Nanohydrogel ADN à activité immunostimulatrice antitumorale puissante

Résumé

Les oligodésoxynucléotides CpG non méthylés (CpG-ODN) sont de puissants activateurs de l'immunité innée et adaptative, mais leur dégradation rapide dans le sérum limite l'utilité clinique. Nous avons conçu des nanohydrogels CpG-MCA par amplification de chaîne multi-amorcée (MCA), générant des hydrogels riches en répétitions CpG en tandem. Les gels CpG-MCA résultants résistent à la dégradation nucleasique, sont facilement internalisés par les macrophages RAW264.7, et déclenchent une sécrétion robuste du facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) et de l'interleukine-6 (IL-6). En co-culture avec cellules glioma humain U251, gels CpG-MCA suppriment markedly prolifération cellules tumorales, surpassant CpG-ODN conventionnel et gels CpG-RCA. Ces résultats démontrent que nanohydrogels CpG-MCA sont un immunostimulant puissant, biocompatible, avec forte activité anti-tumorale.

Introduction

L'ADN bactérien contenant motifs CpG non méthylés sert adjuvant efficace et agent anticancéreux en engageant récepteur Toll-like 9 (TLR9) sur cellules dendritiques, macrophages, autres cellules immunitaires. Cependant, CpG-ODN sujet adsorption protéines et digestion nucleasique, compromettant stabilité puissance in vivo. Encapsulation véhicules délivrance ou auto-assemblage nanostructures ADN d'ordre supérieur amélioré stabilité internalisation cellulaire, dochallenges cytotoxicité limitée chargement persistent.

Nanomatériaux ADN — tétraèdres, réseaux X-formés, réseaux hydrogel — montré internalisation cellulaire accrue induction cytokines comparé oligonucleotides linéaires. Amplification cercle roulant (RCA) produit hydrogels nano-fleurs protégeant motifs CpG boostant signalisation immune. Sur ce concept, nous employons amplification chaîne multi-amorcée (MCA) produire hydrogels CpG-MCA, contenant milliers répétitions CpG formant structures nano-fleurs. Nous hypothésons ces hydrogels fourniront stabilité, internalisation, immunostimulation supérieures, inhibant croissance tumeurs solides.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Tous oligonucleotides synthétisés (Sangon Biotech, Shanghai) purifiés HPLC. Réactifs MCA RCA, incluant polymérase ADN phi29, ligase T4 ADN, dNTPs, tampons, obtenus Thermo Fisher New England Biolabs. Lignées cellulaires RAW264.7 (macrophage souris) U251 (gliome humain) sourcées Académie Chinoise Sciences. Kits ELISA (R&D Systems) CCK-8 (Dojindo) utilisés quantification cytokines essais viabilité.

Préparation modèles ADN circulaires

ADN simple brin (SS-ADN) phosphorylé contenant amorces CpG recuit 95 °C 5 min refroidi 4 °C. Ligase ajoutée overnight 4 °C former modèles circulaires ; enzymes inactivées 75 °C 10 min.

Construction hydrogels CpG-MCA CpG-RCA

Aliquote 10 µL modèle circulaire mélangée 1× tampon phi29, 4 mM dNTPs, 5 U polymérase phi29 volume 50 µL. Incubation 30 °C 12 h produisait gel RCA (R12). Pour MCA, après 4 h RCA, 500 pM amorces 2 3 ajoutées mélange incubé temps restant (R4M4 R4M8). Polymères inactivés chaleur 65 °C purifiés ultrafiltration.

Caractérisation

Électrophorèse gel agarose confirmait formation hydrogels. MET MEB révélaient morphologies nano-fleurs 100 nm plusieurs micromètres. Cytotoxicité évaluée CCK-8 ; internalisation visualisée marquage Cy5 microscopie confocale ; sécrétion cytokines mesurée ELISA ; expression gènes quantifiée qRT-PCR.

Essai stabilité

Hydrogels incubés 10 % FBS-DMEM ou PBS 37 °C ; ADN résiduel quantifié NanoDrop, patrons dégradation monitorés électrophorèse gel agarose.

Co-culture cellules U251

Cellules RAW264.7 ensemencées chambre supérieure Transwell ; cellules U251 chambre inférieure. Après 24 h traitement CpG-ODN, CpG-RCA, ou gels CpG-MCA, prolifération U251 évaluée essai clonogénique.

Résultats et discussion

Formation modèles circulaires amplification réussie confirmée gel agarose : produit MCA (R4M4/R4M8) produit RCA (R12) affichaient rétention poids moléculaire élevé apparence nano-fleurs MET/MEB.

Imagerie confocale démontrait gels CpG-MCA efficacement internalisés cellules RAW264.7, intensité fluorescence moyenne >10× CpG-ODN linéaire (p < 0,0001), indiquant internalisation supérieure due architecture nano-fleurs.

Études stabilité montraient gels CpG-MCA retenaient ~85 % contenu ADN après 24 h 10 % FBS-DMEM, tandis CpG-ODN linéaire dégradé >90 % dans 12 h, soulignant effet protecteur matrice hydrogel.

Essais immunostimulation in vitro révélaient gels CpG-MCA induisaient sécrétion TNF-α IL-6 niveaux 3–27× supérieurs CpG-ODN (p < 0,0001). Notamment R4M8 produisait réponse cytokine plus forte, corrélant nombre copies CpG plus élevé.

Analyse expression gènes montrait régulation significative TLR9, TNF-α, IL-6 transcrits cellules traitées CpG-MCA, avec augmentation CD86 diminution CD206 marqueurs surface, indiquant bascule phénotype pro-inflammatoire M1.

Essais migration (Transwell griffure) révélaient gels CpG-MCA stimulaient migration RAW264.7 plus CpG-ODN, améliorant potentiel infiltration cellules immunitaires tumeurs.

Co-culture cellules glioma U251 démontrait réduction marquée formation clones : R4M8 atteignait taux formation clones 12 % relatif contrôle CpG-ODN (p < 0,001), confirmant activité anti-tumorale puissante médiée libération cytokines induite CpG-MCA.

Conclusions

Nous avons conçu avec succès nanohydrogels CpG-MCA incorporant milliers motifs CpG, conférant résistance nucleasique, internalisation macrophage efficace, induction robuste cytokines type Th1. Ces hydrogels suppriment efficacement prolifération cellules glioma in vitro, soulignant promesse immunostimulant biocompatible thérapie cancer.

Disponibilité données et matériaux

Jeux données soutenant étude disponibles auteur correspondant demande raisonnable.

Abréviations

Gels CpG-MCA

Hydrogel ADN généré amplification chaîne multi-amorcée

Gel CpG-RCA

Hydrogel ADN généré amplification cercle roulant

MCA

Amplification chaîne multi-amorcée

R12

Gel CpG dérivé RCA

R4M4, R4M8

Hydrogels CpG-MCA 4 ou 8 extensions amorces

R12-C, R4M4-C, R4M8-C

Hydrogels dépourvus motifs CpG