Détection améliorée de peroxyde d'hydrogène via nanopores à l'état solide modifiés en surface

Résumé

Il existe de nombreuses techniques pour la détection de molécules. Mais la détection de molécules à travers un nanopore à l'état solide en solution est l'une des technologies prometteuses, à haut débit et à faible coût utilisées aujourd'hui. Dans cette investigation, une plateforme de nanopore à l'état solide a été fabriquée pour la détection de peroxyde d'hydrogène (H₂O₂), qui n'est pas seulement un produit sans étiquette mais aussi un participant significatif dans la réaction redox. Nous avons fabriqué avec succès des nanopores de nitrure de silicium (Si₃N₄) avec des diamètres de ~50 nm en utilisant un faisceau d'ions Ga focalisé, la surface interne du nanopore a été modifiée avec de la peroxidase de raifort (HRP) en employant la chimie de couplage carbodiimide. Les enzymes HRP immobilisées ont la capacité d'induire des réactions redox dans un seul canal de nanopore. De plus, des événements de translocation moléculaire unique d'ABTS•+ agrégés en temps réel ont été surveillés et étudiés. Le biosenseur à nanopore à l'état solide conçu est réversible et peut être appliqué pour détecter H₂O₂ de multiples fois.

Contexte

La technologie de détection par nanopore provient du compteur de Coulter et du canal ionique cellulaire. Le nanopore détecte les molécules chargées présentes dans une solution passant à travers lui. L'apparition des molécules dans le nanopore peut changer la conductance du pore apparemment, par conséquent un changement dans le signal de courant. Le changement dans le courant fournit des informations sur les tailles et concentrations des molécules à l'intérieur du pore, pour révéler le processus dynamique des comportements de translocation des molécules. Certains objets à l'échelle nanométrique peuvent être détectés en utilisant un nanopore, tels que les nanoparticules, les virus, les molécules de protéines et les séquences d'ADN. Les nanopores sont de deux types : nanopore biologique et nanopore à l'état solide. Le nanopore biologique a un rapport signal/bruit (SNR) plus faible, et une résolution plus élevée. Les protéines petites et non repliées peuvent être détectées en utilisant des nanopores biologiques. Le nanopore à l'état solide est de taille ajustable et a une stabilité plus élevée. Le nanopore à l'état solide est normalement foré sur un film, ce film divise la cellule fluidique en deux parties. Une tension biaisée est appliquée à travers une mince membrane contenant un nanopore, résultant en un courant ionique d'une cellule à l'autre. Les molécules de protéines incluant les structures repliées et non repliées sont détectées et analysées par nanopore à l'état solide. L'interaction des protéines peut aussi être détectée en utilisant un nanopore à l'état solide. De plus, il a la capacité de détecter la cinétique des protéines. Afin de résoudre les limites sur la gamme de détection, les nanopores à l'état solide chimiquement modifiés ont été appliqués extensivement, pour détecter l'ADN simple brin et les protéines.

Beaucoup de méthodes quantitatives ont déjà été appliquées pour la détection de H₂O₂, la plupart sont basées sur la spectrométrie, la chimiluminescence, l'ampérométrie et l'électrochimie. Les méthodes spectrométriques et chimiluminescentes conventionnelles sont communément chronophages et coûteuses. Le capteur à nanopore à l'état solide a une faible consommation et une structure simple, et peut être utilisé pour détecter de petites molécules.

Ici, nous présentons un type de nanopore à l'état solide qui a été modifié avec de la peroxidase de raifort (HRP). Les HRP ont été immobilisés sur la surface interne du nanopore à l'état solide, les HRP immobilisés sont restés actifs dans la réaction redox qui s'est produite à l'intérieur d'un seul canal de nanopore en présence de H₂O₂. L'ABTS•+ produit dans la réaction redox s'agrège, puis l'ABTS•+ agrégé passe à travers le nanopore. Les événements de translocation peuvent être détectés. Pour la détection de peroxyde d'hydrogène, la structure de l'état solide est simple, et elle peut détecter l'ABTS•+ agrégé en utilisant une faible consommation de réactifs. Ce nanopore à l'état solide modifié par enzymes HRP peut accomplir la détection de peroxyde d'hydrogène (H₂O₂) indirectement, à travers la détection d'ABTS•+ agrégé. Cela a une signification instructive pour la détection de molécule unique et l'assemblage moléculaire à l'intérieur d'un nanopore à l'état solide.

Méthodes

Produits chimiques et matériaux

La molécule de Peroxidase de Raifort (HRP) (1 mg mL⁻¹, Commission des Enzymes No.1.11.1.7, 44 kDa) a été achetée chez Xiya Reagent (Chengdu, Chine). L'échantillon (HRP) a été dissous dans du PBS 0,1 M filtré à 0,02 µm, stocké à 4 °C, et utilisé dans les deux jours suivant la préparation. Le chlorure de potassium (KCl), le N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC), le N-hydroxysuccinimide (NHS) et le 2,2'-Azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulfonique) ((ABTS), 98 %) ont été achetés chez DiBo chemical technology co., LTD (Shanghai, Chine). Le peroxyde d'hydrogène (H₂O₂, 30 %) a été acheté chez Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Le (3-Aminopropyl)triéthoxysilane (3-APTES) a été acheté chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Les expériences ont été menées en utilisant de l'eau ultrapure d'un système de purification Milli-Q (résistivité 18,2 MΩ/cm, 25 °C, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) et filtrée à travers 0,02 µm dans un système FEI Strata 201 FIB (FEI Co., Hillsboro, OR, USA), un Zetasizer (Malvern Zetasizer Nano ZS), et un Axopatch 700B (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA). Les photos de nos instruments utilisés ont été ajoutées au matériel supplémentaire (voir Fichier additionnel 1 : Figure S1).

Fabrication du nanopore à l'état solide et mesures électriques

Premièrement, une mince membrane de Si₃N₄ (100 nm d'épaisseur) a été déposée sur un substrat Si ayant 300 µm d'épaisseur. Suivi par photolithographie (la taille de fenêtre ouverte est 500 × 500 µm²). Ensuite, la surface de la membrane a été bombardée avec des ions Ga⁺ en utilisant un système FEI Strata 201 FIB (FEI Co., Hillsboro, OR, USA) à un potentiel d'accélération de 30 kV, tandis que le courant était mesuré à 1 pA. Le temps de fraisage était de 1,5 s sous mode spot. Finalement, les puces de nanopore à l'état solide ont été obtenues et nettoyées dans une solution piranha fraîchement préparée à 80 °C pendant 30 min, suivies d'un rinçage à l'eau ultrapure. Après nettoyage, la puce a été assemblée dans une cellule Teflon personnalisée avec deux joints toriques Viton pour séparer les deux côtés de la puce, formant deux réservoirs pour assurer le seul chemin pour le courant ionique à travers le nanopore. Les photos de notre appareil utilisé ont été ajoutées au matériel supplémentaire (voir Fichier additionnel 1 : Figure S2). Les électrodes (Ag/AgCl) étaient connectées à la cellule fluidique et un amplificateur patch-clamp (Axopatch 700B, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA) qui rendait le courant ionique mesurable sous tensions constantes, avec un taux d'échantillonnage de 100 kHz pour les signaux. Le filtre passe-bas Bessel à huit pôles interne de l'amplificateur était réglé à 10 kHz. L'instrument entier était placé dans une enceinte à double cage de Faraday.

Résultats et discussion

Immobilisation du nanopore avec HRP

Le nanopore sélectionné avec un diamètre de ~50 nm a été immergé dans une solution piranha à 80 °C pendant 30 min. Après traitement avec la solution piranha, la surface interne du nanopore a été capable de prendre des groupes silanol de silicium. Par la suite, le film mince entier a été activé avec le (3-Aminopropyl)triéthoxysilane (3-APTES). Comme résultat du traitement avec 3-APTES, des groupes amino (-NH₂) ont été générés sur la surface du film.

Après activation avec le (3-Aminopropyl)triéthoxysilane (3-APTES), la puce de nanopore a été introduite dans une solution PBS 0,1 M de N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC) (10 mM) et N-hydroxysuccinimide (NHS) (20 mM). Par la suite, la puce de nanopore a été introduite à la peroxidase de raifort (HRP) (10 ng/ml). Selon les résultats de recherche précédents de notre groupe, avec différentes concentrations de sel de 0,1 à 2 M KCl, pH 7,0, le HRP ne s'agrégait pas. En raison de la valeur pI de la peroxidase de raifort étant 4,3 ± 0,2, nous avons aussi prouvé que le HRP ne s'agrégait pas dans 0,1 M KCl pH 6,0 et pH 7,0. Le réactif EDC a activé les groupes carboxyl (-COOH) du HRP en un intermédiaire o-acylisourea hautement réactif. De plus, l'intermédiaire a été converti en un ester succinimidyl amine-réactif plus stable en présence de NHS. Résultant, en couplage covalent de l'intermédiaire avec les (-NH₂) générés sur les surfaces internes du nanopore pour former des liaisons amide stables (Fig. 1).

Ces processus mènent vers l'immobilisation des HRP sur la surface interne d'un nanopore unique. La réalisation du processus de fonctionnalisation a été confirmée en mesurant les courbes courant-tension (I-V) d'un nanopore unique avant et après modification (Fig. 2).

Caractérisation du nanopore à l'état solide modifié par HRP

Ici, la forme d'un canal de nanopore Si₃N₄ unique est cylindrique. La figure 2 montre les courbes courant-tension (I-V) typiques du nanopore non modifié (original) et modifié dans 0,1 M KCl, tamponné à pH 7,0 avec 0,1 M PBS. Après modification de la surface interne du nanopore avec les enzymes HRP, la taille du pore est devenue plus petite.

Selon Wanunu et al., en prenant en compte la conductance externe du nanopore, le diamètre du nanopore à l'état solide peut être calculé par l'équation suivante,

$$ d=\left(1+\sqrt{1+\frac{16\sigma l}{\pi G}}\right) G/2\sigma $$ (1)

Où, d et l sont le diamètre et la longueur du pore, G est la conductance de pore ouvert du nanopore, σ est la conductivité de la solution ionique.

En considérant les effets géométriques, après la modification du nanopore à l'état solide avec les enzymes HRP, la taille effective peut être calculée. Le diamètre d'un nanopore unique peut être calculé basé sur l'équation (1). Où, la valeur de conductance (G_non-modifié) est ~15 nS peut être obtenue des courbes I-V du nanopore à l'état solide non modifié. La conductivité (σ) de la solution ionique 0,1 M KCl (25 °C), tamponnée à pH 7,0 avec 0,1 M PBS est ~1,28 S/m. Par conséquent, le diamètre du nanopore non modifié est ~51 nm, il est similaire au diamètre mesuré. En utilisant la même méthode, la valeur obtenue de conductance (G_modifié) est ~7,5 nS, et le diamètre (~34 nm) du nanopore modifié peut être calculé. La réduction de diamètre est possible pour deux raisons : première, le traitement de la surface interne du nanopore avec le (3-aminopropyl)triéthoxysilane (3-APTES), permettant à la surface du nanopore de prendre des groupes amino (-NH₂). La seconde raison est que le diamètre hydrodynamique (D_h) de l'enzyme HRP est ~8 nm, les HRP immobilisés pourraient réduire le diamètre du pore. Ici, le nanopore à l'état solide modifié par HRP avec un diamètre de ~34 nm est utilisé comme canal de détection de peroxyde d'hydrogène.

Le principe de la réaction redox

La réaction redox a été conduite à l'intérieur d'un nanopore unique modifié, et le processus de réaction suivant présenté s'accorde bien avec la réaction redox proposée. En présence de H₂O₂ (0,5 mM), les enzymes HRP immobilisées sur la surface interne du nanopore ont été converties en composé 1 immédiatement. Ensuite, le composé 1 a accepté un électron de la molécule substrat réductrice ABTS (1,5 mM) pour générer le composé 2. Subséquemment, le composé 2 a été réduit à nouveau à l'enzyme au repos via un transfert d'électron d'une autre molécule substrat ABTS.

$$ \mathrm{HRP}(\mathrm{Fe}^{3+})\mathrm{Porp} + \mathrm{H}_2\mathrm{O}_2 \to \mathrm{HRP}(\mathrm{Fe}^{4+}=\mathrm{O})\mathrm{Porp}^{\cdot+} (\text{Composé 1}) + \mathrm{H}_2\mathrm{O} $$

$$ \mathrm{HRP}(\mathrm{Fe}^{4+}=\mathrm{O})\mathrm{Porp}^{\cdot+} + \mathrm{ABTS} \to \mathrm{HRP}(\mathrm{Fe}^{4+}=\mathrm{O})\mathrm{Porp} (\text{Composé 2}) + \mathrm{ABTS}^{\cdot+} $$

$$ \mathrm{HRP}(\mathrm{Fe}^{4+}=\mathrm{O})\mathrm{Porp} + \mathrm{ABTS} \to \mathrm{HRP}(\mathrm{Fe}^{3+})\mathrm{Porp} + \mathrm{ABTS}^{\cdot+} + \mathrm{H}_2\mathrm{O} $$

Les produits cationiques (ABTS•+) des réactions redox s'accumulaient dans le nanopore unique. La translocation de molécules accumulées du canal de nanopore changerait la conductance (G), et ainsi le changement de courant (ΔI_b) peut être trouvé.

Détection des événements de translocation

Les expériences ont été effectuées en utilisant des nanopores modifiés par HRP avec des diamètres de pore modifiés (~34 nm) dans 0,1 M KCl, tamponné à pH 7,0 avec 0,1 M PBS. Le 2,2'-Azinobis-(3-éthylbenzthiazoline-6-sulfonate (ABTS) (1,5 mM) et le peroxyde d'hydrogène (H₂O₂) (0,5 mM) ont été ajoutés au compartiment trans du nanopore. Après ajout d'ABTS et H₂O₂, les expériences utilisant des tensions biaisées de −100 à −800 mV ont été effectuées, et elles ont été échantillonnées à 100 kHz. Il n'y avait pas d'événement de translocation jusqu'à ce que la tension augmente à −400 mV. La figure 3 montre des traces de courant ionique représentatives de l'événement de translocation à différentes tensions de −400 à −800 mV dans 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Les données d'expériences d'événements de translocation de longue durée à différentes tensions ont été ajoutées au matériel supplémentaire (voir Fichier additionnel 1 : Figure S3).

Des événements de blocage de courant de l'ordre de la milliseconde ont été observés, conduits dans 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. En ajoutant les réactifs H₂O₂ et ABTS dans le compartiment trans, les enzymes HRP immobilisées sur la surface interne d'un canal de nanopore unique, et la réaction redox s'est produite. Une abondance de molécules ABTS•+ ont été produites, une seule molécule ABTS•+ plus petite peut ne pas être détectée en utilisant notre nanopore à l'état solide, en raison de la résolution du système. Cependant, ces molécules s'agrégent après leur production. Par conséquent, il est possible de détecter les molécules ABTS•+. Ici, les tensions négatives étaient maintenues, et les molécules ABTS•+ agrégées passaient à travers les nanopores. Il y avait un flux électrophorétique et électro-osmotique quand une tension négative était appliquée. Le HRP était chargé négativement dans 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0, comme résultat, une double couche électrique serait produite, et l'électro-osmose serait vers la direction de l'électrode négative. Pour cette raison, l'électrophorèse et l'électro-osmose étaient vers la même direction. Les ABTS•+ agrégés dans le canal de nanopore unique seraient transportés à travers le nanopore à l'état solide, s'écoulant vers la direction de l'électrode négative.

Analyse statistique des événements de translocation

Puisque la tension biaisée jouait un rôle clé dans la translocation des ABTS•+ agrégés, l'influence des blocages de courant des ABTS•+ agrégés passant à travers le nanopore modifié par HRP versus tensions appliquées a été discutée. La fréquence d'occurrence des événements de translocation a été grandement améliorée avec l'augmentation de la tension (Fig. 3f). Comme la tension augmentait, l'amplitude du courant augmentait aussi. Cependant, les événements de translocation disparaissaient progressivement quand la tension biaisée était maintenue en dessous de −300 mV, ce qui suggérait que les ABTS•+ agrégés à travers les nanopores modifiés par HRP avaient besoin d'une tension seuil de −300 mV. La figure 4 montre les histogrammes de l'amplitude moyenne du courant des événements de translocation mesurés pour les ABTS•+ agrégés à différentes tensions. Basé sur les courbes d'ajustement, les valeurs de pic du blocage de courant (ΔI_b) sont 308,4 ± 27,795 pA, 419,1 ± 20,354 pA, 478,8 ± 32,857 pA, 528,1 ± 36,98 pA, 606,9 ± 40,916 pA à −400, −500, −600, −700, et −800 mV, respectivement, il est probable que la réduction de courant est induite par la molécule ABTS•+ agrégée passant à travers le nanopore à différentes tensions. Les valeurs d'amplitude de courant ont été ajustées avec une fonction polynomiale du premier ordre, ce qui produit une pente de −0,706 et une ordonnée à l'origine de 49,262. Cependant, basé sur les courbes d'ajustement, les valeurs de temps de séjour sont 54,5 ± 21,374 ms, 42,8 ± 20,181 ms, 10,3 ± 3,05 ms, 6,0 ± 1,744 ms, 4,0 ± 1,441 ms, à −400, −500, −600, −700, et −800 mV. La figure 3h montre une fonction décroissante exponentielle (t_d ~ e^(-v/v0)) a été employée pour ajuster le temps de séjour dépendant des tensions appliquées. Les histogrammes du temps de séjour des événements de translocation ont été ajoutés au matériel supplémentaire (voir Fichier additionnel 1 : Figure S4).

Le blocage de courant versus temps de séjour des événements pour chaque ABTS•+ agrégé à différentes tensions ont été ajustés en diagrammes de dispersion bidimensionnels (Fig. 5). Tous les ABTS•+ agrégés montrent un cluster d'événements de −400 à −800 mV, les clusters d'événements principaux sont dus aux ABTS•+ agrégés passant à travers le nanopore à l'état solide modifié par HRP.

En plus, l'événement de translocation unique à chaque tension a été analysé, et le blocage de courant a été induit par la même substance de taille et charge. Donc, il est considéré que chaque événement de translocation a été induit par le ABTS•+ agrégé unique. Pour analyser le temps de translocation des ABTS•+ agrégés dans nos expériences. La durée du blocage de courant t_d est considérée comme le temps de séjour d'un ABTS•+ agrégé unique depuis l'endroit où il est produit jusqu'à la sortie du nanopore. Ici, une autre condition a été considérée, il peut y avoir quelques enzymes HRP immobilisées à l'entrée du nanopore, et cela pourrait catalyser la réaction redox. Par conséquent, d'autres expériences ont été conduites pour vérifier que la réaction redox s'est produite à la surface interne d'un nanopore unique plutôt qu'à l'entrée. Pour la vérification, des nanopores non modifiés par HRP ont été appliqués et analysés. Ces nanopores ont été activés avec 3-APTES. Et la même concentration de HRP (10 ng/ml), ABTS (1,5 mM) et H₂O₂ (0,5 mM) ont été ajoutés au compartiment trans du nanopore, la tension biaisée négative a été appliquée dans 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0, en raison de la force électrophorétique, les HRP étaient incapables de passer à travers le nanopore. En raison de la réaction redox, les ABTS•+ agrégés ont été produits, mais aucun événement de translocation n'a été trouvé. Il est possible que les ABTS•+ agrégés causent un effet électrostatique avec les HRP et empêchent les ABTS•+ agrégés de passer à travers le nanopore.

La figure 6 montre les diagrammes de dispersion bidimensionnels du changement de conductance (ΔG) versus temps de séjour des événements pour chaque ABTS•+ agrégé à différentes tensions. On peut trouver que le changement de conductance (ΔG) est principalement concentré à 0,8 nS. La forme des événements de translocation sont presque les mêmes. La valeur moyenne de ΔG est ~0,8 nS à différentes tensions. On peut spéculer que l'exclusion de volume de chaque molécule ABTS•+ agrégée est presque la même. Il est possible que les effets électrostatiques et stériques des molécules ABTS•+ agrégées puissent changer le courant ionique. Après l'analyse, deux formes typiques de traces de courant avec la translocation d'ABTS•+ chargé positivement ont été observées (Fig. 7). Les événements de translocation à −700 mV comme représentatif. Le pourcentage des deux types d'événements a été analysé, et on peut observer que le pourcentage d'événements de type 1 augmentait avec l'augmentation de la tension, d'autre part, le pourcentage d'événements de type 2 diminuait. Il a été considéré que la tension plus élevée rend la translocation plus rapide que la tension plus basse.

Les signaux de blocage de courant ont révélé la taille, la conformation, et l'interaction des ABTS•+ agrégés passant à travers le canal de nanopore unique. Pour le changement de forme de courant, le processus des changements a été spéculé. Pour l'événement 1, les signaux de courant ont une partie de fluctuation typique avec une intensité profonde et un temps de séjour court. Il est possible que les ABTS•+ agrégés passent à travers le nanopore depuis l'endroit où ils sont produits. Quand les ABTS•+ agrégés passent à travers le nanopore, le courant ionique du nanopore est restauré au niveau original (Ligne de base) (I_0). Pour l'événement 2, les signaux de courant ont une partie de fluctuation avec une intensité profonde et puis ont une étape horizontale. Cette forme de signaux peut être attribuée à l'interaction électrostatique des ABTS•+ agrégés avec les HRP à la sortie du nanopore, et le courant était lentement récupéré à la ligne de base. Pour une meilleure compréhension du changement de courant, nous devons commencer avec le changement de conductance de pore ouvert (G_pore) à la concentration de sel (0,1 M KCl). Comme discuté dans les études précédentes, une équation de la conductance de pore ouvert d'un nanopore chargé négativement avec un diamètre de d et une longueur de l à basse concentration de sel peut être décrite comme

$$ G_{pore}=\frac{\pi d^2_{pore}}{4l_{pore}}\left[\left(\mu_{K^+}+\mu_{Cl^-}\right)n_{KCl}\cdot e+\mu_K\frac{4\sigma_p}{d_{pore}}\right] $$ (2)

où μ_K et μ_Cl sont les mobilités électrophorétiques de K⁺ et Cl⁻, n_KCl est la densité de nombre de K⁺ et Cl⁻, la charge élémentaire est e, σ_p est la densité de charge de surface des surfaces du nanopore. Dans cette expérience, le nanopore à l'état solide a été chimiquement modifié, et le diamètre du nanopore a été changé. La densité de charge de surface de la surface du nanopore (σ_p) ne peut pas être obtenue exactement. Par conséquent, la conductance de pore ouvert (G_pore) a été calculée basée sur l'équation (1). D'après l'équation (1), la conductance de pore ouvert (G_pore) est ~7,5 nS. Il est spéculé que le changement de conductance peut être attribué à deux raisons. La première raison est que, l'exclusion de volume d'ions dans le nanopore était occupée par les molécules ABTS•+ agrégées. Comme résultat, la conductance du nanopore à l'état solide était diminuée (ΔG⁻). La seconde raison est que, certains ions étaient apportés du nanopore par les molécules ABTS•+ agrégées ce qui augmentait la conductance du nanopore à l'état solide. Dans ces expériences, les ABTS•+ ont été produits à l'intérieur du nanopore, et aucun ion n'a été apporté. Par conséquent, le changement de conductance du nanopore à l'état solide (ΔG) a été seulement induit par l'exclusion de volume. Donc, le changement total de conductance peut être décrit comme

$$ \Delta G=\Delta G^{-} $$ (3)

La diminution de la conductance du nanopore à l'état solide est induite par l'exclusion de volume et elle peut être calculée par l'équation suivante

$$ \Delta G^{-}=\sigma \frac{\gamma \Lambda}{(l+0,8 d)^2} $$ (4)

où γ est le facteur de forme de particule qui est le rapport des surfaces du même volume sphérique et de la particule. Dans ce travail, la molécule ABTS•+ agrégée a été simplifiée en un objet global, donc la valeur de γ est 1 et Λ est l'exclusion de volume. La conductivité de la solution bulk σ est 1,28 S/m, 0,1 M KCl (25 °C).

Pour l'exclusion de volume (Λ), nous pouvons déduire des événements de translocation de quelques autres molécules. Pour connecter le changement de conductance (ΔG) à la propriété physique des molécules, la Loi d'Ohm peut être appliquée au changement de volume de solution d'électrolyte basé sur le nanopore à l'état solide. Quand un événement de translocation d'une molécule dans un nanopore à l'état solide cylindrique, le courant diminue instantanément. Quand la résistance du nanopore à l'état solide est la résistance du circuit entier, le changement de conductance (ΔG) peut être décrit par l'équation suivante

$$ \Delta G(t)=-G_{pore}\frac{\Lambda (t)}{H_{eff}A_p}\left[1+ f\left(d_m/D_p,l_m/H_{eff}\right)\right] $$ (5)

Dans cette équation, A_p H_eff = V_p est le volume du nanopore à l'état solide, f (d_m/D_p, l_m/H_eff) est un facteur de correction (il ignore l'effet de charge de surface), dans nos expériences, nous avons simplifié la molécule ABTS•+ agrégée en un objet global ; par conséquent, le facteur de correction est 1. Le d_m/D_p est le rapport du diamètre de molécule et du diamètre de nanopore, Le l_m/H_eff est le rapport de la longueur effective de molécule et de la longueur effective de nanopore. L'expression (5) peut être simplifiée comme

$$ \Delta G/G_{pore}\approx \Lambda/V_p $$ (6)

La valeur moyenne de conductance (G_pore) a été analysée des événements de translocation. De l'équation (5), la valeur moyenne d'exclusion de volume (Λ) à différentes tensions (-400, -500, -600, -700, -800 mV) peut être obtenue. Pendant ce temps, la taille du nanopore utilisé est connue, le volume du nanopore (V_p) est ~90746 nm³. D'après l'équation (4), la valeur de changement de conductance (ΔG⁻) peut être calculée comme ~0,6 nS. La valeur moyenne de changement de conductance obtenue des expériences d'événements de translocation à différentes tensions (−400, −500, −600, −700, −800 mV) est ~0,784 nS. On peut trouver que la valeur calculée est proche de la valeur expérimentale.

Dans certaines investigations précédentes, les molécules de peroxyde d'hydrogène ont été détectées avec différentes technologies. Mais, détecter le peroxyde d'hydrogène par nano-canal est rare. Tan et al. [3] ont différencié des signaux d'événements disparates quand les HRP traversaient le nanopore, il y avait ABTS et H₂O₂ dans la solution KCl. Les différents signaux de type avec translocation de HRP étaient considérés comme ABTS•+ passant à travers le nanopore. Six événements typiques de la translocation du produit de catalyse enzymatique de substrats ont été analysés. Ils ont spéculé le processus probable de chaque type. Cependant, pas assez de preuves pour témoigner. Mubarak Ali et al. ont accompli la détection des produits de réaction redox à l'intérieur de nano-canaux coniques uniques. Ils ont trouvé que le radical cationique ABTS•+ réduisait le courant ionique dans le nano-canal HRP d'une façon dépendante de la tension, cohérent avec les concentrations d'ions dépendantes de la tension dans les nano-canaux coniques. La magnitude du blocage de courant était corrélée avec la concentration de H₂O₂ dans la solution.

Conclusions

En conclusion, nous avons fabriqué un nanopore Si₃N₄ en utilisant un FIB avec succès, un système de nanopore unique dont la surface a été modifiée avec des enzymes HRP liées covalentement. L'effet des enzymes HRP immobilisées dans un nanopore unique à l'état solide comme capteur de peroxyde d'hydrogène (H₂O₂) a été affirmé en investiguant les produits (ABTS•+) des réactions redox se produisant en présence des substrats H₂O₂ et ABTS. Le radical cationique ABTS•+ agrégé produit à l'intérieur du nanopore à l'état solide et réduisant le courant ionique dans le nanopore à l'état solide modifié par HRP, sont cohérents avec la dépendance en tension. Les tendances de blocage de courant ont montré une dépendance linéaire pour les tensions biaisées appliquées. La relation entre le temps de séjour versus tension biaisée appliquée était la décroissance exponentielle (t_d ~ e^(-v/v0)). Pendant ce temps, les ABTS•+ agrégés passant à travers les nanopores modifiés par HRP avaient besoin d'une tension seuil de −300 mV. Le changement de conductance (ΔG) a été calculé analytiquement et comparé aux valeurs expérimentales mesurées. Les événements de translocation ont été produits par le radical cationique ABTS•+ agrégé de taille certaine. Nous nous attendons à ce que l'utilisation de nanopores à l'état solide permette d'abaisser la limite de détection et d'améliorer la sensibilité du système. Pour notre système de nanopore à l'état solide, la structure est simple ; elle n'est pas sujette à l'encrassement et peut être utilisée plusieurs fois.

Abréviations

3-APTES :

(3-Aminopropyl)triéthoxysilane

ABTS :

3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulfonique

EDC :

N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide

FIB :

Faisceau d'ions focalisé

HRP :

Peroxidase de raifort

KCl :

Chlorure de potassium

NHS :

N-hydroxysuccinimide

SEM :

Microscopie électronique à balayage

SNR :

Rapport signal/bruit