Nanogels PNIPAM sensibles à la température et au pH pour l'administration contrôlée à double stimulus du β-lapachone

Résumé

Des nanogels de poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAM) ont été copolymérisés avec de l'acide acrylique (AAc) pour ajuster la température critique de solution inférieure (LCST). Les nanogels PNIPAM-co-AAc résultants présentent deux transitions de phase de volume distinctes, la LCST augmentant avec la teneur en AAc. Lorsqu'ils sont chargés en β-lapachone (β-LP), la libération du médicament est gouvernée par la température et le pH, et fortement influencée par le ratio d'AAc. Notamment, la formulation PNIPAM-co-AAc20 retient <10 % de libération du médicament à pH acide-neutre et température corporelle, tout en libérant >70 % à pH basique. Ces résultats démontrent que les nanogels PNIPAM sensibles à la température et au pH sont des vecteurs prometteurs pour l'administration orale ciblant l'intestin.

Introduction

Les nanovecteurs sensibles aux stimuli sont de plus en plus employés dans l'administration de médicaments, l'imagerie et le diagnostic. Parmi les déclencheurs utilisés — pH, température, redox, champ magnétique, lumière — la température et le pH restent les plus largement exploités pour la libération contrôlée. Le PNIPAM, un polymère thermosensible, se rétracte au-dessus de sa LCST (~32 °C) en raison d'interactions hydrophobes, tandis que les groupes carboxyles déprotonés de l'AAc introduisent une répulsion électrostatique additionnelle qui déplace la LCST vers le haut. La copolymérisation du PNIPAM avec l'AAc offre donc une plateforme ajustable capable de répondre à la fois à la température et au pH. Le β-lapachone, un agent anticancéreux naturel, a une fenêtre thérapeutique limitée en raison de son métabolisme rapide et de sa toxicité hors cible ; l'encapsulation dans des nanogels sensibles peut atténuer ces inconvénients. Dans cette étude, nous rapportons la synthèse de nanogels PNIPAM-co-AAc avec différentes teneurs en AAc, leur comportement de libération de médicament à double stimulus et leur efficacité cytotoxique sur des cellules fibroblastes.

Méthodes

Matériaux

NIPAM (97 %, Sigma-Aldrich), N,N'-méthylènebisacrylamide (MBA), AAc, eau distillée, EtOH, persulfate de potassium (KPS, 98 %, Dae Jung), β-LP (Produits Naturels) et PBS étaient de grade analytique et utilisés tels que reçus.

Synthèse des nanogels PNIPAM-co-AAc

Dans un ballon de 500 mL, 2,26 g de NIPAM, 0,154 g de MBA et 0–0,145 g d'AAc étaient dissous dans 200 mL d'eau à 75 °C. Après purge à l'azote, 37,5 mg de KPS ont été ajoutés et le mélange a été refluxé pendant 10 min, produisant une solution trouble. Le polymère a été dialysé (12–14 kDa) pendant 7 jours, congelé dans l'azote liquide et lyophilisé pendant 3 jours pour obtenir des nanogels secs (PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5, PNIPAM-co-AAc10, PNIPAM-co-AAc20).

Chargement du β-LP

1 mg de nanogel sec était dissous dans 1 mL d'EtOH, et 0,1 mg de β-LP était ajouté. Le mélange était agité toute la nuit dans l'obscurité, puis dialysé (6–8 kDa), congelé et lyophilisé. Les nanogels chargés en β-LP résultants étaient stockés à 4 °C.

Caractérisation

La morphologie a été examinée par MET (200 kV) et MEB-FE (15 kV). Les spectres FT-IR ont été enregistrés sur un spectromètre Nicolet 6700. Le chargement et la libération du médicament étaient quantifiés par spectroscopie UV-Vis (200–800 nm). La LCST était déterminée par diffusion dynamique de la lumière (DDL) par incréments de 1 °C de 30 à 50 °C.

Études de libération du médicament

10 mL de nanogels chargés en β-LP étaient placés dans des tubes de dialyse (3,5 kDa) et incubés à 24 °C et 37 °C dans du PBS aux pH 2, 4, 7,4 et 8,0. À des intervalles définis (0–12 h), des aliquotes de 2 mL étaient prélevées et analysées par UV-Vis. La libération cumulative était calculée relativement au β-LP total chargé.

Essais de viabilité cellulaire

Des fibroblastes NIH3T3 (2×10⁴ cellules/puits) étaient traités avec du β-LP libre, PNIPAM-co-AAc5-β-LP ou PNIPAM-co-AAc20-β-LP à 0–20 µg/mL. Après 3 h, un test MTT (595 nm) et un marquage LIVE/DEAD® étaient réalisés pour évaluer la cytotoxicité.

Résultats et discussion

Préparation et morphologie

Les images MET et MEB (Fig. 1) révèlent des nanogels monodisperses avec des diamètres moyens d'environ 250 nm pour PNIPAM-co-AAc5. Les potentiels zêta diminuent de −13,6 mV (PNIPAM) à −23,6 mV (PNIPAM-co-AAc20), reflétant l'augmentation des groupes carboxylates de surface.

Comportement thermosensible

Les mesures DDL (Fig. 2) montrent deux transitions gonflement-rétractation distinctes. La première transition commence vers 30 °C, et la seconde apparaît près de 40 °C, se décalant à 45 °C pour PNIPAM-co-AAc20. Ainsi, la LCST augmente avec la teneur en AAc, cohérent avec les rapports antérieurs.

Libération de médicament à double stimulus

À 37 °C, PNIPAM-co-AAc20 libère seulement ~61 % de β-LP en 6 h, tandis que PNIPAM et PNIPAM-co-AAc5 libèrent ~80 %. À pH 8,0, la libération depuis PNIPAM-co-AAc20 augmente d'environ 10 % comparé au pH neutre ou acide (Fig. 3). Ces résultats confirment que la libération du médicament est synergiquement renforcée par le pH basique et la température élevée.

Cytotoxicité in vitro

Le β-LP libre réduit la viabilité cellulaire plus que les formulations en nanogels. PNIPAM-co-AAc20 affiche une viabilité cellulaire plus élevée à 20 µg/mL, corrélée à sa libération de médicament plus faible à 37 °C. La coloration live/dead (Fig. 4) montre une cytotoxicité prononcée pour PNIPAM-co-AAc5-β-LP à 3 h, tandis que PNIPAM-co-AAc20-β-LP reste largement non toxique jusqu'à 6 h à pH 8,0, où une mort cellulaire synergique est observée.

Conclusions

Nous avons conçu avec succès des nanogels PNIPAM-co-AAc dont la LCST peut être ajustée par la teneur en AAc. La formulation à haute teneur en AAc (20 %) présente une libération minimale de β-LP à la température physiologique mais libère le médicament efficacement à pH basique, imitant l'environnement de l'intestin grêle. Ces nanogels à double stimulus représentent donc une plateforme convaincante pour l'administration orale ciblant l'intestin du β-lapachone.