Démonstration d'un biocapteur flexible à base de graphène pour la détection sensible et rapide des cellules cancéreuses de l'ovaire

Introduction

Le cancer de l'ovaire est le deuxième cancer gynécologique le plus fréquent et a la mortalité la plus élevée parmi les cancers gynécologiques [1, 2]. Jusqu'à présent, les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire sont généralement diagnostiquées très tardivement en raison des symptômes non spécifiques du cancer de l'ovaire et du manque de méthodes de dépistage précoce efficaces. L'imagerie associée à l'antigène glucidique CA125 peut être utilisée pour la détection, le diagnostic des récidives après chirurgie ou chimiothérapie. Le CA125 n'est pas un marqueur précis unique du cancer de l'ovaire car il est affecté par de nombreux facteurs et a une valeur prédictive faussement positive élevée. La sensibilité du CA125 élevé (> 35 U/mL) que nous avons utilisé dans le diagnostic de la récidive du cancer de l'ovaire est inférieure à 70 % [3]. L'examen échographique et l'examen radiologique n'ont pas non plus de sensibilité ni de spécificité adéquates pour la détection précoce et le diagnostic des récidives. Les taux de survie à 5 ans du cancer de l'ovaire aux stades I et II sont de 90 % et 70 % séparément [4]. Malgré l'avancée du traitement chirurgical et du traitement adjuvant, le taux de survie à 5 ans du cancer de l'ovaire à un stade avancé est inférieur à 30 % [4]. La détection précoce du cancer de l'ovaire est liée au taux de survie à 5 ans manifestement plus élevé, et le diagnostic précoce de la récidive est également important. Plusieurs nouvelles approches telles que l'auto-anticorps TP53, les tests de méthylation de l'ADN, les algorithmes de microARN, l'analyse cytologique de type Pap ont été rapportées pour améliorer la sensibilité de la détection précoce du cancer de l'ovaire [5]. Cependant, il est urgent mais toujours difficile de développer une nouvelle méthode de détection avec une sensibilité plus élevée pour tous les stades du cancer de l'ovaire.

Récemment, des chercheurs ont découvert que les tumeurs à un stade précoce peuvent se répandre dans les cellules cancéreuses dans la circulation sanguine et provoquer des métastases [6]. Les cellules pénètrent dans la circulation sanguine périphérique par intravasation à partir de tumeurs primaires, de récidives ou de métastases appelées cellules tumorales circulantes qui peuvent être utilisées comme biomarqueurs diagnostiques ou pronostiques pour les tumeurs solides [7]. Les CTC sont rares dans le sang périphérique et les méthodes de détection nécessitent une sensibilité et une spécificité élevées. Ces dernières années, la séparation immunomagnétique, la séparation microfluidique, les méthodes basées sur des filtres et la PCR ciblée par ligand ont été signalées dans la détection de CTC [8,9,10,11]. À ce jour, le système de recherche de cellules de Janssen Diagnostics est la seule méthode de détection de CTC approuvée par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis, qui peut être utilisée pour surveiller les patients atteints de cancers métastatiques du sein, colorectal et de la prostate [12,13,14]. La détection de la CTC dans le cancer de l'ovaire offre une méthode de diagnostic non invasive et présente un avantage lorsqu'elle est difficile à réaliser pour la biopsie. Cependant, le taux de détection des CTC au stade précoce du cancer de l'ovaire est encore faible. Les nouvelles méthodes pour détecter les CTC avec une sensibilité plus élevée sont toujours nécessaires. Si nous pouvons facilement détecter le CTC chez les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire, il peut être utile à la fois pour la détection précoce des tumeurs, le suivi des récidives et l'effet du traitement.

Le graphène, un semi-conducteur bidimensionnel a été isolé par Andre Geim et Kostia Novoselov en 2004 [15]. Récemment, les matériaux 2D de type graphène ont été largement appliqués dans la détection et la biodétection, la conversion et le stockage d'énergie, la catalyse, les composites et les revêtements, l'électronique et le domaine biomédical [15]. Le capteur de graphène est un candidat prometteur pour détecter les biomarqueurs du cancer en raison de sa structure unique et de ses excellentes performances électriques, qui ont été développées pour détecter l'antigène carcino-embryonnaire, l'antigène spécifique de la prostate, l'antigène glucidique 19-9 et 15-3 [16,17,18,19 ]. Par rapport aux biocapteurs conventionnels à base de graphène fabriqués sur SiO₂ rigide / Substrats Si par photolithographie conventionnelle, processus d'évaporation d'électrode, de décollage et d'ensemble de capteurs utilisant des installations précieuses, il est important de développer une approche peu coûteuse et facile pour fabriquer des biocapteurs flexibles à base de graphène avec une sensibilité élevée et une vitesse de détection rapide.

Pour résoudre ces problèmes, nous développons ici une approche nouvelle et facile pour fabriquer un biocapteur flexible à base de graphène sur un substrat PET. Deux électrodes ont été directement fabriquées sur graphène/PET en utilisant de la pâte d'argent, et le pool de cellules a été directement construit en utilisant du gel de silicone; ce biocapteur flexible peut être fabriqué à la main dans n'importe quel laboratoire sans avoir besoin de processus de photolithographie et d'installations précieuses. Étonnamment, nos biocapteurs flexibles à base de graphène sont très sensibles et peuvent détecter rapidement les cellules cancéreuses de l'ovaire. Pour autant que nous le sachions, il n'y a pas encore de rapports sur les biocapteurs flexibles à base de graphène pour la détection des cellules cancéreuses de l'ovaire.

Matériaux et méthodes

Croissance et transfert du film de graphène

Dans ce travail, le film de graphène a été cultivé à la surface d'une feuille de Cu (Alfa Aesar, n° 13382) par dépôt chimique en phase vapeur (CVD) [20]. Tout d'abord, l'oxyde de surface de la feuille de Cu a été éliminé par une solution d'acide chlorhydrique à 20 % pendant 5 min ; ensuite, la feuille de Cu a été nettoyée plusieurs fois avec de l'eau désionisée, puis séchée avec un flux d'azote. La feuille de Cu nettoyée a été placée sur une nacelle en quartz et placée dans le tube de quartz du four CVD. La chambre du four a été pompée à 1 × 10 ^–2 Pa. La température du four a été augmentée jusqu'à 1000 °C pendant 20 min avec 50 sccm de 99,999 % H₂ , puis 50 sccm de méthane à 99,999 % ont été introduits dans le tube pour la croissance d'un film de graphène de grande surface pendant 20 min. Enfin, le four CVD a été refroidi à température ambiante avec CH₄ /H₂ débit de gaz.

La feuille de graphène/Cu de grande surface a été coupée en plusieurs morceaux souhaités. Ensuite, le PMMA a été déposé par centrifugation sur la surface d'une feuille de graphène/Cu, formant la structure en sandwich PMMA/graphène/Cu. Par la suite, la feuille de Cu sous-jacente a été gravée avec 1 M de FeCl₃ Solution. Le PMMA/graphène a été nettoyé dans de l'eau DI pendant 30 min puis transféré sur le substrat PET. Enfin, le PMMA a été éliminé par de l'acétone et un échantillon de graphène/PET a été obtenu.

Fabrication de biocapteurs à base de graphène

La procédure de fabrication de biocapteurs à base de graphène est décrite comme suit. Tout d'abord, un film de graphène d'environ 1 cm × 2 cm sur une feuille de Cu a été transféré sur un substrat PET de 1 cm × 2 cm par la méthode de transfert humide assistée par PMMA. Ensuite, deux électrodes ont été fabriquées près du centre du film de graphène/PET en utilisant de la pâte d'argent. Enfin, afin de tester la réponse électrique de la solution de cellules cancéreuses, un pool de cellules de plusieurs millimètres de longueur et de largeur et d'environ 1 mm de hauteur a été construit en gel de silicone au bord de l'électrode. Une fois que le gel de silicone du pool cellulaire est complètement solidifié, on peut utiliser l'analyseur de semi-conducteurs Agilent 4155B pour vérifier si le biocapteur au graphène peut fonctionner normalement.

Culture des cellules de cancer de l'ovaire SKOV3

Des séries de cellules de cancer de l'ovaire SKOV3 (fournies par le laboratoire public du Second Affiliated Hospital of West China) ont été cultivées dans un milieu complet RPMI-1640 (Transgene, France) contenant 10 % de sérum de veau (MRC, USA) dans des conditions de 5 % de CO ₂ et 37 °C.

Préparation de la solution cellulaire et mesure électrique

Les cellules cancéreuses ont été diluées à une concentration spécifique avec du milieu de culture cellulaire. Prenez 50μL de solution cellulaire avec une pipette dans la rainure pour la mesure. Le signal électrique a été enregistré par l'analyseur de semi-conducteurs Agilent 4155B.

Résultats et discussion

La photographie de 10 × 10 cm ² un film de graphène cultivé par CVD sur une grande surface sur une feuille de Cu est illustré à la Fig. 1 a. À partir de la figure 1a, on peut observer que par rapport à une feuille de Cu nue avec une couleur métallique brillante, la couleur du graphène/Cu est un peu plus foncée. Le spectre Raman correspondant du graphène/Cu est illustré à la figure 1b. Comme le montre la figure 1b, le Raman culmine à 1 580 cm ⁻¹ et 2680 cm ⁻¹ correspondent aux pics G et 2D du film de graphène. Afin de vérifier davantage la qualité du film de graphène, nous avons mesuré le spectre Raman du film de graphène monocouche transféré sur SiO₂ Substrat /Si, comme le montre la figure 1c. On peut observer que le rapport entre I _G et Je _2D est inférieur à 0,5, ce qui confirme que l'épaisseur du graphène est monocouche; on peut également observer que le pic D est très faible et quasiment inobservable, ce qui suggère que la qualité du film de graphène est très élevée et les défauts sont très peu nombreux.

un Photographie d'une feuille de Cu nue (panneau de gauche) et de graphène cultivé sur une feuille de Cu (panneau de droite), b Spectre Raman du graphène/Cu, et c Spectre Raman du graphène/SiO₂ /Si

Les photographies de biocapteurs flexibles en graphène sur des substrats PET sont présentées sur la figure 2. La solution de cellules cancéreuses peut être ajoutée au pool cellulaire et le signal électrique du biocapteur en graphène peut être obtenu à partir de deux électrodes en pâte d'argent. La réponse électrique pour le milieu de culture cellulaire et la solution CTC ont été mesurées.

Photographie d'un biocapteur graphène/PET

La dépendance temporelle de la réponse actuelle pour de tels liquides est enregistrée à une tension fixe de 0,01 V avant et après leur mise dans le pool de cellules. Comme le montre la figure 3, on peut observer qu'avant de plonger un tel liquide, le courant reste constant ; lorsque de tels liquides ont été mis dans le pool cellulaire, le courant diminue rapidement puis garde lentement un nouvel équilibre. La réponse est définie comme η = (Je ₀ − Je )/Je ₀ *100%, où Je ₀ est le courant juste avant de plonger le liquide, et I est la valeur maximale (ou minimale) après avoir plongé le liquide à un moment donné. On peut voir qu'après avoir mis de tels liquides, la résistance du graphème augmente. La réponse électrique pour le milieu de culture cellulaire nue et la solution CTC avant et après trempage de la solution 200 s sont respectivement de 2,96 % et 37,04 %. De toute évidence, par rapport au milieu de culture cellulaire nu, la réponse électrique de la solution CTC même avec 30 cellules/ml est très significative, ce qui suggère que le biocapteur flexible à base de graphène est très sensible pour la détection des cellules cancéreuses.

un Réponse électrique pour le milieu de culture cellulaire nu, et b solution anticancéreuse avec 30 cellules

La dépendance temporelle du signal électrique pour le milieu de culture cellulaire nue et la solution de CTC avec 30 cellules cancéreuses/ml est analysée plus en détail à partir de la figure 3. Comme le montre la figure 4, on peut observer que par rapport à celle du milieu de culture cellulaire nue, l'électricité la réponse pour la solution CTC (même à 30 cellules/ml) est très sensible et rapide. Après avoir trempé la solution cellulaire, il suffit de 2,1, 2,0, 4,5, 7,5, 10,5, 28,5 s pour atteindre une réponse de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, tandis que la réponse de la culture cellulaire correspondante moyen n'augmente que de 0,15 à 1,3 %. Cela signifie que le biocapteur au graphène flexible est très approprié pour une détection rapide et sensible en 5 s.

Dépendance temporelle de la réponse électrique pour le milieu de culture cellulaire et la solution CTC

Nous avons également étudié la réponse électrique de deux types de cellules cancéreuses CTC (cellules SUDHL8 et cellules OCILYS) avec les mêmes concentrations de 10 000 (10 K)/ml. Comme le montre la figure 5, la dépendance temporelle du courant pour deux cellules cancéreuses différentes avec une tendance légèrement différente et une grande différence de réponse électrique. Cela signifie que le biocapteur au graphène promet d'être utilisé pour identifier différentes cellules cancéreuses.

Dépendance temporelle de la réponse électrique pour différentes cellules cancéreuses :a SUDHL8, et b OCILYS

La dépendance temporelle du courant électrique et de la réponse pour la solution de cellules cancéreuses SUDHL 8 avec diverses concentrations cellulaires de 10 000 (10 K)/ml et 100 K/ml a également été étudiée. Comme le montre la figure 6, on peut observer qu'une solution avec une concentration de cellules cancéreuses plus faible montre un courant plus élevé, ce qui suggère que la cellule cancéreuse a tendance à être isolante et que beaucoup plus de cellules ne sont pas bénéfiques pour la conduction. La dépendance temporelle de la réponse pour deux solutions de concentration montre des tendances de changement similaires et la réponse pour une solution à plus faible concentration est un peu plus élevée que celle d'une solution à plus forte concentration. Ces résultats montrent que le biocapteur peut être utilisé pour identifier une solution cancéreuse avec différentes concentrations.

Dépendance temporelle du courant électrique (a ) et la réponse (b ) pour les cellules cancéreuses SUDHL8 avec différentes concentrations de 10 K et 100 K cellules/ml

Comme mentionné ci-dessus, les résultats montrent qu'un biocapteur à base de graphène bon marché et flexible présente une réponse différente pour le milieu de culture cellulaire et la solution cancéreuse, différentes cellules cancéreuses et solution de cellules cancéreuses avec différentes concentrations, ce qui suggère qu'un tel biocapteur flexible à base de graphène promet d'être utilisé pour détecter et identifier les cellules cancéreuses de l'ovaire CTC.

Conclusion

Afin de développer une méthode de détection précoce efficace en particulier pour le cancer de l'ovaire, nous développons un biocapteur flexible à base de graphène très simple sur substrat PET. Ce biocapteur flexible se compose d'un pool de cellules et de deux électrodes et compare le signal électrique avant et après l'ajout de solution cellulaire, ce qui montre une sensibilité élevée et une vitesse de détection rapide. Il montre des réponses différentes évidentes pour le milieu de culture cellulaire et la solution cancéreuse, différentes cellules cancéreuses et solution de cellules cancéreuses avec différentes concentrations. Notre travail indique que le biocapteur flexible à base de graphène promet d'être utilisé pour détecter/identifier avec sensibilité et rapidement les cellules cancéreuses de l'ovaire CTC.

Disponibilité des données et des matériaux

Les auteurs peuvent confirmer que toutes les données pertinentes sont incluses dans l'article et ses fichiers d'informations supplémentaires.

Abréviations

CA :

Antigène glucidique

CTC :

Cellule tumorale circulante

PET :

Polyéthylène téréphtalate

FDA :

Administration des aliments et des médicaments

CVD :

Dépôt chimique en phase vapeur