Les nanoparticules d'or modulent le métabolisme de la testostérone dans les microsomes hépatiques humains : effets de la taille, de la chimie de surface et de la couronne protéique

Résumé

Les complexes nanoparticules d'or (AuNP)–couronne protéique peuvent altérer le métabolisme de la testostérone (TST) médié par le cytochrome P450 (CYP) en modifiant leurs propriétés physicochimiques. Nous avons examiné comment la taille des NP, la chimie de surface et la couronne protéique plasmatique humaine (PC) influencent le métabolisme de la TST dans des microsomes hépatiques humains poolés (pHLM). Des AuNP de 20‑40 nm et 80 nm fonctionnalisées avec du polyéthylénimine ramifié (BPEI), de l'acide lipoïque (LA) ou du polyéthylène glycol (PEG) ont été étudiées, à la fois nues et avec PC. Dans les pHLM, les AuNP nues de 40 nm inhibaient la formation de cinq métabolites hydroxylés de la TST, tandis que les particules de 80 nm avaient un effet plus faible. La PC atténuait largement ces inhibitions. Fait surprenant, les AuNP nues augmentaient la production d'androstènedione. Dans des HLM de donneur unique, une variabilité interindividuelle a été observée ; la plupart des AuNP supprimaient le métabolisme de la TST à des concentrations non inhibitrices, tandis que les PC‑PEG‑AuNP stimulaient la production d'androstènedione. Ces résultats soulignent le potentiel des AuNP comme perturbateurs endocriniens en modulant le métabolisme de la TST et fournissent un cadre pour le criblage d'autres nanomatériaux.

Introduction

Les AuNP sont largement utilisées dans l'administration de médicaments, le diagnostic et les produits de consommation en raison de leurs propriétés optiques et physiques uniques (Réf. 1–3). Au contact de fluides biologiques, les AuNP adsorbent rapidement des protéines, formant une couronne qui modifie la chimie de surface, la conformation des protéines et les réponses biologiques en aval, notamment la cytotoxicité, l'internalisation cellulaire et l'activité des enzymes CYP (Réf. 4–7). Des études in vitro ont montré que les AuNP peuvent être toxiques pour les hépatocytes humains, la lignée hépatome C3A et les cellules spermatiques (Réf. 6–8), mais la présence d'une PC peut atténuer ou potentialiser ces effets selon la chimie de surface (Réf. 6–7). La formation de PC interfère également avec l'internalisation cellulaire dans divers types cellulaires, indépendamment de la taille ou de la charge des NP (Réf. 6–12).

Les enzymes CYP du foie métabolisent des composés endogènes et exogènes. Plusieurs agents — médicaments, pesticides et nanoparticules — peuvent perturber la synthèse et le métabolisme des hormones stéroïdiennes, entraînant des fonctions physiologiques altérées (Réf. 13–17). La testostérone (TST) est un androgène primaire et un substrat pour le CYP3A4, qui l'hydroxylate en 6β‑OH‑TST. D'autres hydroxylations par le CYP3A4 produisent 2β‑OH‑TST, 15β‑OH‑TST, 16α‑OH‑TST et 16β‑OH‑TST, tandis que le CYP2D6 déalkyle la TST en androstènedione (AD) (Réf. 17, 19, 27). Des travaux antérieurs indiquent que les AuNP nues et revêtues de PC modulent un large spectre d'enzymes CYP, dont CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 et 3A4 (Réf. 6, 7, 20–21). Les AgNP suppriment également l'activité du CYP3A4 dans les HLM (Réf. 22). Les AuNP fonctionnalisées BPEI et LA diminuent l'activité du CYP3A4 dans les cellules C3A, mais la PC atténue cet effet (Réf. 7). In vivo, de petites AuNP s'accumulent dans le foie et la rate et modifient l'expression hépatique de Cyp1a1 et Cyp2b (Réf. 23). Compte tenu de ces résultats, la présente étude examine comment la PC influence la taille, la charge et la chimie de surface des AuNP sur le métabolisme de la TST médié par les CYP dans les pHLM et les HLM de donneur unique.

Méthodes

Produits chimiques

La testostérone, ses métabolites et la TST marquée au ¹³C₃ provenaient de MilliporeSigma (St. Louis, MO). Les réactifs supplémentaires étaient achetés chez Steraloids ou MilliporeSigma. Les solvants de grade LC‑MS venaient de Fisher Scientific ; l'eau ultrapure était générée par un système Merck Synergy® UV‑R.

Microsomes hépatiques humains

Les HLM poolés (pHLM) de 200 donneurs (100 hommes, 100 femmes) et les HLM de donneur unique provenaient de Corning Inc. (Charlotte, NC). Les activités CYP spécifiques aux donneurs sont détaillées dans le Tableau supplémentaire S1.

Synthèse des nanoparticules d'or

Les AuNP Biopure™ de 40 et 80 nm fonctionnalisées avec BPEI, LA ou PEG ont été achetées chez nanoComposix. La synthèse du noyau impliquait la réduction de HAuCl₄·3H₂O dans K₂CO₃, suivie de vieillissement et de filtration tangentielle (TFF). La fonctionnalisation de surface : LA (0,2:1 p/p) ou PEG (0,5:1 p/p) était ajoutée, suivie de TFF et de filtration stérile. Les surfaces BPEI étaient préparées par chimie EDC/NHS liant le carboxylate de LA aux amines de BPEI ; le BPEI non lié était éliminé par TFF et centrifugation.

Préparation de la couronne protéique

Du plasma humain poolé (n=5) était incubé avec des AuNP de 40 ou 80 nm à 55 % de volume plasmatique dans un agitateur à 37 °C (250 tr/min, 1 h). Les PC‑AuNP étaient récupérées par centrifugation (20 000×g, 20 °C, 20 min), lavées trois fois au PBS et resuspendues dans le PBS pour la caractérisation.

Caractérisation physique

La DLS et le TEM mesuraient la taille des particules, la polydispersité et le potentiel zêta. Les mesures étaient effectuées dans l'eau DI, le PBS et le tampon d'incubation microsomal (pH 7,4) à 0 min et 45 min (37 °C). Les grilles TEM étaient examinées sur un Tecnai G2 Spirit BioTWIN (120 kV). Les spectres UV‑Vis étaient enregistrés avec un lecteur Spectra Max i3.

Métabolisme de la testostérone in vitro

Le métabolisme linéaire de la TST (10 µM) a été confirmé sur 1,3–9,3 mg mL⁻¹ de protéines microsomales jusqu'à 60 min. Les pHLM étaient incubées avec la TST et des concentrations variables d'AuNP nues ou avec PC (0–571 µg mL⁻¹). Les réactions étaient initiées avec ou sans NADPH (0,25 mM NADP, 2,5 mM glucose‑6‑phosphate, 2 U mL⁻¹ déshydrogénase) et arrêtées après 45 min à 37 °C avec 4 % d'acide phosphorique. Les surnageants étaient centrifugés, stockés à –20 °C et traités pour LC‑MS/MS. Les HLM de donneur unique étaient traitées de manière similaire à 10 µg mL⁻¹ d'AuNP.

Étalons et préparation des échantillons

Les étalons primaires (1 mM) et l'ISTD (¹³C₃‑TST) étaient préparés dans le méthanol. Les étalons de travail allaient de 0,01 à 200 µM. Les échantillons QC étaient à 0,01, 0,05 et 0,1 µM. Les échantillons étaient additionnés d'ISTD, extraits via des plaques Oasis PRIME HLB, lavés, élués, dilués et analysés par LC‑MS/MS.

Chromatographie liquide‑spectrométrie de masse

La séparation utilisait une colonne Waters UPLC HSS T3 (2,1 × 50 mm, 1,8 µm) avec un débit de 600 µL min⁻¹. Gradient : 30 % B à 98 % B sur 8,4 min. Source ESI⁺ à 4000 V, 150 °C ; désolvatation à 450 °C. Les transitions MRM sont dans le Tableau supplémentaire S2. Les courbes d'étalonnage couvraient 0,001–20 µM. LOD et LOQ étaient 0,001 µM et 0,005 µM, respectivement.

Analyse statistique

Le test t de Student évaluait les différences de D_H et PDI. IC₅₀ et EC₅₀ étaient calculés via l'équation de Hill dans GraphPad Prism®. L'ANOVA à un facteur suivie du test HSD de Tukey (p < 0,05) évaluait les effets des AuNP. Le coefficient de corrélation de Pearson reliait l'activité CYP à la production de métabolites.

Résultats et discussion

Propriétés physicochimiques des AuNP

Le TEM confirmait la monodispersité de toutes les AuNP nues et avec PC, sauf les PC‑BPEI‑AuNP de 40 et 80 nm qui montraient une agrégation dans le PBS. Les valeurs de D_H augmentaient pour les BPEI‑ et LA‑AuNP nues de 40 nm et les PC‑PEG‑AuNP sur 45 min, tandis que les PC‑LA‑AuNP de 80 nm diminuaient. Le PDI augmentait pour les AuNP nues de 40 nm et les PC‑PEG‑AuNP, et le potentiel zêta diminuait au cours du temps pour les BPEI‑AuNP nues. Ces changements reflètent des résultats antérieurs où la PC modifie la taille, l'absorbance et la morphologie des NP (Réf. 6, 7, 10, 26).

Métabolisme de la TST dans les HLM poolés

Six métabolites de la TST (cinq hydroxylés et l'AD) étaient détectés dans les pHLM. Les AuNP nues de 40 et 80 nm inhibaient la production de 2β‑OH‑TST, 6β‑OH‑TST et 15β‑OH‑TST de manière dose‑dépendante (IC₅₀ : 416–1113 µg mL⁻¹). Elles n'inhibaient pas le 16α‑ ou 16β‑OH‑TST, sauf les BPEI‑AuNP de 40 nm qui supprimaient légèrement le 16β‑OH‑TST à la dose la plus élevée. Fait intéressant, les AuNP nues augmentaient la production d'AD à haute concentration (4,3 pmol mg⁻¹ min⁻¹ pour les BPEI‑AuNP de 40 nm). Les AuNP revêtues de PC abolissaient largement ces inhibitions ; la PC atténuait également l'effet stimulateur sur l'AD pour les LA‑AuNP de 80 nm. Globalement, les AuNP nues réduisaient l'hydroxylation tout en augmentant parfois la déalkylation, un effet atténué par la PC.

Variabilité des HLM de donneur unique

L'activité CYP spécifique au donneur corrélait fortement avec la formation des métabolites : 6β‑OH‑TST corrélait avec CYP2C19 (r = 0,99, p = 0,01) et CYP3A4 (r = 0,99, p = 0,03) ; AD corrélait inversement avec CYP4A11 (r = –0,98, p = 0,04). Les AuNP à des concentrations non inhibitrices modulaient la production de métabolites différemment selon les donneurs, reflétant les polymorphismes et phénotypes CYP (Réf. 33). La taille, le revêtement de surface et la formation de PC affectaient tous significativement les niveaux de métabolites (p < 0,0001). Les PC‑PEG‑AuNP, par exemple, activaient la production d'AD chez le donneur HDC3 indépendamment de la taille.

Conclusions

Les AuNP, particulièrement les particules nues de 40 et 80 nm, inhibent l'hydroxylation de la TST et peuvent stimuler la déalkylation dans les HLM poolés. La présence d'une PC biologiquement pertinente atténue ces effets, en particulier pour les BPEI‑AuNP cationiques. Dans les HLM de donneur unique, les effets des AuNP dépendent de la chimie de surface et varient avec l'activité CYP individuelle, soulignant le potentiel des AuNP comme perturbateurs endocriniens. Ces résultats fournissent un cadre pour évaluer l'impact d'autres nanomatériaux sur le métabolisme des hormones stéroïdiennes et identifier les sous‑populations vulnérables.

Disponibilité des données et matériaux

Toutes les données générées ou analysées pendant cette étude sont incluses dans cet article et son fichier d'informations supplémentaires.

Abréviations

11β‑OH TST

11β‑hydroxytestostérone

15β‑OH TST

15β‑hydroxytestostérone

16α‑OH TST

16α‑hydroxytestostérone

16β‑OH TST

16β‑hydroxytestostérone

2α‑OH TST

2α‑hydroxytestostérone

2β‑OH TST

2β‑hydroxytestostérone

6α‑OH TST

6α‑hydroxytestostérone

6β‑OH TST

6β‑hydroxytestostérone

AD

Androstènedione

AgNP

Nanoparticules d'argent

ANOVA

Analyse de variance à un facteur

AuNP

Nanoparticules d'or

BPEI

Polyéthylénimine ramifié

CFS

Chlorpyrifos

CYP

Cytochrome P450

DEET

Diethyltoluamide

D_H

Diamètre hydrodynamique

DI

Eau déionisée

DLS

Diffusion dynamique de la lumière

EC₅₀

Concentration d'activation half‑maximale

EDC/NHS

1‑Éthyl‑3‑(3‑diméthylaminopropyl) carbodiimide/N‑hydroxysuccinimide

ESI⁺

Electrospray positif

HLM

Microsomes hépatiques humains

HSD

Différence significative honnête de Tukey

IC₅₀

Concentration inhibitrice half‑maximale

ISTD

Standard interne

LA

Acide lipoïque

LC‑MS/MS

Chromatographie liquide‑spectrométrie de masse en tandem

LOD

Limite de détection

LOQ

Limite de quantification

MRM

Surveillance de réactions multiples

NADP

Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit

NADPH

NADP réduit

naked

Sans PC

NP

Nanoparticule

PBS

Tampon phosphate salin

PC

Couronne protéique plasmatique humaine

PDI

Indice de polydispersité

PEG

Polyéthylène glycol

pHLM

Microsomes hépatiques humains poolés

QC

Contrôle qualité

SWCNT

Nanotube de carbone à paroi unique

TEM

Microscopie électronique à transmission

TFF

Filtration tangentielle

TiO₂

Dioxyde de titane

TST

Testostérone

UPLC TQD

Système de chromatographie liquide ultra‑performance avec détecteur triple quadrupôle