Étude antitumorale de nanogels de sulfate de chondroïtine et de méthotrexate

Contexte

Le méthotrexate (acide 4-amino-10-méthylfolique, MTX) est un analogue du folate, appartenant à la famille des antifolates antimétabolites [1]. Le MTX a été le premier médicament utilisé en thérapie tumorale à partir des années 1950 [2], qui est un médicament antitumoral mutagène et tératogène, agissant en bloquant l'activité enzymatique et en interférant avec la synthèse de l'ADN [3]. Des études antérieures ont montré que l'administration de médicaments chimiothérapeutiques à la cellule cible seule n'est pas suffisante pour induire la mort cellulaire, et le MTX à haute dose peut améliorer considérablement le taux de guérison et le pronostic des patients [4]. La faible solubilité dans l'eau, la faible perméabilité et la courte demi-vie du MTX limitent son application clinique [5, 6]. L'effet de la chimiothérapie du MTX est largement influencé par sa faible absorption de cellules tumorales, sa biodistribution tissulaire et ses effets secondaires graves [7]. Cependant, une concentration plus élevée de MTX peut augmenter le risque d'effets indésirables en raison de la faible biodisponibilité du MTX [8]. Il est urgent de développer un nouveau système d'administration de médicaments pour améliorer la biodisponibilité du MTX et réduire ses effets secondaires.

La nanotechnologie présente des avantages dans les systèmes d'administration de médicaments, notamment l'amélioration de la stabilité du médicament, l'extension de la circulation sanguine, la réduction des effets secondaires et le contrôle de la libération du médicament [9,10,11,12,13,14,15]. La technologie d'auto-assemblage a été largement utilisée dans le domaine de l'administration de médicaments pour améliorer l'efficacité et réduire les effets indésirables des médicaments [16,17,18,19,20]. Notre étude vise à concevoir un système d'administration de médicaments nanogel pour le MTX afin d'améliorer sa solubilité et sa biodistribution et de réduire ses effets secondaires. Le sulfate de chondroïtine (CS) est un glycosaminoglycane acide (GAG), qui constitue un composant important du cartilage, des parois des vaisseaux sanguins, de la peau, des tendons et d'autres tissus conjonctifs [21]. Des nanogels à base de sulfate de chondroïtine ont déjà été étudiés [22, 23]. Des études ont montré que CD44 se lie à un protéoglycane CS [24,25,26]. CD44 est une glycoprotéine transmembranaire avec des domaines extracellulaires et a été impliquée dans la médiation des interactions cellule-cellule et cellule-ECM et joue un rôle dans la migration cellulaire [27]. Le CD44 est fortement exprimé dans le cancer métastatique contrairement à ses faibles niveaux d'expression dans les tissus normaux [28]. Des nanoparticules basées sur le CS ont été rapportées pour le ciblage des tumeurs et l'administration de médicaments anti-tumoraux [29, 30]. Ici, nous avons fabriqué un nouveau type de nanogels CS-MTX à auto-assemblage dans le but d'améliorer l'administration ciblée de molécules médicamenteuses MTX aux cellules cancéreuses via l'interaction CS-CD44.

Méthodes

Matériaux et échantillons

Le sulfate de chondroïtine a été acheté auprès de Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. (Dalian, Liaoning, Chine). La 4-méthylmorpholine, le tétrahydrofurane et le 2-chloro-4, 6-diméthoxy-1, 3, 5-triazine ont été achetés auprès de Sun Chemical Technology (Shanghai, China) Co., Ltd., et du sérum de veau fœtal (FBS) a été acheté de HyClone (Utah, États-Unis). Tous les autres produits chimiques ont été achetés auprès de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Chine). Les rats Lewis ont été achetés auprès de Shanghai Sippr-BK Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, Chine).

Synthèse du DMT-MM

Le chlorure de 4-(4,6-Diméthoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-méthylmorpholinium (DMT-MM) est utilisé pour les réactions de déshydratation-condensation avec activation d'acide carboxylique qui peuvent être utilisés dans un solvant aqueux ou protonique systèmes. Vingt-cinq grammes de 2-chloro-4,6-diméthoxy-1,3,5-triazine (CDMT) ont été dissous dans 200 ml de tétrahydrofurane (THF). Ensuite, 18,79 ml de 4-méthylmorpholine (NMM) ont été ajoutés goutte à goutte à la solution de CDMT sous agitation. Afin d'assurer une réponse complète, l'agitation doit être maintenue pendant 30 min. Ensuite, le produit filtré a été lavé trois fois par du THF et séché sous vide pendant 24 h. Le DMT-MM a été obtenu sous forme de poudre blanche (Schéma 1).

Voies synthétiques dans la formation du DMT-MM

Synthèse de MTX-CS

Le CS conjugué au MTX a été activé par le DMT-MM. Pour l'activation du CS, le CS (1,0 g) a été dissous dans 20 ml d'eau ultrapure et activé en ajoutant du DMT-MM (0,769 g). La réaction a été conduite pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, le CS activé a encore réagi avec du MTX pendant 24 h à température ambiante. La solution a été dialysée pendant 48 h avec changement d'eau toutes les 4 h et lyophilisée. Le MTX-CS a été obtenu sous forme de poudre jaune. La poudre jaune a été examinée par spectrométrie infrarouge à transformée de Fourier (ALPHA, BRUKER, USA). Les spectres FTIR ont été enregistrés de 400 à 4000 cm ⁻¹ . ¹ La RMN H a été utilisée pour déterminer si le MTX était conjugué au CS (Schéma 2).

Voies synthétiques dans la formation de MTX-CS

Cytotoxicité des nanogels MTX-CS

La cytotoxicité des nanogels a été analysée en utilisant des cellules tumorales A549T et Hela et une culture de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC). Les cellules A549T et Hela ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à une densité de 5 × 10 ³ cellules par puits en 1640, supplémentées avec 10 % de FBS et incubées pendant 24 h sous 5 % de CO₂ à 37 °C. Le A549T a été suivi d'un traitement avec différentes concentrations de MTX-CS NG (0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400 μM), et le Hela a été suivi d'un traitement avec différentes concentrations de MTX- CS NG (0, 5, 10, 30, 40, 60, 80, 100 μM) pendant encore 48 h. Les concentrations de MTX-CS NG étaient basées sur le contenu de MTX dans chaque échantillon. Les concentrations de CS étaient basées sur le contenu de MTX-CS NG dans chaque échantillon. Les HUVEC ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à une densité de 5 × 10 ³ cellules par puits dans du DMEM, additionné de 10 % de FBS et incubé pendant 24 h sous 5 % de CO₂ à 37 °C. L'HUVEC a ensuite été ajoutée à différentes concentrations de MTX-CS NG (0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400 μM). Les concentrations de MTX-CS NG étaient basées sur le contenu de MTX dans chaque échantillon. Les concentrations de CS étaient basées sur le contenu de MTX-CS NG dans chaque échantillon. Le test MTT est une mesure de l'activité cellulaire. Vingt microlitres de tampon CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits et incubés à 37 °C sous 5% de CO₂ pendant encore 4 h. Le milieu a été retiré et 200 μL de DMSO ont été ajoutés à chaque puits. L'absorbance a été mesurée à une longueur d'onde de 490 nm (570 nm comme référence) sur un lecteur de microplaques MULTISKAN GO (Thermo Scientific, USA).

Conception animale et expérimentale

Afin d'analyser la toxicité des NG MTX-CS in vivo, un dix-huitième rat mâle Sprague-Dawley a été acheté auprès du Experimental Animal Center de l'Académie des sciences médicales du Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang, Chine). Ces rats ont été logés sous un cycle de lumière de 12 h et d'obscurité de 12 h avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Les rats, âgés de 8 semaines (200 ± 10 g), ont été répartis au hasard en trois groupes :groupe témoin (injecté avec le même volume de sérum physiologique), groupe MTX (injecté avec 1,25 μmol kg ⁻¹ jour ⁻¹ ) et le groupe MTX-CS NG (injecté avec 25 mg kg ⁻¹ jour ⁻¹ NG MTX-CS). La dose de MTX du groupe MTX-CS NG était égale à une dose libre du groupe MTX (1,25 μmol kg ⁻¹ jour ⁻¹ ). Les médicaments ont été administrés un autre jour par injections intrapéritonéales respectivement. Après 2 semaines de traitement (total de sept injections), tous les rats ont été tués par décapitation pour des recherches plus approfondies.

Étude histologique

Après décapitation, la rate de tous les rats a été disséquée rapidement et lavée deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et fixée dans 4% (w /v ) paraformaldéhyde (pH = 7,4) (Sigma-Aldrich, MO, USA) pendant 24 h. Ensuite, les tissus ont été préparés pour la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) en utilisant des procédures standard et obtenus sous un microscope optique de haute qualité.

Résultats et discussion

Synthèse de MTX-CS

Pour déterminer si le MTX était conjugué au CS, nous avons utilisé FTIR et ¹ H RMN pour analyser les échantillons de bioconjugués MTX, CS et MTX-CS. La figure 1 montre les spectres FTIR des bioconjugués CS (Fig. 1a), MTX (Fig. 1b) et MTX-CS (Fig. 1c). Comme le montre la figure 1b, le MTX avait une transmittance caractéristique à 3 355, 2 951, 1 466, 1 600, 1 540, 1 493, 1 403 et 1 207 cm ⁻¹ . Le FTIR culmine à 1600 et 1540 cm ⁻¹ peut être attribué à l'étirement du para-benzène, qui pourrait être trouvé dans le spectre FTIR du MTX (Fig. 1b) et des bioconjugués MTX-CS (Fig. 1c). Les résultats FTIR ont indiqué que le MTX a été conjugué avec succès au CS.

un Spectre FTIR de CS. b Spectre FTIR de MTX. c Spectre FTIR de MTX-CS

La figure 2 montre le ¹ Spectres RMN H des bioconjugués CS, MTX et MTX-CS. Les pics à 6,93 (2H, d, J = 10,1 Hz) et 7,84 (2H, d, J = 10,1 Hz) peut être attribué au groupe benzoyle du MTX. Les pics à 4,90 (2H, s) peuvent être attribués au méthylène à côté du groupe 2,4-diamino-6-ptéridinyle, et les pics à 8,69 (1H, s) peuvent être attribués au 2, 4-diamino- Groupe 6-ptéridinyle du MTX comme le suggère la figure 2b. Le ¹ La RMN H du CS-MTX (Fig. 2c) a suggéré le CS (partie disaccharidique δ _H les signaux étaient compris entre 3,20 et 5,40, 5,39 étant attribués comme carbone anomérique) a été attaché avec succès au MTX (le déplacement chimique du groupe benzoyle était de 8,00 et 6,88, et le groupe méthyle était de 3,20). La RMN a également prouvé que le MTX était conjugué au CS.

¹ Spectres RMN H de CS, MTX et CS-MTX. un ¹ spectres RMN H de CS; CS a été dissous en D₂ O. b ¹ Spectre RMN H du MTX; Le MTX a été dissous dans du diméthylsulfoxyde-d6. c ¹ Spectre RMN H du CS-MTX; CS-MTX a été dissous dans D₂ O

Pour calculer la quantité de MTX conjugué au CS, les échantillons ont été dissous dans de l'eau ultrapure et agités pendant 48 h à température ambiante. La quantité de MTX a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre UV-vis à 309 nm. La quantité de MTX a été mesurée par spectroscopie UV-vis. Enfin, la quantité calculée de méthotrexate sur les MTX-CS NG était de 13,65%. Les nanogels formés par encapsulation de molécules MTX hydrophobes par la couche extérieure de chaînes latérales hydrophiles de CS (Fig. 3a). Les nanogels ont été caractérisés par diffusion dynamique de la lumière (DLS), microscope à force atomique (AFM) et microscope électronique à transmission (MET). Comme indiqué, les données DLS ont mesuré la taille de tous les nanogels dans la plage de 100 à 400 nm (Fig. 3b). La taille des particules des nanoparticules est principalement d'environ 200 nm. L'image AFM des nanogels a confirmé que les nanoparticules étaient bien distribuées avec une taille et une morphologie similaires d'environ 200 nm (Fig. 3c). Les images MET ont également montré que la taille des nanogels était des nanosphères d'une taille comprise entre 200 et 240 nm. La taille des particules des nanoparticules est principalement d'environ 200 nm (Fig. 3d, e).

Illustration schématique des NG MTX-CS. Caractérisation par diffusion dynamique de la lumière (DLS), microscope à force atomique (AFM) et microscopie électronique à transmission (MET) des NG MTX-CS. un Illustration schématique des NG MTX-CS. b Taille des NG MTX-CS mesurée par DLS dans des expériences représentatives. c Images AFM des NG MTX-CS. d , e Images TEM des NG MTX-CS

Pour calculer la quantité de MTX conjugué au CS, les échantillons ont été dissous dans de l'eau ultrapure et agités pendant 48 h à température ambiante. La quantité de MTX a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre UV-vis à 313 nm.

La quantité de MTX a été mesurée par spectroscopie UV-vis. Dans un premier temps, une courbe standard d'absorption UV du méthotrexate libre a été établie (Fig. 4). La relation entre l'absorbance et la concentration de MTX libre est :

Courbe standard d'absorption UV du méthotrexate

Ensuite, 28,8 mg de MTX-CS ont été dissous dans 1 000 ml d'eau ultrapure et l'absorption UV est de 0,2055. Enfin, la quantité calculée de méthotrexate sur les MTX-CS NG était de 13,65%.

Cytotoxicité des nanogels MTX-CS

L'activité anti-tumorale in vitro des NG MTX-CS, du MTX libre et du MTX mélangé avec du CS a été analysée en utilisant à la fois A549T et la culture de cellules tumorales Hela. Comme le montre le test MTT (Fig. 5), les NG MTX-CS pourraient réduire considérablement la viabilité des deux cellules cancéreuses, tandis que le MTX libre n'a montré aucun effet à des concentrations élevées. Le MTX mélangé à du CS à haute concentration favorise même la croissance des cellules cancéreuses. La viabilité de Hela a diminué de 73,81 % pour le MTX libre à 60,16 % pour les NG MTX-CS (diminution de 13,65 % de la viabilité cellulaire) à la concentration de médicament de 10 μM (Fig. 5a). De même, la viabilité des cellules A549T a diminué de 80,23 % pour le MTX libre à 46,04 % pour les NG MTX-CS (diminution de 34,09 % de la viabilité cellulaire) à la concentration de médicament de 50 μM (Fig. 5b). Les polysaccharides tels que l'acide hyaluronique sont utilisés comme fraction de ciblage des conjugués médicamenteux ou des nanoparticules pour le traitement du cancer car ils se fixent spécifiquement sur le récepteur CD44 [31]. Le sulfate de chondroïtine peut également agir comme un ligand du récepteur CD44 [25, 27], ce qui signifie que le CS peut favoriser l'absorption des MTX-CS NG par les cellules cancéreuses et améliorer l'efficacité médicamenteuse du MTX. De plus, les nanoparticules peuvent améliorer la stabilité du médicament et contrôler la libération des médicaments [32, 33]. Tous les résultats ont prouvé que l'activité anti-tumorale des NG MTX-CS était meilleure que celle du MTX libre ainsi que du MTX mélangé avec du CS. Avec une efficacité d'administration intracellulaire accrue des molécules de médicament MTX, la sélectivité de ciblage des NG MTX-CS s'est également améliorée par rapport à la même concentration de MTX libre. Ces résultats démontrent que les MTX-CS NG ont un meilleur effet anti-tumoral que le MTX libre.

un Viabilité cellulaire de A549 T en présence de MTX libre, de MTX et CS libres et de NG MTX-CS en 48 h. b Viabilité cellulaire de Hela en présence de MTX libre, de MTX et CS libres et de NG MTX-CS en 48 h. c Viabilité cellulaire des HUVEC en présence de NG MTX, CS et MTX-CS libres en 48 h

L'effet indésirable des NG MTX-CS, du MTX libre et du CS a été analysé en utilisant la culture HUVEC. Comme le montre le test MTT (Fig. 5c), les NG MTX-CS pourraient réduire considérablement l'effet secondaire tandis que le MTX libre pourrait réduire considérablement la viabilité de HUVEC. La viabilité des HUVEC est passée de 63,6 % pour le MTX libre à 73,5 % pour les NG MTX-CS (augmentation de 9,9 % de la viabilité cellulaire) à la concentration de médicament de 10 μM (Fig. 5c). La viabilité cellulaire des HUVEC à 400 μM était encore de 69,95 %. Le résultat a indiqué que les NG MTX-CS pourraient réduire les effets secondaires sur la cellule normale.

Conception animale et expérimentale

L'un des principaux effets secondaires toxiques du MTX utilisé pour traiter les patients cancéreux est la mucite intestinale, qui entraîne une réduction rapide du poids corporel [34]. Nous avons ensuite testé les effets protecteurs des NG MTX-CS contre la perte de poids induite par la chimiothérapie chez des rats mâles Sprague-Dawley. La survie et le poids ont été surveillés pendant 14 jours après l'injection de solution saline, de MTX libre et de MTX-CS NG. Aucun décès n'a été trouvé dans aucun des trois groupes. Une diminution brutale a été observée dans le poids corporel de tous les groupes MTX (1,25 μmol kg ⁻¹ jour ⁻¹ pendant 14 jours), indiquant clairement que les rats ont subi un syndrome de chimiothérapie et des dommages induits par la chimiothérapie, entraînant des maladies et une perte de poids corporel, tandis que le poids corporel des rats traités avec MTX-CS NG (4,25 mg kg ⁻¹ jour ⁻¹ pendant 14 jours) a connu une légère augmentation (Fig. 6). Les résultats montrent que les NG MTX-CS n'ont pas causé d'effets indésirables. Ces résultats soutiennent l'administration cible de MTX au tissu tumoral via l'interaction CD44-CS et réduisent la cytotoxicité du médicament MTX.

Effets des NG MTX et MTX-CS sur le poids corporel du rat. Le jour de la première injection a été considéré comme le jour 0. Solution saline, MTX (1,25 μmol kg ⁻¹ jour ⁻¹ ) et MTX-CS NG (4,25 mg kg ⁻¹ jour ⁻¹ ) ont été administrés un autre jour par injections intrapéritonéales, respectivement, au groupe correspondant. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM et analysés à l'aide de t test. *P < 0,05 par rapport à la date du jour 0

Afin d'étudier plus avant la toxicité in vivo des NG MTX-CS, une analyse histologique de la rate de rats a été réalisée pour déterminer si les NG MTX-CS ont causé des dommages tissulaires (Fig. 7). Des coupes du groupe témoin ont montré la structure de la rate normale, composée de pulpe blanche (formes) et de pulpe rouge (RP), avec des travées fibreuses (T) s'étendant dans la pulpe splénique. La pulpe blanche contient des gaines lymphoïdes périartérielles et des follicules spléniques et est entourée de zones marginales, tandis que la pulpe rouge est composée de cordons spléniques et est séparée par des sinusoïdes spléniques (Figs. 7a et 7b). Le groupe traité au MTX a montré un rétrécissement sérieux à la fois de la pulpe blanche (boîte noire) et de la RP. Les dépôts d'hémosidérine peuvent également être trouvés dans le groupe traité au MTX (Figs. 7c et 7d). Le groupe traité par MTX-CS NG a montré un léger rétrécissement de la pulpe blanche (formes) et de la RP, sans aucun dépôt d'hémosidérine trouvé. La pulpe blanche et la pulpe rouge ont toutes deux montré un léger rétrécissement par rapport au groupe MTX (Figs. 7e et 7f). Les résultats ci-dessus ont indiqué que les NG MTX-CS ont peu d'effets secondaires sur les tissus normaux [35, 36].

Les effets toxiques du MTX et du MTX-CS NG sur la rate des rats. Rate colorée par H&E excisée de souris après un traitement de 14 jours après sept injections intrapéritonéales. un , b Sections du groupe témoin. c , d Le groupe traité au MTX. e , f Le groupe traité MTX-CS NG

Conclusions

En résumé, nous avons fabriqué avec succès des nanogels auto-assemblés pour une administration de médicaments anti-tumeur très efficace. Les nanogels conjugués au MTX-CS avaient une taille d'environ 200 nm, montrant une bonne stabilité et solubilité. Les NG MTX-CS ont montré une cytotoxicité plus forte et plus spécifique que le MTX. Des expériences in vivo ont révélé que les NG MTX-CS présentaient moins de toxicité que le MTX. Les MTX-CS NG peuvent améliorer l'effet anti-tumoral tout en réduisant les effets secondaires du MTX. En raison de leur propriété de liaison au CD44, les conjugués sulfate de chondroïtine-médicament pourraient être une plate-forme prometteuse et efficace pour améliorer la solubilité des molécules médicamenteuses peu solubles ainsi que la livraison ciblée active et sélective aux cellules cancéreuses et aux tissus tumoraux.

Abréviations

¹ RMN H :

1H Résonance magnétique nucléaire

AFM :

Microscope à force atomique

CDMT :

2-Chloro-4, 6-diméthoxy-1, 3, 5-triazine

CS :

Sulfate de chondroïtine

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

DMT-MM :

Chlorure de 4-(4,6-Diméthoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-méthylmorpholinium

FTIR :

Transformée de Fourier infrarouge

MTT :

Bromure de 3-(4,5-Diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényl-2-H-tétrazolium

MTX :

Méthotrexate

NG MTX-CS :

Nanogels de sulfate de méthotrexate-chondroïtine

NG :

Nanogels

NMM :

4-Méthylmorpholine

TEM :

Microscope électronique à transmission

THF :

Tétrahydrofurane

UV-vis :

Spectroscopie ultraviolet-visible