumineuse, et un pic d'absorption de 60 nm pour les AuNPs a été observé à 540 et 755 nm. Ces résultats étaient cohérents avec les courbes d'étalonnage d'absorption AuNP-antiBSA. Les courbes d'étalonnage ont été ajustées par y = 2,43 + 0,25× (coefficient de corrélation, R ² = 0,91) pour le pic d'absorption à 540 nm, et y = 2,56 + 0,31× (coefficient de corrélation, R ² = 0.96) pour le pic d'absorption à 760 nm, où x est la concentration d'antiBSA et de y est l'absorbance optique.

Analyse des spectres d'absorption UV-vis pour AuNP avec réponse d'interaction antiBSA. un Spectres d'absorption SP des AuNPs, b BSA lié à GO, c sonde AuNP-anti-BSA, et d Courbes d'étalonnage pour AuNP avec réponse d'interaction antiBSA à différentes concentrations de dilution de protéine antiBSA de 1,45 nM à 145 fM

Analyse de AuNP-antiBSA et AuNP-GO-antiBSA basée sur les interactions d'immunoessai

Afin de comprendre le mécanisme de détection immunologique des nanocomposites GO et AuNP-GO, une analyse spectrale des réactions de liaison a été réalisée comme le montre la figure 6. La figure 6a montre les spectres d'absorption UV-vis des nanocomposites AuNP-GO et GO-BSA. Pour la solution de feuille GO (0,1 g/l), il y avait un pic à environ 230 nm [70] et un épaulement à environ 300 nm, et les conjugués GO-BSA ont montré un pic d'absorption à environ 270 nm et un pic à environ 230 nm [9, 20, 70]. Dans la combinaison de nanocomposites AuNP-GO, trois pics d'absorption ont été notés à 230, 300 et 540 nm, respectivement. L'empilement π–π ou les interactions de liaison covalente entre les AuNPs et la surface de la feuille GO étaient la principale force motrice ancrant les AuNPs sur les matériaux GO hautement biocompatibles. Les feuilles GO ont été conçues pour se rassembler dans les AuNP, ce qui a donné une forte bande d'absorption de 200 à 300 nm. Par conséquent, l'absorption des feuilles GO était bien supérieure à l'absorption des AuNPs dans la bande de lumière visible. La figure 6b montre que les spectres UV-vis du pic d'absorption AuNP étaient à 540 nm [50, 68, 69]. Les pics d'absorption étaient à 540 et 660 nm pour les conjugués AuNP+Cys ; 230, 300, 540 et 660 nm pour les conjugués AuNP+Cys+GO ; et 230, 270, 540 et 660 nm pour les conjugués AuNP+Cys+GO+antiBSA. Les feuillets GO présentaient deux pics d'absorption à 230 nm (pic de plasmon π–π*) et à 300 nm (pic de plasmon n–π*). Un décalage de la longueur d'onde d'absorption a été noté, et ce décalage d'absorbance a été considéré comme indiquant la confirmation de l'absorption de l'antiBSA (0 fM ~ 1,45 nM) sur la surface AuNP+Cys+GO. La figure 6c montre la synthèse de la solution de la sonde AuNP+Cys+GO+antiBSA (échantillon B2) comme sur la figure 2b. L'augmentation de la concentration d'antiBSA était relativement élevée à 540 nm. La figure 6c montre différentes concentrations d'absorption d'intensité lumineuse, et un pic d'absorption de 60 nm pour les AuNPs a été observé à 540 nm. L'augmentation de la concentration d'antiBSA était relativement élevée à 540 nm. Ce résultat a montré que l'AuNP-GO pouvait améliorer les caractéristiques d'absorption des plasmons à 540 nm lorsque la concentration d'antiBSA était augmentée. De plus, dans l'expérience d'immunodosage, nous avons mélangé la cible GO-BSA (1,52 μM) (échantillon A) et la sonde AuNP+Cys+GO+antiBSA comme le montre la figure 6d. En plus des caractéristiques d'interaction hydrophobe et –π des feuillets GO, les liaisons covalentes entre les protéines et les groupes carboxyle sur les feuillets GO ont également favorisé l'adhésion de surface. Ce résultat était probablement dû à la structure hybride AuNP + GO-antiBSA pour former une réponse immunitaire stable avec d'autres protéines sur GO-BSA. Les longueurs d'onde présentaient un pic d'absorption évident à 260 nm. En plus des caractéristiques d'interaction hydrophobe et –π (pic de plasmon π–π*) des feuillets GO, les liaisons covalentes entre les protéines et les groupes carboxyle sur les feuillets GO ont également favorisé l'adhésion de surface. Avant et après la liaison BSA et antiBSA, les valeurs des pics plasmoniques π–π* de GO (230 et 270 nm) étaient significativement décalées, ce qui prouvait que la BSA et l'antiBSA étaient liées positivement.

Analyse des spectres d'absorption UV-vis pour la réponse immunitaire. un GO lié à AuNP et BSA lié à GO, b AuNPs et anti-BSA liés à GO, c sonde AuNP-GO-antiBSA, et d Sonde AuNP-GO-antiBSA et cible GO-BSA pour la réponse immunitaire

La figure 7 montre que ces résultats sont en bon accord avec les courbes d'étalonnage. Une analyse détaillée des résultats expérimentaux ci-dessus (Fig. 6c, d) a montré que les réponses de détection aux imprécisions moyennes correspondantes d'absorbance étaient de 1,3487, 1,1776, 1,0698, 0,8755 et 0,8588 (Fig. 7a) et de 0,9226, 0,8535, 0,7649, 0,7243 et 0,695 (Fig. 7b), correspondant à des concentrations de protéines de 1,45 nM, 145 pM, 14,5 pM, 1,45 pM et 145 fM, respectivement. La figure 7a montre que la régression linéaire des courbes d'étalonnage était f(x) = 0,918 + 0,124× (coefficient de corrélation, R ² = 0.94) pour la sonde AuNP-GO avec interactions antiBSA, où x est la concentration en protéines et y est l'absorbance optique. De plus, la figure 7b montre que l'équation de régression linéaire de la courbe ajustée était f(x) = 0,791 + 0,057× (coefficient de corrélation, R ² = 0,954) pour GO et AuNP-GO sur la base du dosage immunologique.

Comparaison des courbes d'étalonnage des réponses de détection obtenues à différentes concentrations de protéines. un Courbes d'étalonnage pour la sonde AuNP-GO avec interactions antiBSA. b Courbes d'étalonnage pour GO et GO-AuNPs basées sur un immunoessai

Au cours de l'expérience de quantification, nous avons ajouté une concentration fixe de 10 ng/ml de protéine gonadotrophine chorionique humaine (hCG) pour agir comme un interférent. Les résultats ont montré que la protéine hCG interférente fixe sur les courbes d'étalonnage du dosage immunologique était ajustée par f(x) = 0.843 + 0.113× (coefficient de corrélation, R ² = 0,89) pour la sonde AuNP-GO avec interactions antiBSA (Fig. 7a), et f(x) = 0,722 + 0,051× (coefficient de corrélation, R ² = 0,73) pour le GO et l'AuNP-GO sur la base du dosage immunologique (Fig. 7b).

De plus, nos résultats expérimentaux ont montré que la stratégie de détection permettait une régénération de surface sans perte de spécificité (quatre régénérations) et qu'elle pouvait également être utilisée pour détecter la protéine antiBSA avec des réponses dynamiques allant de 1,45 nM, 145 pM, 14,5 pM, 1,45 pM , 145 fM et 0 fM. The results demonstrated that with a decreased concentration of antiBSA (from 1.45 nM to 145 fM) and even without the presence of antiBSA (0 fM), the spectral absorption intensity did not change the minimum level of quantitation. The hCG protein interfered with the antibody recognition in the immunoassay to a limited extent, possibly due to non-specific adsorption. This implies a very low cross-reactivity of the hCG protein and non-specific interactions at a low adsorption. In the practical quantitative analysis with immunoassays, a LOD of 145 fM for antiBSA was achieved in both buffer and interference protein samples.

Conclusions

We successfully demonstrated a GO-bound AuNP biocompatible nanocomposite in a biosensing mechanism in a rapid and label-free immunoassay for biomolecule interactions. The results showed that the AuNP-GO nanocomposite was biocompatible and exhibited LSPR extinction to biomolecules, which could promote the absorption spectra characteristic peaks, accelerate the reaction of molecules, and enhance the stability of chemical covalent bonds during immobilization. For the detection of antiBSA protein, the limit of detection of the GO and AuNP-GO based on the immunoassay was as low as 145 fM. Among the AuNP-GO biosensors, GO immobilized in the AuNP-GO nanocomposite showed the highest bioaffinity, with good sensitivity, low detection limit, and fast response toward the protein immunoassay. The results of our experiments showed that a fixed concentration 10 ng/ml of hCG protein as an interferer did not affect the test response. Given the growing trend of applying biosensors in POCT, LSPR for AuNP-GO nanocomposite technology is a highly promising and versatile tool for use in immunoassays. Combining the properties of AuNPs and GO sheets to develop new nanocomposites for the synthesis of smart materials shows promise for the development of user-friendly diagnosis applications. In the future, AuNP-GO nanocomposites may be used in innovative immunoassays, rapid detection reagents, and miniaturization, which may in turn make LSPR technology an irreplaceable tool for routine clinical analysis and POCT diagnostics.

Abréviations

Ag:

Silver

AntiBSA:

Bovine serum albumin antibody

Au:

Gold

AuNP:

Gold nanoparticle

BSA:

Bovine serum albumin

Cys:

Cystamine

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

FEG-TEM:

Field-emission gun transmission electron microscope

FTIR :

Fourier-transform infrared spectrometer

GO :

Graphene oxide sheet

HR-TEM:

High-resolution transmission electron microscope

LOD:

Limit of detection

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

MOA:

8-Mercaptooctanoic acid

NHS:

N -Hydroxysuccinimide

Pd:

Palladium

POCT:

Point-of-care testing

Pt:

Platinum

RGO:

Reduction graphene oxide

SAM :

Monocouches auto-assemblées

SERS:

Surface-enhanced Raman scattering

UV-vis :

Ultraviolet-visible

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X

ZnO:

Zinc oxide