Les nanoparticules de phosphore noir favorisent la différenciation ostéogénique des CSEM grâce à l'expression TG2 régulée à la hausse

Introduction

En milieu clinique, le manque de régénération osseuse peut entraîner un mauvais pronostic même dans les fractures osseuses courantes, et il existe un besoin urgent de matériaux de régénération osseuse [1]. Par la suite, de nombreuses stratégies thérapeutiques, telles que les autogreffes, les allogreffes et les échafaudages osseux artificiels ont été utilisées comme matériaux de régénération. Ces dernières années, il a été démontré avec succès que les biomatériaux contribuent à la régénération osseuse, ce qui montre les progrès impressionnants dans les applications diversifiées des biomatériaux [2]. Cependant, le développement d'un substitut osseux artificiel avec une excellente ostéo-conduction, ostéo-induction et ostéo-intégration est toujours nécessaire de toute urgence. Les polymères bioactifs [3,4,5] et les céramiques [6] ont été transformés en échafaudages pour l'ingénierie osseuse, et les échafaudages améliorant l'ostéogenèse en libérant des ions [7] sont particulièrement préoccupants. Notamment, les phosphates inorganiques qui agissent spécifiquement sur les cellules ou les tissus cibles peuvent fournir une voie prometteuse pour étudier les processus biologiques liés à la minéralisation et faire progresser l'ingénierie médicale guidée par la minéralisation bioinspirée [8].

En 2014, Li et ses collègues ont signalé que des nanofeuilles de phosphore noir (BP) pouvaient être exfoliées à partir de BP en vrac et ont démontré le potentiel des nanofeuilles de BP en tant que nouveau matériau bidimensionnel (2D) pour des applications dans des dispositifs nano-électroniques [9]. En raison des propriétés supérieures de BP, telles que des structures plissées distinctes en couches, une bande interdite directe réglable, une mobilité élevée des porteurs et de nombreuses anisotropies intéressantes dans la couche, BP est actuellement à l'étude pour des applications biomédicales potentielles [10]. En raison de ces avantages, les échafaudages à base de nanomatériaux BP pour stimuler la régénération osseuse ont été largement étudiés au cours des 2 dernières années. Des études antérieures ont montré que les biomatériaux à base de phosphore pouvaient améliorer la minéralisation et la régénération osseuse en augmentant la concentration locale d'ions phosphate [11]. Bien que BP puisse être considéré comme un candidat idéal pour favoriser la régénération osseuse, il est généralement encapsulé dans des polymères ou introduit sur des échafaudages de biomatériau par immersion pour une application pour un ingénieur en tissu osseux. Jusqu'à présent, les mécanismes moléculaires qui modulent la régénération osseuse par la PA restent largement inconnus et entravent ainsi le développement ultérieur de thérapies basées sur la PA pour la réparation osseuse en clinique.

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont des cellules stromales multipotentes qui ont la capacité de se renouveler et de se différencier de plusieurs lignées [12]. Après les fractures osseuses, les CSM jouent un rôle clé dans le processus de réparation osseuse in vivo [13,14,15]. Les cellules souches de la moelle osseuse (BMSC) et leur potentiel de différenciation ostéogénique ont été largement étudiés au fil des ans. Cependant, le processus de récolte des BMSCs pourrait être douloureux pour les prestataires, avec des risques d'infection. Originaires de la crête neurale crânienne au cours du développement embryonnaire, les cellules souches mésenchymateuses ectodermiques (EMSC) peuvent être facilement récoltées à partir de la muqueuse respiratoire de la cavité nasale chez l'adulte. En outre, les EMSC sont auto-renouvelables avec un potentiel de différenciation multidirectionnel, qui a été soigneusement caractérisé dans nos études précédentes [16, 17]. Nous avons prouvé que les EMSC peuvent se différencier en plusieurs lignées cellulaires comprenant des adipocytes, des neurocytes, des chondrocytes et des ostéocytes [18, 19]. Ces propriétés spéciales font des EMSC un outil prometteur pour explorer les mécanismes moléculaires potentiels qui modulent la différenciation ostéogénique des EMSC par des signaux chimiques, y compris les BP. Cependant, la différenciation ostéogénique est un processus complexe impliquant une coordination étroite de la prolifération et de la différenciation de différentes cellules, la synthèse et la minéralisation de la matrice extracellulaire (MEC) [20]. Des études antérieures ont rapporté que la transglutaminase 2 (TG2) est capable de stimuler l'ostéogenèse des ostéoblastes en influençant la prolifération, la différenciation, la production de matrice extracellulaire et la minéralisation des ostéoblastes [21,22,23].

Les rapports cités ci-dessus indiquent que les BP possèdent un énorme potentiel pour des applications biomédicales qui pourraient être un inducteur de différenciation ostéogénique supérieur pour les EMSC. Jusqu'à présent, les recherches concernant les effets des BP sur la différenciation des EMSC n'ont pas été rapportées. Le but principal de la présente étude était d'étudier les effets des BP sur la différenciation et la prolifération ostéogéniques in vitro associées aux EMSC. Après cette enquête, le mécanisme moléculaire potentiel des BP sur la prolifération des EMSC et la différenciation ostéogénique a également été soigneusement examiné. Dans l'ensemble, nos données montrent que les BP pourraient être un agent chimique potentiellement utile pour les échafaudages d'ingénierie tissulaire.

Matériaux et méthodes

Nanoparticules de phosphore noir

Bulk BP a été acheté par Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd. Diméthylsulfoxyde (DMSO), hydroxyde de sodium (NaOH) et N -méthyl-2pyrrolidone (NMP) ont été fournis par Aladdin Industrial Co., Ltd. Une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) a été obtenue auprès de Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. Le mélange milieu/nutriment Eagle modifié de Dulbecco F12 (DMEM/F12; Hyclone ; GE Healthcare Life Sciences), streptomycine, pénicilline, sérum de veau fœtal (FBS) ont été obtenus auprès de BI Science and Technology Co., Ltd.

La synthèse de la PA était similaire à celle des rapports précédents avec des modifications mineures [24]. Tout d'abord, 20 mg de BP en vrac ont été immergés dans une solution saturée de NaOH/NMP et affinés avec une méthode mécanique de broyage. Le mélange a ensuite été centrifugé pendant 10 minutes à 1500 tr/min, après quoi le précipité a été jeté. Ensuite, le mélange a été soniqué pendant 6 h dans un bain de glace/eau, puis le mélange a été filtré à travers un filtre Falcon BD 100 μm (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Enfin, une nouvelle centrifugation de la suspension (10 min à 13 000 tr/min, 4 °C) a été effectuée et le précipité a été recueilli.

Coloration par immunofluorescence des EMSC dans la muqueuse nasale

Afin de montrer les EMSC in vivo, la muqueuse respiratoire de la cloison nasale a été disséquée puis fixée dans 4% de PFA pendant une nuit pour une coloration par immunofluorescence. Les tissus ont été lavés avec du PBS puis déshydratés avec des solutions de saccharose en gradient. Les tissus ont été inclus dans l'OCT (Sakura Finetek, Japon) pour la cryosection et ont été découpés en coupes coronales en série d'une épaisseur de 25 mm à l'aide d'un cryo-microtome Leica. Ces sections ont été lavées dans du PBS pendant 10 min et perméabilisées avec 1 % d'albumine de sérum bovin et 0,1 % de Triton-X 100 dans du PBS. Les EMSC dans la muqueuse nasale ont été colorées par immunofluorescence avec l'anticorps primaire anti-nestine et l'anticorps secondaire conjugué à Cy3. Les témoins négatifs parallèles ont été soumis aux mêmes procédures sans anticorps primaires. Les tissus colorés ont été observés au microscope à immunofluorescence (AxioObserver, ZEISS, Allemagne).

Culture cellulaire

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le comité d'éthique et de protection des animaux de l'université de Jiangnan, et les directives internationales pour la recherche animale ont été strictement suivies dans cette étude. Des cellules souches ecto-mésenchymateuses primaires ont été isolées de la muqueuse respiratoire du rat selon nos études précédentes [17, 25]. En bref, 100 g de rats Sprague Dawley (SD) adultes ont été anesthésiés avec des injections intrapéritonéales de pentobarbital sodique (0,05 g/kg). Le tiers moyen de la cloison nasale a été haché puis incubé dans une solution de trypsine à 0,25 % (Hyclone ; GE Healthcare Life Sciences) à 37 °C pendant 25 min, après quoi la muqueuse de la cloison nasale a été soigneusement décapée. Enfin, le tissu muqueux de la cloison nasale a été découpé en morceaux. La suspension résultante des tissus a été passée à travers un tamis en nylon de 100 um, centrifugée à 1000 g pendant 5 min, puis lavée deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). La suspension tissulaire a été placée dans un flacon de culture cellulaire dans un milieu de croissance (DMEM/12 contient 10 % de FBS, 100 U/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine) et cultivée à 37 °C dans 5 % de CO_{2 et 95% d'air avec une humidité saturée. Le milieu a été remplacé tous les trois jours, et les cellules ont été repiquées toutes les semaines. Les cellules dans leur troisième passage ont été utilisées pour toutes les études de caractérisation. L'immunofluorescence a été réalisée pour caractériser les cellules cultivées avec des anticorps contre des marqueurs de cellules souches, notamment la vimentine et la nestine [26].}

Identification de la capacité de différenciation multidirectionnelle des EMSC

Les EMSC ont été ensemencées dans les plaques à 6 puits et cultivées avec du milieu DEME/F12 pendant 24 h à 70 % de confluence. Le milieu a ensuite été changé avec un milieu de différenciation ostéogénique (DMEM additionné de 10 % de FBS, 0,1 mM de dexaméthasone, 10 mM de β-glycérophosphate disodique et 0,2 mM d'acide l-ascorbique) pour induire l'ostéogenèse. Le milieu a été changé tous les sept jours et la coloration d'Alizarin Red S a été réalisée avec 0,5 % d'Alizarin Red S (Sigma-Aldrich) au jour 28. Les EMSC cultivés à 90 % de confluence ont été cultivés dans un milieu de différenciation adipogène pour induire l'adipogenèse pendant 21 jours. La coloration rouge à l'huile a été réalisée avec le kit de coloration rouge à l'huile (Solarbio) selon les instructions du fabricant.

Caractérisation des BP

La microscopie électronique à balayage (MEB) a été utilisée pour caractériser la morphologie et la taille de la BP. Les échantillons ont été préparés en plaçant une goutte de la solution de BP à une concentration de 1 mg/ml dans de l'eau déminéralisée sur une grille de cuivre revêtue de formvar, puis en les séchant à l'air. Les échantillons ont été photographiés par microscopie électronique à balayage (H-7500; Hitachi, Tokyo, Japon). La taille moyenne des PA a été analysée à l'aide du logiciel image Pro Plus (Media Cybernetics Inc., MD, USA). L'évaluation du potentiel zêta a été confirmée par le calibreur zêta Malvern (ZEN3600). La diffraction des rayons X (XRD) a été réalisée avec un diffractomètre Bruker D8 Discover dans une géométrie para-focalisée de Bragg-Brentano et un rayonnement Cu Kα. Les diagrammes de diffraction ont été collectés entre 10° et 80° de 2θ avec un pas de 0,01° 2θ et un temps d'acquisition de 0,2 s par étape. Les données résultantes ont été évaluées à l'aide du logiciel HighScore Plus 3.0e. Un spectromètre Raman (LabRam HR800) avec une excitation laser à 514 nm a été utilisé pour mesurer les spectres Raman de l'échantillon. La composition de surface de l'échantillon a été mesurée par spectroscopie photoélectronique à rayons X ([XPS] Omicron NanoTechnology GmbH, Allemagne).

Test du kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8)

L'effet des BP sur la prolifération cellulaire a été évalué en utilisant le test du kit de comptage cellulaire (CCK-8). En bref, les EMSC (3000 cellules/puits) ont été étalées dans des plaques à 96 puits et traitées avec des BP (0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 et 512 μg/ml) pendant 24 h à 37 °C. Pour la détection de CCK8, 10 μl de réactif CCK8 ont été ajoutés au milieu de culture 4 h avant l'analyse. La densité optique (DO) à 450 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Thermo Fisher Scientific, Madrid, Espagne) selon les instructions du fabricant. La concentration de BP utilisée pour une enquête plus approfondie a été sélectionnée sur la base des résultats du test CCK-8. Quant à la coloration Ki-67, les EMSC (1 × 10 ⁴ ) ont été cultivés dans des plaques à 24 puits et colorés par immunofluorescence pour Ki-67 (lapin polyclonal; n° cat. ab15580; abcam; 1:300). Le DAPI a été utilisé pour colorer les noyaux. Les images ont été capturées par microscopie à fluorescence (grossissement, 200× ; eclipse Ti ; nikon corporation) et ont été analysées avec le logiciel Image Pro Plus.

Différence ostéogénique

Pour la différenciation ostéogénique, les EMSC ont été ensemencées à une densité de 3 000 cellules/cm ² et cultivées en milieu de croissance à 70 % de confluence. Les cellules ont ensuite été induites avec un milieu de différenciation d'ostéogenèse pendant 2 semaines. Notamment, afin d'éviter l'influence du -glycérophosphate de sodium, le milieu de différenciation d'ostéogenèse a été complété avec 10 % de FBS, 0,1 mM de dexaméthasone et 0,2 mM d'acide l-ascorbique (Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) mais pas avec le -glycérophosphate de sodium. Après avoir induit la différenciation, la phosphatase alcaline (ALP) et la coloration au rouge d'alizarine et la RT-qPCR ont été utilisées pour évaluer les effets des BP sur la différenciation ostéogénique des EMSC. Les EMSC ont été ensemencées à une densité de 2  × 10 ⁵ cellules/puits dans des plaques 6 puits et incubées avec du milieu ostéogénique. Selon les instructions du fabricant, la coloration ALP a été évaluée à l'aide d'un kit de coloration ALP (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) au jour 14. Une coloration au rouge alizarine S a été appliquée pour visualiser le dépôt de phosphate de calcium. En bref, les cellules fixées ont été à nouveau lavées avec de l'eau déminéralisée et incubées avec 1 ml/puits de solution de coloration au rouge d'alizarine (0,5 % (p/v) d'alizarine rouge S (Sigma-Aldrich) dans du PBS pendant 10 min à 37 °C. Après la solution a été retirée, l'échantillon a été lavé à nouveau avec de l'eau déminéralisée. La zone de coloration positive indiquant les nodules calcifiés par champ a été comptée avec le logiciel Image-Pro plus et normalisée par rapport au contrôle respectif.

RT-qPCR

La RT-qPCR a été réalisée comme décrit précédemment. Brièvement, l'ARN total a été isolé à partir de monocultures ou trié à l'aide du kit de purification d'ARN (TaKaRa, Japon), selon les instructions du fabricant. Deux microgrammes d'ARNm ont été rétro-transcrits en ADNc en utilisant un kit de synthèse d'ADNc (Fermentas). Les amorces utilisées pour la RT-PCR ont été conçues et construites par Nanjing GenScript Bioengineering Technology and Services Co., Ltd (Nanjing, Chine), présentées dans le tableau 1. La RT-PCR a été manipulée à l'aide d'un kit SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix (Fermentas) avec le système ABI Prism 7500. Les données ont été normalisées à la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) pour indiquer les niveaux d'expression relatifs. Toutes les mesures ont été effectuées en triple.

Western Blot

Les cellules cultivées ont été lavées deux fois avec du PBS puis lysées sur de la glace pendant 30 min avec du tampon de lyse RIPA contenant un cocktail inhibiteur de phosphatase et de protéase. Pour collecter la TG2 totale, les lysats cellulaires et l'ECM dans les plaques 6 puits ont été collectés par un grattoir cellulaire. Les plaques ont été lavées avec du PBS et les fluides de lavage des cellules ont également été collectés. Les lysats ont été récoltés à partir du surnageant par centrifugation à 12.000 × g pendant 5 min, mélangé avec un volume égal de tampon de chargement SDS, puis bouilli pendant 5 min. Les concentrations de protéines ont été déterminées à l'aide d'un kit de dosage de protéines BCA (Beyotime, Shanghai, Chine, P0012). Les protéines ont été extraites dans du tampon de lyse RIPA, séparées sur des gels de polyacrylamide dodécyl sulfate de sodium (SDS) et transférées par électrophorèse sur des membranes de nitrocellulose (Millipore, LA, USA). Les membranes ont été bloquées avec de l'albumine de sérum bovin (BSA) à 1 % dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS) 0,01 M contenant 0,5 % de Tween 20 (Suolaibao, Pékin, Chine) et tamponnées avec les anticorps indiqués, y compris l'anti-TG2 (1 : 200 ; sc-48387, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-FN (1:500; n° cat. BA1772; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.) et anti-LN (1:500; n° cat. BM4921; Wuhan) Boster Biological Technology, Ltd.), anti-OCN (1:200; sc-390877, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-OPN (1:200; sc-73631, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti- COL I (1:500 ; n° cat. BA0325 ; Wuhan Boster Biological Technology, Ltd.), à 4 °C pendant 12 h. Les membranes ont ensuite été mises à réagir avec de la peroxydase de raifort anti-lapin-IgG de chèvre (1 : 5000 ; Boster, Wuhan, Chine) pendant 2 h à température ambiante. Les bandes de protéines ont été visualisées à l'aide d'un substrat Pierce ECL Plus (Thermo Fisher Scientific) puis scannées avec un système d'imagerie par chimiluminescence (Clinx Science Instruments, Shanghai, Chine).

Expériences d'inhibition

Pour confirmer l'implication de TG2, des expériences d'inhibition de TG2 ont été réalisées sur des EMSC. Des expériences de neutralisation ont été réalisées avec un anticorps neutralisant anti-TG2 (de BD Biosciences, San Diego, CA). Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits avec du milieu de culture normal pendant 24 h pour adhérer et ont été traitées avec un anticorps anti-TG2 (10 μg/ml). Dans le même temps, le groupe témoin a été mis en place. Après avoir été ensemencée dans des plaques à 6 puits pendant 24 h, l'ostéogenèse EMSC a été induite pendant 14 jours en utilisant un milieu ostéogénique avec des BP (2 μg/ml), et le milieu de culture contenant des inhibiteurs a été remplacé par du milieu ostéogénique frais tous les 7 jours. Une coloration au rouge alizarine S a été appliquée pour visualiser le dépôt de phosphate de calcium. Le Western blot a été utilisé pour évaluer les niveaux d'ostéocalcine, d'ostéopontine et de collagène de type 1 (expression OCN, OPN et COL I, respectivement).

Coloration par immunofluorescence

Les cellules cultivées ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 8 h à 4 °C. Les cellules fixées ont été lavées trois fois avec du PBS et perméabilisées pendant 30 min dans du PBS contenant 0,2 % de Triton X-100 et 1 % de BSA (Suolaibao, Pékin, Chine). Après perméabilisation, ces cellules fixées ont été lavées avec du PBS puis incubées avec des anticorps primaires à 4 °C pendant 8 h suivis de l'élimination de tous les anticorps primaires. Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec du PBS et incubées pendant 2 h à température ambiante avec des anticorps secondaires Alexa Fluor-594 (1 : 800, Life Technologies Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA) à 37 °C pendant 2 h. Les noyaux ont été contre-colorés avec du 4'6-diamidino-2-phénylindole ([DAPI]; Sigma-Aldrich). Tous les groupes testés ont été observés au microscope à immunofluorescence.

Analyse statistique

Les données ont été obtenues à partir des trois expériences séparées décrites ci-dessus et présentées sous forme de moyenne   ± écart type (SD). L'analyse de la distribution des données a été effectuée en utilisant le t de l'étudiant -test pour analyser la significativité des différences entre les groupes traités et témoins. Une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie du test post-hoc de Tukey a été réalisée pour évaluer les différences significatives entre les groupes. p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

Caractérisation des BP

La distribution de la taille de la PA mesurée par diffusion dynamique de la lumière (DLS) était relativement étroite dans la plage de 100 à 200 nm avec une valeur maximale à 132 nm. Le résultat est montré sur la figure 1A. Le potentiel zêta des BP a été déterminé comme − 23,7 ± 0,65 mV (Fig. 1B), confirmant la stabilité des BP. La taille des particules a été étudiée plus avant par microscopie électronique à balayage (MEB) (Fig. 1C). Les résultats correspondent bien à la mesure de la distribution granulométrique par DLS.

Caractérisation des BP. Un Distribution de la taille des nanoparticules de phosphore noir (BP) ; B rapport de potentiel zêta de BP avec un potentiel zêta de − 23,7 ± 0,65 mV ; C images de microscopie électronique à balayage (MEB) des nanofeuillets BP (BPN). D spectres Raman des BP ; E Diffractogramme aux rayons X et F Spectres de spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS) haute résolution P 2p de BP ; G Spectres XPS des BP

La diffusion Raman (Fig. 1D) a révélé trois pics importants à 362,3, 438,5 et 466,9 cm ⁻¹ associé au mode phonon hors plan (A ¹ _g ) et deux modes dans le plan (B ² _g et A ² _g ) de BP, [17, 18], respectivement. XRD (Fig. 1E) montre la pureté de phase du matériau préparé, avec une taille cristalline moyenne de 102,7 nm. L'élargissement du diagramme de diffraction indique la taille nanométrique des cristallites individuels. Les spectres XPS haute résolution de P 2 p (Fig. 1F) montrent le pic principal à 130 eV correspondant à la liaison P–P du phosphore noir en plus d'un pic supplémentaire à 135 eV provenant des liaisons P–O causées par l'oxydation de surface des BP. Les surfaces BP ont été examinées par radiographie à large balayage (Fig. 1G).

Caractérisation des EMSC

La coloration par immunofluorescence de la muqueuse nasale a montré que les EMSC positifs pour la nestine étaient situés dans la lamina propria sous l'épithélium respiratoire de la cloison nasale (Fig. 2A). Les EMSC cultivées au troisième passage sont apparues comme des cellules de type fibroblastique et ont proliféré rapidement sur des plaques en plastique (Fig. 2B). Nous avons évalué la différenciation ostéogénique dans le milieu ostéogénique par coloration au rouge alizarine au jour 28 (Fig. 2C). La différenciation adipogène dans le milieu d'induction adipogène a été évaluée au jour 21 par coloration avec une solution d'huile rouge-O (Fig. 2D). La coloration par immunofluorescence a montré que presque tous les EMSC exprimaient des marqueurs cellulaires de la crête neurale, tels que la nestine (> 95 %) comme indiqué sur la figure 2E et la vimentine (>   95 %) comme indiqué sur la figure 2F. Les résultats de la co-expression des marqueurs de cellules souches indiquent que ces EMSC sont un type de cellule souche mésenchymateuse.

Identification des cellules souches mésenchymateuses ectodermiques (EMSC). Un Les EMSC positifs pour la nestine (cy3, rouge) étaient situés dans la lamina propria sous l'épithélium respiratoire de la cloison nasale ; B Une image en contraste de phase a montré que les EMSC cultivées au troisième passage apparaissaient comme des cellules de type fibroblastique et proliféraient rapidement sur des plaques en plastique; C Les EMSC différenciées ostéogéniques en milieu ostéogénique ont été colorées au rouge d'alizarine; D Les EMSC différenciées adipogènes dans un milieu d'induction adipogène ont été colorées avec de l'huile rouge-O ; E , F La coloration par immunofluorescence des marqueurs des cellules de la crête neurale a montré que presque tous les EMSC exprimaient la nestine et la vimentine. L'IgG-Cy3 (rouge) a été utilisé comme deuxième anticorps pour la coloration par immunofluorescence et les noyaux ont été contre-colorés avec Hoechst 33342 (bleu)

Cytotoxicité

À titre d'expérience préliminaire, le dosage de la CCK-8 a été effectué pour évaluer la cytotoxicité des BP. La viabilité des EMSC après 24 h d'exposition aux BP est illustrée à la figure 3. Aucune cytotoxicité significative après exposition jusqu'à 32 μg/ml de BP n'a été notée. Cependant, l'exposition aux BP provoque une cytotoxicité significative à des doses plus élevées (> 32 μg/ml). L'expression de Ki-67 dans le nucléole et les chromosomes a été observée dans le groupe à faibles doses (Fig. 4A–C). Cependant, le rapport entre les noyaux positifs au Ki-67 et la population totale de noyaux n'a montré aucune différence significative dans les EMSC traités par BP à faible dose par rapport aux témoins non traités (Fig. 4D). Par conséquent, dans la présente étude, nous choisissons des concentrations de 2 et 4 μg/ml de BP dans les expériences suivantes dans lesquelles aucune cytotoxicité significative n'a été observée.

La cytotoxicité des BP. Les cellules ont été traitées avec des BP (0, 2, 4, 8, 16, 32, 64 128, 256 et 512 µg/ml) pendant 24 h, et la viabilité de l'EMSC a été testée par le test de prolifération du kit de comptage cellulaire (CCK-8) (n = 9). Les données ont été exprimées en moyenne  ± écart type (SD). **p < 0,01.

L'évaluation de la prolifération cellulaire du groupe traité par les BP. Les EMSC ont été traités avec des BP (0, 2 et 4 μg/ml) pendant 24 h. La prolifération cellulaire a été mesurée par coloration immunofluorescente avec un anticorps anti-Ki67 (rouge) et DAPI (bleu), et des images fusionnées ont été affichées (A –C ). Les cellules Ki67-positives parmi les cellules positives au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ont été comptées dans deux champs à haute puissance dans chacune des trois plaques. Les données sont exprimées en moyenne  ± SD (D ).

Coloration au rouge alizarine S

Comme le montre la figure 5A, la minéralisation dans les cellules a été évaluée par coloration au rouge alizarine S après avoir été traitées avec le milieu conditionné pendant 14 jours. Des nodules de calcium ont tous été observés dans trois groupes, tandis que des nodules de calcium non façonnés étaient présents dans le groupe témoin. Par rapport au groupe témoin, les nodules de calcium déposés dans les groupes 2 et 4 μg/ml étaient plus gros (p < 0,05), mais aucune différence évidente n'a été observée entre les groupes de traitement (p> 0,05) comme indiqué sur la figure 5C.

Tests de coloration de la phosphatase alcaline (ALP) et du rouge alizarine. Un EMSC différenciés ostéogéniquement colorés avec une solution de rouge alizarine au jour 14 ; B La coloration ALP a été visualisée au microscope; C le graphique montre la quantification des zones de dépôt de rouge alizarine ; D une activité ALP significativement plus élevée a été montrée dans le groupe EMSC traité par BP que dans le groupe témoin. Les données ont été exprimées sous forme de moyenne  ± SD. **p < 0,01

Tests ALP

La coloration ALP a été réalisée pour étudier la différenciation ostéogénique des EMSC. Par rapport à ceux du groupe témoin, les EMSC dans les groupes BP à 2 et 4 μg/ml étaient de couleur plus foncée (Fig. 5B), suggérant que l'ajout de BP a entraîné une amélioration de l'expression de l'ALP dans les EMSC. Les cellules traitées avec les BP avaient une activité ALP plus élevée que le groupe témoin au jour 7 (p> 0,05), mais aucune différence significative entre 2 et 4 μg/ml n'a été observée (p> 0,05) comme le montre la figure 5D.

RT-qPCR

Les principaux marqueurs de différenciation, y compris le facteur de transcription 2 lié à l'avorton (RUNX 2), l'ALP, le COL 1, l'OCN, l'OPN et la protéine morphogénique osseuse 2 (BMP-2), ont été analysés au jour 14, comme le montre la figure 6. Expression. de tous ces marqueurs géniques a été trouvé dans les trois groupes de cellules au jour 7. Aucune différence évidente dans l'expression génique entre les groupes 2 et 4 μg/ml n'a été trouvée. Cependant, par rapport aux cellules témoins, l'expression des gènes décrits ci-dessus dans les cellules traitées par BP était significativement augmentée.

Les BP potentialisent l'ostéogenèse des EMSC. Les EMSC ont été cultivés dans un milieu ostéogénique avec 0 μg/ml, 2 μg/ml, 4 μg/ml de PA pendant 14 jours. L'expression des gènes impliqués dans l'ostéogenèse des EMSC a été quantifiée par amplification en chaîne par polymérase (RT-qPCR) quantitative à transcriptase inverse. **p < 0,01, *p < 0,05.

Les BP améliorent l'ostéogenèse des EMSC en régulant à la hausse l'expression de TG2

Étant donné qu'un impact significatif de TG2 sur la différenciation médiée par les intégrines et le dépôt d'ECM a été démontré pour un large éventail de cellules, nous avons examiné si les BP favoriseraient la différenciation ostéogénique des EMSC via une régulation positive de l'expression de TG2. Comme le montre la figure 7, nous avons détecté une régulation positive évidente de la TG2 intracellulaire et extracellulaire dans les groupes traités par BP. La laminine (LN) et la fibronectine (FN) dans les cellules traitées à 2 et 4 μg/ml de BP étaient plus élevées que celles du groupe témoin (Fig. 7A). Les EMSC exposés aux BP ont montré une augmentation d'environ deux fois des niveaux de TG2 par rapport au groupe témoin, mais aucune différence significative n'a été observée entre les groupes traités par BP (Fig. 7B). En tant que protéine macromoléculaire, l'anticorps anti-TG2 n'a pas réussi à traverser les membranes cellulaires. Ainsi, la TG2 extracellulaire a été bloquée par l'anticorps et n'a pas réussi à réticuler divers facteurs de croissance et protéines ECM. Les résultats de l'Alizarine Red S (Fig. 8A, C) ont montré que l'anti-TG2 supprimait de manière marquée l'augmentation des dépôts de calcium et d'ECM induite par la BP. Pendant ce temps, comme le montre la figure 8D, l'anti-TG2 a inhibé de manière significative l'augmentation de l'activité ALP des cellules traitées par BP. Moreover, anti-TG2 effectively abolished the effects of BPs on the bone matrix proteins expression, including OCN, OPN, and COL I (Fig. 9).

Transglutaminase 2 (TG2) was involved in the osteogenic differentiation of EMSCs. EMSCs were incubated with BPs (2 and 4 μg/ml) for 14 days, and fibronectin (FN), LN, and TG2 levels were assessed by immunoblotting. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05.

Osteogenic differentiation of EMSCs with TG2 neutralizing antibody. A ALP staining. B ARS staining performed to examine extracellular mineralization. C Quantitative ALP analysis. D Quantitative Alizarin red staining analysis. **p  < 0.01

Anti-TG2 inhibited BP-induced EMSC osteogenic differentiation. A Representative western blots of osteoponin, osteocalcin, and collagen 1 (OPN, OCN, LN, FN, and COL I, respectively) in differentiated EMSCs following treatment with 2 μg/ml BPs and 2 μg/ml anti-TG2 or 2 μg/ml BPs alone. B Quantification of OPN, OCN, and COL I protein expression. Data were expressed as mean ± SD. **p  < 0.01; *p  < 0.05

Discussion

To the best of our knowledge, modification of phosphorus was first exhaustively studied as early as 1914; unfortunately, these studies did not receive much attention for an entire century [27]. Phosphorus is one of the essential elements making up about 1% of the total body weight as a bone component in the human body [28], while most of the other materials cannot warrant such a natural biocompatibility. In 2014, BP was introduced as a new member of the 2D layered materials.

In this study, the BP nanoparticles were prepared on a large scale from bulk BP crystals by using an improved mechanical grinding and continuous ultrasound method. Compared with other methods, this ultrasound and mechanical grinding synthesis is facile and efficient and enables production of BPs on a large scale. For characterization of BPs, SEM was carried out to examine the morphology of BPs. SEM images illustrated that BPs were successfully synthesized, and the typical sizes of BPs are about 100 to 150 nm. The size of particles was further investigated using DLS in the relatively narrow range around 133 nm. The result of SEM corresponded well with the measurement of particle size measurements based on DLS. Interestingly, previous studies demonstrated that BP with larger lateral size has higher cytotoxicity than small BP, while ultra-small BPs were even considered nontoxic up to the high concentration of 1000 μg/ml [29, 30]. Thus, for biomedical applications, the BP nanomaterials still need further study. In addition, Raman scattering revealed the presence of three prominent peaks at 361.5, 437.1, and 465.2 cm ⁻¹ that were associated with the out-of-plane phonon mode (A ¹ _g ) and two in-plane modes (B ² _g and A ² _g ) of BPs. These results were consistent with previous reports [31] in which showed that the BPs had been prepared successfully from bulk BP. XRD shows the phase purity of the prepared BPs. Broadening of the diffraction pattern indicates the nanometer size of individual crystallites.

To evaluate the stability and degradation rate of BPs, Wang and co-workers performed an experiment in which normalized absorption spectra of the BP nanosheets were dispersed in water and exposed to air. After 6 days, they found that the absorbance of the BP nanosheets at 450 nm decreased by 43% compared to the initial value, indicating that BP is easily degraded in the physiological environment [32]. Also, it is well-known that BP is sensitive to water and oxygen, but this shortcoming is considered a merit for biomedical applications. Because of these special characteristics compared with other biomaterials, BPs could potentially avoid material accumulation in human body and then reduce cytotoxicity caused by such material noumenon.

Since MSCs play key roles in bone formation, there is no doubt that transplanting MSCs in animal models of bone defects enhance bone regeneration and promotes functional recovery via BMSC acquisition [33]. Unfortunately, BMSC acquisition procedures are painful for the donor and frequently cause surgical site infection, and the number of harvested BMSCs is low [34]. Previous studies from our laboratory and other reports have shown that EMSCs could be isolated from several adult tissues, such as dental pulp and the nasal mucosa, without causing invasive injury. Moreover, EMSCs were easily induced into osteoblasts, rendering those cells as promising seed cells for bone tissue engineering. Therefore, EMSCs were used in this study. We attempted to obtain the maximum safety BP concentration for EMSCs. As shown in the results, we achieved the maximum safe concentration of BPs (less than 64 μg/ml). The concentrations of 2 and 4 μg/ml of BPs were chosen for further study to avoid any possible potential toxic. The Ki-67 assay was also used to quantify and evaluate EMSC proliferation in these samples after treating these cells with BPs (2 and 4 μg/ml) for 24 h. We did not observe any statistically significant suppression of EMSCs growth in the case of BPs. Meanwhile, our results indicate that during treatment with safe concentrations of BPs, promotion of EMSCs proliferation also occurred.

Some reports have shown that the concurrent binding of BP and calcium ions may benefit osteogenic differentiation, thereby leading to enhanced bone regeneration [35, 36]. To investigate these effects, in vitro EMSCs exposed to BPs were used in osteogenic differentiation experiments. Interestingly, the results of the ALP test and Alizarin Red S staining show that exposure to BPs could promote rather than compromise osteogenetic differentiation of EMSCs compared to the control group. Similar findings have been reported in which phosphorus-rich materials can stimulate mineralization and bone regeneration. Co-expression of osteogenesis-related genes, including ALP, OPN, OCN, COL1, and RUNX2, in differentiated EMSCs was detected at days 7 and 14 by RT-qPCR. Indeed, the expression levels of these osteogenic genes significantly increased in differentiated EMSCs treated with BPs, also providing confirmation of the osteogenic potential of the BPs. Similar results were reported in which BP could induce both the proliferation and osteogenic differentiation of human pre-osteoblast cells. Together these results indicate that the BPs were able to induce osteogenic differentiation of EMSCs.

It can be asked, “How do BPs promote osteogenetic differentiation of EMSCs?” It is well accepted that phosphorus can capture Ca ²⁺ in vivo to form calcium phosphate deposits that accelerate bone regeneration, while BP can be the resource of phosphorus ions [36]. Tong et al. believes that BP generate mild heat (40–42 °C), which causes up-regulation of heat shock protein (HSPs) expression and stimulates bone regeneration [37, 38]. Moreover, in this study, the upregulated activation of TG2 levels was also observed in BPs treatment groups. To the best of our knowledge, TG2 has important enzymatic and non-enzymatic functions at these locations in which it crosslinks various ECM proteins and modulates the interactions of cells with the ECM and soluble growth factors by non-covalent interactions with and regulation of integrins [39,40,41]. Obviously, the BPs can react strongly with oxygen and water and finally degrade to non-toxic phosphate in aqueous solutions, which is a crucial component of ATP. Nakano Y et al. reported that ATP can act as a significant phosphate (Pi) source for mineralization in MC3T3-E1 osteoblast cultures, indicating that ATP-hydrolyzing enzymes could induce mineral deposition [42]. They also found that TG2 could not only act as a phosphatase but could be involved in ATP hydrolysis in the osteoblast cultures thus further contributing to the elevation in Pi levels required for mineral deposition, which may be beneficial to EMSC energy metabolism. This process may be part of the contribution that BPs makes toward enhancement of EMSC osteogenic differentiation. On the other hand, thanks to TG2 bio-functions, a wide variety of ECM adhesion proteins, including LN, COL I, and FN, could maintain a stable state. Indeed, in the present study, we observed that ECM (FN, COL I, and LN) were significant higher in BP-treated EMSC groups. BPs provide a favorable ECM microenvironment for promoting greater osteogenic EMSC differentiation and proliferation.

Until now, no secretory signal sequences and hydrophobic or transmembrane domains have been clearly identified in TG2 because the protein is not localized in the endoplasmic reticulum (ER)/Golgi compartments [39, 43], and only few studies reported about these factors that control TG2’s secretion. Therefore, it remains unclear as to the exact mechanism of BP regulation of expression patterns of TG2 in the progress of EMSC osteogenic differentiation.

Conclusion

In the present study, BPs were successfully fabricated using mechanical grinding and continuous ultrasound method. At bio-safe concentrations, BPs activated TG2, and promoted the expression of ECM, which further promoted osteogenic differentiation of EMSCs. From these results, we can conclude that BPs would be suitable for incorporation into tissue-engineered scaffolds that utilize EMSCs to repair bone defects. Although our research highlights the great potential of BPs in nano-biomedicine, large-scale preclinical and clinical studies concerning its safety are needed before any clinical applications are established.

Disponibilité des données et des matériaux

The datasets generated during and/or analyzed during the study are available from the corresponding author on reasonable request.

Abréviations

BPs:

Black phosphorus nanoparticles

EMSCs:

Ectodermal mesenchymal stem cells

TG2:

Transglutaminase 2

2D :

Two-dimensional

ECM:

Extracellular matrix

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

NMP:

N -Methyl-2pyrrolidone

PBS:

Phosphate-buffered saline

DMEM/F12:

Dulbecco's modified Eagle's medium/nutrient mixture F12

FBS:

Fetal bovine serum

SD:

Sprague Dawley

SEM:

Scanning electron microscopy

XPS :

Spectroscopie photoélectronique aux rayons X

CCK-8:

Cell counting kit

OD:

Optical density

RT-qPCR:

Reverse transcriptase polymerase chain reaction

GAPDH:

Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

BSA:

Bovine serum albumin

TBS:

Tris-buffered saline

DAPI:

4′6-Diamidino-2-phenylindole

DLS:

Dynamic light scattering