Biosenseur Électrochimique à Nanoflocons de Disulfure d'Étain pour la Détection Rapide et Sensible du Cortisol Salivaire

Résumé

Le cortisol, l'hormone de stress quintessentielle, est sécrété par l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HHS) et sert de biomarqueur critique pour le stress psychologique et physiologique. Une surexpression prolongée du cortisol peut mener à des troubles graves tels que les maladies de Cushing et d'Addison, soulignant le besoin d'une détection rapide au point de soin (PDS). Nous rapportons ici un essai électrochimique non invasif pour le cortisol salivaire basé sur un film multicouche de nanoflocons de disulfure d'étain (SnS₂), d'un anticorps spécifique au cortisol (C-M_ab) et de l'albumine sérique bovine (BSA) immobilisés sur une électrode de carbone vitreux (ECV). Le capteur BSA/C-M_ab/SnS₂/ECV a été caractérisé par spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS) et voltammétrie cyclique (CV). La voltammétrie à impulsion différentielle (VPD) a révélé une réponse linéaire aux concentrations de cortisol allant de 100 pM à 100 µM, avec une limite de détection (LOD) de 100 pM et une sensibilité de 0.0103 mA M⁻¹ cm⁻² (R² = 0.9979). Les échantillons de salive mesurés avec le capteur correspondaient aux résultats ELISA dans une marge de 5%, démontrant sa pertinence clinique et sa spécificité. Le dispositif offre une alternative rapide et rentable aux immunoessais conventionnels pour le suivi des biomarqueurs liés au stress.

Introduction

Le cortisol est une hormone stéroïde libérée par l'axe HHS et est le biomarqueur le plus largement utilisé pour évaluer le stress psychologique. Son rythme circadien culmine tôt le matin et décline la nuit, et sa dysrégulation peut déclencher des conditions allant du syndrome de Cushing à la maladie d'Addison. Une surveillance précise et en temps réel du cortisol est donc essentielle pour diagnostiquer et gérer une variété de troubles liés au stress, incluant le SSPT, la dépression et le trouble du spectre autistique.

Les méthodes de laboratoire actuelles—chromatographie, radioimmunoessai, ELISA, SPR et QCM—sont liées au laboratoire, chronophages et coûteuses, limitant leur utilisation en PDS. Les immunosenseurs électrochimiques, qui reposent sur des interactions antigène-anticorps spécifiques, offrent une solution prometteuse avec une instrumentation simple, des lectures rapides, un faible coût et une haute sensibilité. La mesure du cortisol salivaire est particulièrement attrayante car elle est non invasive et nécessite une manipulation d'échantillon minimale.

Alors que de nombreux nanomatériaux à base de sulfures métalliques ont été explorés pour la biosensibilisation, le disulfure d'étain (SnS₂) a rarement été utilisé comme matrice d'immobilisation de protéines. Le SnS₂ est un semi-conducteur de type n avec un gap de bande de 2.18–2.44 eV, une haute mobilité de porteurs et une excellente stabilité chimique, en faisant une plateforme idéale pour la transduction électrochimique. Dans ce travail, nous exploitons des nanoflocons 2D de SnS₂ pour construire un capteur de cortisol hautement sensible qui opère à travers la gamme de concentration physiologique.

Matériaux et Méthodes

Matériaux

L'hydrocortisone, l'anticorps anti-cortisol lapin (C-M_ab), l'hexacyanoferrate de potassium (II/III), le β-estradiol, la testostérone, la progestérone, la corticostérone et l'albumine sérique bovine (BSA) provenaient de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Le chlorure d'étain(IV) pentahydraté et la thioacétamide étaient fournis par Showa (Japon) et Alfa Aesar (UK), respectivement. Le tampon phosphate salin (PBS) et l'alumine micropolie étaient obtenus de Sigma-Aldrich et Buehler (UK). Tous les réactifs étaient utilisés sans purification supplémentaire. Un kit ELISA commercial pour le cortisol (Cat # SA E-6000) a été acheté chez LDN (Allemagne).

Synthèse du Disulfure d'Étain

Le SnCl₄·5H₂O et le C₂H₅NS ont été dissous dans 70 mL d'eau déionisée et ajustés à pH 7.4. La solution a été transférée dans un autoclave hydrothermal et chauffée à 200 °C en 1 h, puis maintenue pendant 11 h. La poudre de SnS₂ résultante a été lavée avec de l'eau et de l'éthanol à 6000 tr/min pendant 15 min et séchée à 80 °C dans l'air, produisant des nanoflocons uniformes.

Caractérisation des Matériaux

La diffraction des rayons X (DRX) a confirmé la phase hexagonale du SnS₂ (JCPDS 89-2358). La microscopie électronique à balayage à émission de champ (MEB-FEC) a révélé une morphologie en flocons avec des dimensions latérales ~300 nm. La microscopie électronique à transmission (MET) et la diffraction électronique de zone sélectionnée (DEZS) ont confirmé une structure monocristalline avec des espacements de réseau de 0.167 nm et 0.316 nm ; les nanoflocons avaient moins de 10 nm d'épaisseur.

Fabrication des Biosenseurs BSA/C-M_ab/SnS₂/ECV

Les électrodes de carbone vitreux (ECV) ont été polies avec une pâte d'alumine et déposées par goutte avec une dispersion de SnS₂ à 5 M. Les électrodes ont ensuite été incubées séquentiellement avec des solutions de C-M_ab à 1 mg mL⁻¹ et de BSA à 1% dans du PBS. Les capteurs finis étaient stockés à 4 °C quand non utilisés. Le concept de détection et la configuration sont illustrés en Fig. 1.

Analyse Électrochimique

La spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS) et la voltammétrie cyclique (CV) ont été employées pour évaluer le comportement électroactif du capteur. Toutes les mesures utilisaient une cellule à trois électrodes : le BSA/C-M_ab/SnS₂/ECV comme électrode de travail, un fil de Pt comme contre-électrode, et une électrode de référence calomel saturé, dans du PBS 10 mM (pH 7.4) contenant 5 mM Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻. Les balayages CV et VPD étaient effectués de –0.4 V à 1.0 V à 10 mV s⁻¹.

Collecte d'Échantillons de Salive et Détection Électrochimique

Deux volontaires sains ont fourni des échantillons de salive de 2 mL à midi. Les échantillons étaient congelés à –20 °C, décongelés, centrifugés (3500 tr/min, 15 min), et le surnageant était utilisé pour l'analyse. Les mesures de cortisol du capteur étaient comparées aux résultats du kit ELISA.

Étude d'Interférence

Les interférents potentiels—β-estradiol, testostérone, progestérone, corticostérone (chacun 100 nM)—étaient testés en incubant le capteur pendant 10 min et en mesurant la réponse CV. L'influence sur la détection du cortisol était inférieure à 5%.

Détection du Cortisol Salivaire par ELISA

L'ELISA suivait le protocole du fabricant. Une courbe étalon était générée avec six concentrations de cortisol (0, 0.1, 0.4, 1.7, 7.0, 30 ng mL⁻¹). L'absorbance était lue à 450 nm et la courbe résultante était utilisée pour quantifier les échantillons inconnus.

Résultats et Discussion

Analyse des Matériaux du SnS₂

Le motif DRX (Fig. 2a) correspond à la phase hexagonale du SnS₂ (JCPDS 89-2358). Les images MEB-FEC (Fig. 2b,c) montrent des particules uniformes, en flocons de 300 nm. La MET (Fig. 2d–f) confirme des flocons monocristallins avec des espacements inter-couches de 0.167 nm et 0.316 nm, et une épaisseur totale inférieure à 10 nm.

Réponses Électrochimiques de l'Électrode

L'ajout de SnS₂ à l'ECV a significativement amélioré le courant d'oxydation (Fig. 3a,b). La modification subséquente par anticorps et BSA a augmenté la résistance au transfert de charge, comme reflété dans les données EIS (Fig. 3b). Le CV du BSA/C-M_ab/SnS₂/ECV aux vitesses de balayage 10–100 mV s⁻¹ a montré une augmentation linéaire du courant de pic (Fig. 3c,d), confirmant un processus redox de surface contrôlé et réversible.

Le CV et la VPD ont tous deux démontré une diminution monotone du courant de pic avec l'augmentation de la concentration de cortisol. La VPD a donné une relation linéaire : y = –0.0103 x + 0.0443 (R² = 0.9979), avec une LOD de 100 pM et une sensibilité de 0.0103 mA M⁻¹ cm⁻². La plage dynamique du capteur (100 pM–100 µM) couvre le spectre physiologique complet du cortisol salivaire.

Étude de Stabilité de Stockage

Le CV a été effectué sur des capteurs stockés pendant 1 jour à 1 semaine sous deux conditions : vide-sec et 4 °C. Le stockage à 4 °C a préservé 91% du courant de pic redox après 7 jours, comparé à 82% sous vide, indiquant une meilleure stabilité de l'activité anticorps à température plus basse.

Étude d'Interférence

L'incubation avec 100 nM de β-estradiol, testostérone, progestérone et corticostérone a produit <5% de changement dans le signal de cortisol (Fig. 5a), confirmant la haute spécificité de l'essai.

Détection du Cortisol Salivaire par ELISA et Méthodes Électrochimiques

Les échantillons de salive de deux volontaires ont donné des concentrations de cortisol de 1.105 × 10⁻⁸ M et 3.998 × 10⁻⁹ M par ELISA, et 1.046 × 10⁻⁸ M et 3.911 × 10⁻⁹ M par le capteur électrochimique—seulement une discrépance de 2–5%—confirmant l'exactitude du capteur.

Comparaison avec d'Autres Études

Les Tableaux 2 et 3 (non montrés) comparent notre capteur aux capteurs de cortisol non basés sur l'or. Les avantages du présent travail incluent : (1) un coût de matériau significativement plus bas ; (2) un protocole de fabrication rapide et direct ; et (3) une LOD comparable ou meilleure que les dispositifs existants.

Conclusions

Nous avons démontré un biosenseur électrochimique basé sur des nanoflocons de disulfure d'étain qui délivre une LOD de 100 pM et une plage de détection de 100 pM–100 µM pour le cortisol salivaire, égalant la précision de l'ELISA. Le capteur présente <5% d'interférence de stéroïdes structurellement similaires et maintient >90% d'activité après 7 jours à 4 °C. Son faible coût, son assemblage simple et sa lecture rapide en font un candidat convaincant pour la surveillance du stress au point de soin.