Cinétique et spécificité de la captation des vésicules extracellulaires HEK293T à l'aide de la cytométrie en flux d'imagerie

Introduction

La recherche sur les vésicules extracellulaires est un domaine en plein essor en raison de l'utilité thérapeutique et diagnostique des vésicules extracellulaires (VE) naturelles et modifiées. Les véhicules électriques ont un diamètre de 50 à 1000  nm, sont produits à partir de tous les types de cellules et sont enrichis de protéines transmembranaires, notamment CD63, CD81 et CD9; lipides; protéines; et ADN, ARN, ARNm et microARN [1,2,3,4,5]. Le contenu de l'EV, notamment l'ARNm et le miARN actifs, a été impliqué dans la modulation des cellules receveuses via la traduction de novo et la régulation post-traductionnelle des cellules cibles [4, 6]. Comprendre, puis modifier l'absorption et l'internalisation cinétiques des véhicules électriques, conduira finalement à une livraison optimisée du contenu des véhicules électriques aux cellules cibles avec des concentrations suffisamment élevées pour avoir un avantage thérapeutique.

Autrefois considérés comme « la poubelle des cellules », les véhicules électriques ont été exploités comme une alternative aux thérapies cellulaires en raison de nombreux avantages, notamment leur biocompatibilité, leur faible immunogénicité et toxicité, leur capacité à des doses répétées, diverses voies d'administration et leur potentiel de délivrance de médicaments. et les thérapies génétiques [3]. Notre groupe a déjà signalé les effets positifs des véhicules électriques dérivés des cellules souches neurales dans les accidents vasculaires cérébraux et les lésions cérébrales traumatiques. Dans les modèles d'AVC murins et porcins, les véhicules électriques ont amélioré la récupération tissulaire et fonctionnelle après l'AVC [3, 7, 8]. Nous avons également montré que les véhicules électriques étaient neuroprotecteurs avec des avantages fonctionnels dans un modèle de lésion cérébrale traumatique de rongeur [9]. Malgré ces effets observés et le potentiel futur des véhicules électriques, la spécificité et la cinétique de l'absorption des véhicules électriques sont mal comprises, ce qui peut entraver la traduction des thérapies des véhicules électriques en clinique.

Les véhicules électriques ont également été conçus en tant que vecteurs de transfert et chargés d'agents thérapeutiques, notamment des thérapies géniques et des composés chimiques comme alternative aux vecteurs thérapeutiques et de livraison à base de nanoparticules [4, 10, 11, 12]. Les cellules HEK293T ont été largement utilisées comme cellules productrices d'EV en raison de leur prolifération rapide inhérente, de leur rendement élevé en EV et de leur facilité de manipulation génétique [13,14,15,16,17]. Les véhicules électriques HEK293T ont fourni des thérapies géniques, y compris des thérapies par miARN pour le cancer du sein [12] et ont été utilisés pour fournir des constructions chimiothérapeutiques et protéiques thérapeutiques dans un modèle de schwannome [18]. Semblable aux études de nanoparticules synthétiques évaluant la cytotoxicité in vitro, les tests de toxicité MTT ont montré une faible toxicité des véhicules électriques HEK293T non chargés et une cytotoxicité élevée subséquente lorsqu'ils sont chargés de produits chimiothérapeutiques [10, 18, 19, 20, 21]. En raison de cette utilisation abondante des véhicules électriques HEK293T, nous avons analysé leur cinétique et leur spécificité dans cette étude.

L'absorption sélective ou spécifique fait référence à la capacité naturelle d'un véhicule électrique à cibler des types de cellules spécifiques. Il existe de nombreuses preuves sur les mécanismes d'internalisation des VE avec peu de consensus sur la spécificité de l'absorption [22]. Souvent, les véhicules électriques présentent une absorption sélective par des cellules receveuses similaires à celles de leurs cellules mères, les cellules épithéliales internalisent plus de véhicules électriques dérivés de l'épithélium que les autres cellules receveuses [23, 24], et les cellules souches mésenchymateuses (MSC) internalisent une quantité significativement plus élevée de véhicules électriques dérivés de MSC par rapport avec d'autres lignées cellulaires in vitro [24]. Cependant, d'autres études ont montré que les véhicules électriques sont internalisés par tous les types de cellules et présentent une biodistribution non sélective lorsqu'ils sont administrés in vivo [22, 25]. Malgré l'immense potentiel thérapeutique et l'intérêt des véhicules électriques, il existe une déficience dans la compréhension de la spécificité de l'absorption des véhicules électriques. En comprenant mieux la spécificité d'absorption des véhicules électriques, nous pouvons choisir de manière appropriée les cellules productrices de véhicules électriques qui sont sélectivement internalisées par les cellules receveuses d'intérêt et ainsi améliorer l'applicabilité thérapeutique des véhicules électriques.

Une raison potentielle des résultats contradictoires de l'absorption des VE est le manque de standardisation des plates-formes de mesure, y compris les analyses des effets de dose et de temps. Récemment, un groupe d'experts de la Société internationale pour les vésicules extracellulaires (ISEV) a publié un document de position soulignant la nécessité d'une analyse de la dose et du temps, parmi d'autres facteurs de confusion sur l'absorption des VE [26]. Le groupe a déclaré qu'« une dose ne convient pas à tous » et que cette dose peut affecter l'absorption ou la sélectivité des VE [26]. L'augmentation des doses de véhicules électriques HEK293T modifie le schéma de biodistribution in vivo [27]. Les profils d'absorption des véhicules électriques dérivés du sérum étaient significativement modifiés par la dose [28]. De plus, les temps de co-incubation des véhicules électriques avec des cellules receveuses allant de 15 min à 48 h [24, 29, 30, 31, 32, 33] peuvent altérer les mesures d'absorption. S'il est adopté par les chercheurs et l'industrie des véhicules électriques, un processus quantifiable et fiable pour déterminer les courbes de dose et de temps standard pour aider à identifier la dose efficace minimale peut conduire à des études plus solides et utiles.

Auparavant, les chercheurs utilisaient la cytométrie en flux standard ainsi que diverses formes de microscopie à faible débit, y compris la microscopie confocale pour analyser l'absorption d'EV [32,33,34]. Cependant, ces technologies présentent plusieurs limites. La microscopie confocale peut prendre du temps et être subjective. Les cytomètres en flux traditionnels ont été conçus pour mesurer les particules biologiques dans la gamme cellulaire, ne peuvent pas différencier les essaims EV ou les coïncidences et ont un bruit accru en raison du déclenchement [35,36,37,38]. Comme mentionné par le groupe ISEV, il y a une prise de conscience croissante des limites physiques de la cytométrie en flux traditionnelle et met en évidence la demande de cytométrie en flux spécialisée avec des limites de détection dans la plage de 100 nm [26, 38]. La cytométrie en flux d'imagerie (IFC) combine la nature quantitative à haut débit de la cytométrie en flux avec la technologie d'imagerie par fluorescence qui peut résoudre par nature de petites particules fluorescentes, jusqu'à 100  nm de diamètre [38]. Les capacités IFC conduisent à un faible bruit/arrière-plan, une diminution de l'essaimage et des dispositifs couplés chargés pour la clarté de l'image [37, 39]. Ces caractéristiques aident à développer une stratégie de synchronisation pour caractériser les véhicules électriques et l'absorption avec confirmation visuelle à haut débit en tant que plate-forme d'absorption des véhicules électriques précise et quantifiable [36, 37, 40].

Dans cette étude, des cellules HEK293T exprimant CD63-eGFP ont été utilisées comme lignée cellulaire donneuse pour la production d'EV en raison de leur utilisation courante dans le développement thérapeutique. Les véhicules électriques fluorescents isolés ont été co-cultivés avec des lignées cellulaires receveuses comprenant des cellules neurales et endothéliales. L'absorption a été quantifiée à l'aide de l'IFC, ce qui a permis de créer une plate-forme standardisée pour mesurer les caractéristiques importantes d'absorption et d'internalisation des véhicules électriques cinétiques pour les systèmes cellulaires in vitro. En outre, nous fournissons des données sur un processus pour quantifier l'absorption d'EV fluorescent dans différentes conditions et des lignées cellulaires cultivées pour élucider l'absorption sélective d'EV.

Matériaux et méthodes

Culture cellulaire

Des cellules rénales embryonnaires humaines (HEK293T) ont été achetées auprès de l'ATCC et cultivées dans du DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline et 100 g/mL de streptomycine. Les cellules souches neurales humaines (hNSC), les cellules neurales SH-SY5Y, les cellules épithéliales du foie C3A, les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) et les neurones ont tous été cultivés dans des conditions standard à 37°C, 5% CO_{2 avant les tests d'absorption des vésicules extracellulaires.}

Étiquetage et isolation EV

L'ADN plasmidique CD63-eGFP a été obtenu auprès d'Addgene (#62964). CD63-pEGFP C2 était un cadeau de Paul Luzio (plasmide Addgene #62964). Les cellules HEK293T ont été cultivées à 70 % de confluence dans des boîtes de 10 cm et 10 g d'ADN plasmidique ont été transfectés à l'aide de Lipofectamine 2000 selon les instructions du fabricant. Vingt-quatre heures après la transfection, les milieux ont été remplacés par des milieux HEK293T standard dépourvus de sérum bovin fœtal et collectés pendant 3 jours consécutifs. Comme décrit précédemment [3], les milieux HEK293T ont été filtrés à travers un filtre de 0,22 µm et enrichis par ultrafiltration à l'aide d'unités de filtration centrifuge Amicon en cellulose régénérée de 100 kDa et lavés deux fois avec du PBS++. Les véhicules électriques ont été concentrés à 1 mL, et les distributions de concentration et de taille ont été mesurées sur Nanosight NS300 par le protocole du fabricant (Malvern, Royaume-Uni). Les véhicules électriques ont été isolés de différents récipients de culture HEK293T, chaque récipient étant considéré comme des réplicats biologiques distincts, avec trois réplicats techniques dans chaque réplicat biologique (minimum de neuf échantillons au total pour chaque condition).

Tests d'absorption

Les lignées cellulaires receveuses ont été ensemencées à 60 % de confluence dans une plaque à 6 puits pendant 24 h dans des conditions de culture standard à 37 °C. Les milieux standard ont été remplacés par des milieux sans sérum bovin fœtal (FBS-) avant la co-culture de vésicules extracellulaires. Des véhicules électriques marqués à la protéine fluorescente verte (GFP) ont été administrés aux cellules à des doses et à des moments variables. Après co-culture, les cellules ont été remises en suspension dans 5% de trypsine et concentrées à environ un million de cellules par 50 μL pour la cytométrie en flux. Trente-sept degrés Celsius est la norme pour les expériences d'absorption d'EV dans nos tests, car il s'agit de la norme utilisée à la fois pour la culture cellulaire et les plates-formes d'absorption d'EV in vitro [31, 41, 42, 43, 44].

Dosages inhibiteurs

Dosage à froid

Les véhicules électriques ont été co-cultivés avec des cellules receveuses à 4 °C pour « mettre en pause » efficacement la croissance de la culture cellulaire et inhiber les processus actifs [45]. Quatre degrés Celsius inhibent toutes les formes actives d'absorption d'EV [31, 41, 42, 43, 44].

Dosage fixe

Les cellules receveuses ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min sur de la glace et lavées avec du PBS immédiatement avant la co-culture avec des véhicules électriques pour inhiber toutes les formes actives d'absorption des véhicules électriques.

Acquisition ImageStreamX

L'acquisition a été effectuée sur le cytomètre de flux d'imagerie ImageStreamX Mark II (Luminex Corporation, Seattle, Washington) à l'aide du logiciel INSPIRE. Un minimum de 5 000 à 10 000 événements cellulaires ont été acquis. Chaque échantillon biologique a été répliqué dans trois puits techniques répliqués et acquis individuellement sur l'ISx. Des images en fond clair ont été collectées sur le canal un et une diffusion latérale (785  nm) sur le canal six. La protéine fluorescente verte (GFP) a été excitée par un laser à argon de 488 nm à 200 mW, et la fluorescence a été collectée sur le canal deux (480-560  nm). Un grossissement de 60× a été utilisé sur chaque échantillon avec un faible taux d'acquisition pour une sensibilité élevée.

Analyse des IDÉES

Les analyses de données et d'images ont été réalisées à l'aide du logiciel IDEAS (Luminex). La stratégie de blocage est la suivante :

1. 1.

   La porte de mise au point a été déterminée pour éliminer les cellules qui n'étaient pas dans le champ de mise au point en utilisant la valeur RMS du gradient.

2. 2.

   Les cellules focalisées ont été fermées pour éliminer les doublets et les débris en utilisant un champ clair de zone par rapport à un champ clair de rapport d'aspect. Les données fermées ont été utilisées pour créer des histogrammes et générer des références statistiques mesurant l'intensité de fluorescence (somme de tous les pixels d'une image), l'intensité maximale des pixels (intensité des pixels les plus brillants d'une image), ainsi que les valeurs de comptage de points via des algorithmes internes pour chaque échantillon. Les caractéristiques de comptage ponctuel ont été générées à l'aide des assistants IDEAS applicables. Le nombre de points, l'intensité moyenne et le rapport de pixels maximum sont calculés par la formule (valeur de sortie avec EV/valeur de sortie sans EV).

Statistiques

Toutes les données quantitatives ont été analysées via GraphPad Prism 8.1.2 (San Diego, Californie) et réalisées en triple. Les données sont présentées sous forme d'erreur moyenne  ±  standard de la moyenne (SEM). La signification statistique a été déterminée à l'aide d'un T non apparié test ou une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) avec la comparaison multiple post hoc de Tukey ou Dunnett par rapport aux témoins, le cas échéant. p < 0,05 a été considéré comme significatif.

Résultats

Propriétés des vésicules extracellulaires HEK293T marquées par CD63-eGFP

Pour générer des véhicules électriques marqués par fluorescence pour analyser la cinétique et l'absorption des vésicules extracellulaires, les cellules HEK293T ont été transfectées avec un plasmide portant la protéine de fusion CD63-eGFP. CD63 est une protéine tétraspanine couramment enrichie dans la membrane des exosomes, ce qui en fait une cible optimale pour le marquage fluorescent EV [46, 47]. Les milieux usés ont été collectés à partir de cultures cellulaires HEK293T et les véhicules électriques ont été isolés comme indiqué précédemment [8]. Nous avons comparé la taille et la distribution des véhicules électriques isolés des cellules HEK293T transfectées par CD63-eGFP à des cellules HEK293T non transfectées. Les véhicules électriques HEK293T de contrôle et transfectés par CD63-eGFP ont affiché un diamètre médian moyen de 110,28  nm et 103,616  nm, respectivement, tel que mesuré par le logiciel de nanotracking (Fig. 1a), ce qui est cohérent avec la taille rapportée des véhicules électriques HEK293T [13, 15, 27 , 48]. Aucune différence significative dans le diamètre médian (p = 0.1615) et distribution (p =  0,4225) des véhicules électriques isolés à partir de cellules HEK293T non transfectées et transfectées par CD63-eGFP ont été observées. L'étiquetage eGFP n'a pas modifié la taille des véhicules électriques HEK293T (Fig. 1b).

Caractérisation des véhicules électriques HEK293T marqués avec CD63-eGFP. Les véhicules électriques ont été isolés de HEK293T (contrôle) et HEK293T exprimant les milieux de culture cellulaire CD63-eGFP. un Distribution de taille EV représentative enregistrée via un logiciel de nanotracking. b Quantification de la distribution du diamètre moyen des véhicules électriques HEK293T transfectés vs non transfectés. c Images IFC de billes de contrôle négatives, de véhicules électriques de contrôle HEK293T et de véhicules électriques marqués par CD63-eGFP. BF signifie champ clair, GFP signifie protéine fluorescente verte (laser d'excitation 488  nm) et SSC signifie diffusion latérale. Une eGFP positive dans le canal GFP signifie des véhicules électriques HEK293T fluorescents. d Expression du marqueur de surface MACSPlex basée sur la cytométrie en flux des véhicules électriques HEK293T non transfectés et des véhicules électriques HEK293T CD63-eGFP. Les deux sources EV sont positives pour CD29, CD9, CD63 et CD81, telles que mesurées en fluorescence relative (indiquée par X pour positif). Les barres représentent la moyenne  ± SEM ; N = 3; test T non apparié. n.s. signifie p> 0,05

Un test IFC a été effectué pour déterminer si le CD63-eGFP était associé aux véhicules électriques. En tant que contrôle négatif fluorescent, les billes de 1,34 M dans la solution tampon (Fig. 1 c, en haut) manquaient de fluorescence lorsqu'elles étaient exposées à la longueur d'onde d'excitation de 488 nm, mais étaient visibles en champ clair (BF) et en diffusion latérale (SSC). Les véhicules électriques HEK293T non marqués étaient négatifs dans les BF, GFP et SSC, suggérant une petite taille en dessous du seuil de BF et un manque de fluorescence (Fig. 1d, milieu). L'absence dans BF signifie une taille de VE inférieure à 300  nm, ce qui suggère un essaimage minimal de VE. Enfin, les véhicules électriques marqués par CD63-eGFP sont négatifs dans BF et positifs dans le canal GFP, ce qui signifie une fluorescence positive des véhicules électriques HEK293T (Fig. 1c, en bas). Le signal positif dans le canal GFP peut être indicatif d'un seul EV ou d'un groupe d'EV fluorescents. Collectivement, ces résultats montrent que les VE HEK293T isolés ont une taille standard et des profils de marqueurs protéiques cohérents avec les rapports précédents sur les exosomes HEK293T, et le marquage eGFP ne modifie pas la taille des VE HEK293T [5, 27].

En utilisant une méthode basée sur la cytométrie en flux disponible dans le commerce pour mesurer les marqueurs EV courants, nous avons déterminé le profil global de la tétraspanine EV [5]. Les VE HEK293T isolés des cellules témoins et exprimant le CD63-eGFP HEK293T étaient positifs pour les marqueurs EV standard, notamment CD9, CD63 et CD81, mesurés en unités de fluorescence relative (Fig. 1d). Comme indiqué précédemment, CD29 a également été trouvé à la surface des véhicules électriques HEK293T et des véhicules électriques HEK293T transfectés par CD63-eGFP [5]. Ces résultats indiquent que les méthodes d'isolement et de marquage pour HEK293T EV aboutissent à des EV avec des marqueurs d'exosomes HEK293T communs.

Acceptation active des véhicules électriques HEK293T

Deux tests d'internalisation inhibitrice ont été réalisés. Les VE HEK293T ont été co-cultivées avec des cellules receveuses à 4°C (froid) ou avec des cellules receveuses préalablement fixées avec du paraformaldéhyde (fixe). Les traitements ont diminué la présence d'EV marqués par eGFP dans les cellules receveuses par rapport aux cellules receveuses co-cultivées avec des EV dans des conditions physiologiques (Fig. 2a). Les tests inhibiteurs à froid et fixes ont réduit le nombre de taches (à froid :p = 0,0127, corrigé :p = 0.0078), intensité (froid :p = 0,0105, corrigé :p = 0,0374), et pixel maximum (à froid :p = 0,0159, corrigé :p =0,0149) des signaux de fluorescence dans les cellules receveuses sans traitement, indiquant une inhibition de l'absorption d'EV. Ces résultats suggèrent que la localisation de l'eGFP et l'augmentation des paramètres de sortie signifient que les VE HEK293T sont internalisés pour les tests d'absorption suivants.

Essais d'inhibition de l'internalisation EV. Les cellules HEK293T ont été co-cultivées avec des véhicules électriques HEK293T dans diverses conditions. Le témoin (37°C) fait référence à la co-culture dans un environnement physiologique à 37°C. Le froid fait référence à la co-culture dans un environnement à 4°C. L'inhibition fixe fait référence à un essai où les cellules receveuses ont été fixées au PFA avant la co-culture. un Images IFC représentatives des cellules receveuses. La colonne 1, BF, signifie champ clair. La colonne 2, GFP, signifie la protéine fluorescente verte (laser d'excitation de 488  nm) et la colonne 3 signifie une fusion de BF et de GFP. Le contrôle montre une GFP positive représentant l'internalisation de l'EV. b –d Quantification des tests d'inhibition par rapport aux contrôles via le nombre de points, l'intensité de fluorescence moyenne et le pixel maximum. Les barres représentent la moyenne  ± SEM ; N = 3; ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Tukey par rapport au témoin. *p < 0,05 ; ***p < 0,01

Capture EV HEK293T dépendante de la dose

Pour développer une courbe de dose standard pour la plate-forme IFC, les véhicules électriques HEK293T ont été co-cultivés avec des cellules receveuses HEK293T à des doses croissantes allant de 0 à 20 000 véhicules électriques par cellule à 37 °C. Des images IFC représentatives ont montré une augmentation visuelle de la fluorescence eGFP avec des doses élevées de véhicules électriques (Fig. 3a). Le plus petit nombre d'EV pouvant être détectés était de 6 000 EV par cellule HEK293T co-cultivée. A ce niveau, le comptage ponctuel (p = 0.0012), intensité (p = 0,0075) et pixel maximum (p =  0,0005) les mesures étaient significativement supérieures à celles des cellules receveuses sans EV (Fig. 3b–d). Par conséquent, des doses de 6000 HEK293T EVs sont le seuil bas d'absorption dans notre condition expérimentale. De même, les doses de 10 000 et 20 000 EV avaient un nombre de taches plus élevé (10 000 :p = 0,0009 ; 20 000 :p < 0,0001), intensité (10 000 :p < 0,0001 ; 20 000 :p < 0,0001) et pixel maximum (10 000 :p < 0,0001 ; 20 000 :p < 0,0001) par rapport aux cellules sans VE. En comparant les doses les plus élevées, il n'y a pas de différences significatives dans le nombre de taches (6 000 contre 10 000 :p = 0.999, 10 000 contre 20 000 :p = 0,0927), intensité (6000 vs. 10000 :p = 0.8482, 10 000 contre 20 000 :p = 0.999) et nombre de pixels maximum (6000 contre 10000 :p = 0,6056, 10 000 contre 20 000 :p = 0,5281) entre 6 000 et 10 000, avec 10 000 contre 20 000. De même, en comparant entre 6 000 et 20 000, il n'y a pas de différence statistique dans le nombre de points (p = 0,0787) et l'intensité (p = 0.8083). Il y a une différence significative de pixel maximum entre 6000 et 20000 (p = 0,0140). Globalement, la courbe de rendement affiche une dépendance à la dose significative dans tous les paramètres (spot, intensité, pixel max, p < 0,0001). Ces résultats indiquent que l'absorption de HEK293T EV dépend de la dose avec un seuil minimum de 6000 HEK293T EVs par cellule.

L'absorption de HEK293T EV a un effet dose avec un seuil minimum de 6000 EV. Les cellules HEK293T ont été co-cultivées avec HEK293T EVS à des doses croissantes de 0 à 20 000/cellule. un Images IFC représentatives des cellules receveuses avec les doses respectives d'EV. La localisation GFP signifie l'absorption de HEK293T EV. b –d Quantification des dosages par rapport aux témoins et à chaque groupe via le nombre de points, l'intensité de fluorescence moyenne et les rapports de pixels maximum. Les barres représentent la moyenne  ± SEM ; N = 3; ANOVA à sens unique suivie du test post hoc de Tukey. *p < 0,05 ; ***p < 0,01

Capture temporelle HEK293T EV

En utilisant 6000 véhicules électriques par cellule, les véhicules électriques HEK293T ont été co-cultivés avec des cellules HEK293T pendant des durées croissantes avant l'IFC, allant de 5 min à 24 h. La durée d'exposition à l'EV a joué un rôle clé dans la quantité de fluorescence visible dans les cellules receveuses, diminuant après 12 h (Fig. 4a). Initialement, 30 min de co-culture ont affiché une augmentation significative du nombre de taches (p = 0,0081) suggérant une tendance possible vers l'absorption d'EV, mais pas dans d'autres paramètres d'absorption (intensité :p = 0,3073, pixel maximum :p =0,0952) (Fig. 4b–d). À 2 h de co-culture, nombre de taches significativement plus élevé (p = 0.0028), intensité (p = 0.0420), et pixel maximum (p =  0,0006) ont été enregistrés par rapport aux cellules receveuses sans EV. Encore une fois, à 4 h de co-culture, tous les paramètres étaient supérieurs aux témoins (nombre de spots :p = 0,0003, intensité :p < 0,0001, pixel maximum :p < 0,0001). L'intensité et le pixel maximum ont continué à être plus élevés que les témoins à 4, 12 et 24 h de co-culture. Il n'y avait aucune différence dans les paramètres d'absorption entre 4  et 12 h de co-culture (spot :p = 0.999, intensité :p = 0,5797 ; pixel maximum :p = 0,2489). Cependant, l'intensité (p = 0.0191), et pixel maximum (p = 0,0027) a diminué entre 12 et 24 h de co-culture (Fig. 4c,d). Semblable à la courbe de dose, l'absorption d'EV HEK293T dépend du temps avec une absorption d'EV cohérente à 4 h d'incubation et un pic à 12 h. Collectivement, une dose de 6000 EV par cellule ensemencée et une co-culture de 4 h ont été standardisées pour les tests d'absorption suivants.

L'absorption du HEK293T EV dépend du temps. Les cellules HEK293T ont été co-cultivées avec 6000 EV HEK293T/cellule pendant des durées croissantes. un Images IFC représentatives des cellules receveuses, respectivement. La localisation GFP signifie une absorption accrue de HEK293T EV. b –d Quantification des tests d'évolution dans le temps par rapport aux témoins et à chaque groupe via le nombre de points, l'intensité de fluorescence moyenne et les rapports de pixels maximum. Les barres représentent la moyenne  ± SEM ; N = 3; ANOVA à sens unique suivie du test post hoc de Tukey. *p < 0,05 ; ***p < 0,01

Capture comparative des véhicules électriques HEK293T par plusieurs lignées cellulaires

L'hypothèse selon laquelle l'absorption des véhicules électriques est un processus sélectif où les véhicules électriques sont préférentiellement absorbés par les cellules de leur propre origine a été testée à l'aide de l'IFC. Les véhicules électriques HEK293T ont été co-cultivés avec des cellules HEK293T ou d'autres lignées cellulaires :épithéliales (cellules hépatiques C3A), endothéliales (cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine) et neurales (cellules de glioblastome SH-SY5Y.). La fluorescence eGFP est plus abondante dans les cellules HEK293T par rapport aux autres types de cellules (Fig. 5a). Par rapport aux cellules C3A et HUVEC, les cellules HEK293T présentaient une intensité de fluorescence significativement plus élevée (C3A :p = 0,0321 ; HUVEC :p =  0,0055) (Fig. 5c), lorsqu'il est co-cultivé avec des véhicules électriques HEK293T. De plus, les cellules HEK293T avaient un pixel maximum plus élevé (C3A :p = 0,0221 ; HUVEC :p = 0,0079 ; SH-SY5Y :p =0,0486) (Fig. 5d) par rapport à toutes les autres lignées cellulaires receveuses (Fig. 5b). En ce qui concerne l'intensité, les cellules SH-SY5Y étaient significativement plus élevées que les HUVEC lorsqu'elles étaient co-cultivées avec des véhicules électriques HEK293T (p =0,0304). Ces résultats soutiennent l'absorption sélective de HEK293T EV par les cellules HEK293T par rapport à d'autres lignées cellulaires in vitro.

Les véhicules électriques HEK293T affichent une préférence d'absorption par rapport aux cellules HEK293T. Les véhicules électriques HEK293T ont été co-cultivés avec des cellules HEK293T, des cellules épithéliales C3A, des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) et des cellules neurales SY5Y. un Images IFC représentatives de cellules receveuses co-cultivées avec des véhicules électriques HEK293T. b –d Quantification des tests de préférence d'absorption EV par rapport aux témoins et entre eux via le nombre de points, l'intensité de fluorescence moyenne et les rapports de pixels maximum. Les barres représentent la moyenne  ± SEM ; N = 3; ANOVA à sens unique suivie du test post hoc de Tukey. *p < 0,05 ; ***p < 0,01

État de différenciation des cellules neuronales et internalisation de HEK293T EV

Étant donné que les véhicules électriques ont été impliqués à des fins thérapeutiques et d'administration ciblant les maladies neurales, des cellules souches neurales humaines (hNSC) et des neurones humains matures ont été utilisés comme lignées cellulaires receveuses dans notre système pour examiner si l'état de différenciation de la cellule receveuse joue un rôle dans l'absorption sélective. des VE. Des images représentatives de l'IFC ont affiché des preuves visuelles de l'absorption dans les deux types de cellules, mais avec la plus grande localisation d'eGFP dans les hNSC (Fig. 6a). Les hNSC co-cultivés avec les véhicules électriques HEK293T ont un nombre de taches plus élevé (p = 0,0082) et pixel max (p =0,0083) par rapport aux neurones matures. Ensemble, ces résultats suggèrent que l'état de différenciation des cellules neurales affecte l'absorption des véhicules électriques HEK293T.

L'état de différenciation neuronale affecte l'absorption de HEK293T EV. Les véhicules électriques HEK293T ont été co-cultivés avec des neurones humains matures et des cellules souches neurales humaines. un Images IFC représentatives de cellules receveuses co-cultivées avec des véhicules électriques HEK293T. b –d Quantification des tests de préférence d'absorption EV par rapport aux témoins et entre eux via le nombre de points, l'intensité de fluorescence moyenne et les rapports de pixels maximum. Les barres représentent la moyenne  ± SEM ; N = 3; T non apparié test. *p < 0,05 ; ***p < 0,01 par rapport à 0 EV (contrôle)

Discussion

Processus de normalisation de l'absorption in vitro EV

Un groupe d'experts internationaux sur les véhicules électriques a souligné la nécessité de déterminer efficacement la dose efficace minimale de véhicules électriques pour les tests d'absorption, et nous avons développé ici un système qui peut être efficacement adopté par le terrain [26]. Il y a des défis lors de l'analyse de l'adoption des VE. Par exemple, comme nous et d'autres l'avons observé, les résultats peuvent différer si la dose EV et le temps d'exposition sont modifiés [26]. Nous avons traité la dose et la concentration de HEK293T EV en tant que variable cinétique. En outre, une dose efficace minimale in vitro peut prédire de manière plus uniforme la biodistribution in vivo des véhicules électriques et être utilisée pour développer des paramètres de dosage in vivo plus cohérents pour les thérapies et l'administration des véhicules électriques. Dans une étude de biodistribution des véhicules électriques in vivo chez la souris, l'augmentation de la dose de véhicules électriques HEK293T a entraîné un changement de la distribution relative des véhicules électriques dans les organes [27]. Semblable aux résultats d'une étude in vitro antérieure utilisant des véhicules électriques pour le cancer de la vessie [39], les véhicules électriques HEK293T ont affiché une forte dépendance à la dose avec une dose efficace minimale à 6 000 véhicules électriques dans notre étude. Nous sommes les premiers à utiliser les particules par cellule comme mesure de dose sensible in vitro, ce qui correspond mieux aux modèles in vivo utilisant des particules par poids corporel. Nos données ont également indiqué une limite de saturation de dose après 6 000 EV, ce qui pourrait éclairer les futures études de détermination de la dose in vivo en indiquant que des doses plus élevées peuvent avoir des avantages limités.

Une autre variable de confusion de la mesure de l'absorption des VE est les effets temporels potentiels sur l'absorption des VE. Dans notre système, nous avons trouvé une forte dépendance temporelle avec une absorption dès 2 h avec une diminution potentielle entre 12 et 24 h. Semblable à nos résultats, une dépendance temporelle a été rapportée dans quelques études utilisant des cellules cancéreuses de la vessie, des cellules tumorales et d'autres avec une absorption dès 15 min à 24 h [29,30,31,32,33, 39, 43, 49]. Comme on le voit avec les véhicules électriques HEK293T, les valeurs inférieures à 24 h de co-culture peuvent être le résultat de la division cellulaire ou du recyclage/dégradation des véhicules électriques intériorisés à des moments précoces [50]. Plus précisément, comme il a été démontré que les véhicules électriques étaient internalisés puis décomposés ou internalisés puis libérés après 24 h, des incubations plus longues peuvent générer des lectures d'internalisation inexactes [31, 50]. Notre étude est la première à utiliser IFC pour fournir des preuves visuelles et quantitatives d'une courbe de rendement dépendante du temps sur l'absorption de HEK293T EV.

Comme le suggère le document de position de l'ISEV, le choix d'une étiquette EV peut affecter l'absorption, nécessitant des techniques moins perturbatrices telles que les méthodes de marquage GFP utilisées dans notre étude. Plus précisément, 72 % des chercheurs participant à une enquête affirment que les expériences de colorants lipidiques ne sont pas fiables à moins que des contrôles appropriés ne soient utilisés [26]. Les colorants EV ne sont pas corrélés de manière fiable avec une faible teneur en EV et peuvent même augmenter la taille des vésicules. La contamination des lipoprotéines et de la teneur en protéines mal étiquetées et l'agrégation des colorants ont contribué aux faux positifs [51, 52]. Therefore, we fused CD63 with an eGFP to label the HEK293T EVs. Similar to other reports of protein tagging, HEK293T EVs were GFP positive with no observed differences in diameter and maintained standard EV surface protein composition [38, 46]. Despite this, it is important to note that labeling EVs with specific EV proteins may limit the tracking to only a few subtypes of EVs expressing the respective markers. Other potential limitations may be that the fluorescence intensity is dependent on protein expression level, the efficiency of EV membrane labeling, and excitation strength of the light source [53]. However, IFC is sensitive, detecting low fluorescence intensity with accurate visualization of CD63-GFP particles at the 100-nm range [38, 54].

Selective Uptake

EVs display proteins and other signals that may confer selective uptake [22, 23, 55]. Since the first step of EV biogenesis is the invagination of the plasma membrane, the EV membrane contains similar proteins, receptors, adhesion molecules, and integrins when compared with the donor cell membrane [22, 24, 55]. The lipid composition and tetraspanin proteins on EV membranes regulated by donor cells may contribute to EV tropisms with recipient cells [23, 34, 56]. MSC EVs selectively transported contents into MSCs, despite closer proximity to monocytes [24]. In contrast, others report that natural EVs were taken up equally by any cell type, regardless of EV origin [11, 22, 25, 57] when utilizing imaging or functional knockdown assays. Using the IFC platform, we found that HEK293T extracellular vesicles are taken up at greater quantities by HEK293T cells than other reported cell lines, thus suggesting an inherent EV uptake specificity. Through this outcome and the versatility of IFC, EV sources can be appropriately selected and analyzed for targeting specific recipient cells. To our knowledge, this is the first study utilizing imaging flow cytometry to analyze the specificity of HEK293T EVs.

In addition to self-selectivity, differentiation status of recipient cells has been hypothesized to play a role in uptake of EVs [32, 58, 59]. As our group and others have shown, EVs have therapeutic effects in the central nervous system and are known to modulate cell functions in neuronal development and adults [3, 7,8,9, 60]. Here for the first time, differentiation status of neurons affected EV uptake, where human neural stem cells had significantly greater uptake of HEK293T EVs compared to mature neurons. Immature hNSCs more actively internalize exogenous EVs than quiescent mature neurons. Since hNSCs are highly proliferative cells in culture, they may nonspecifically internalize nutrients and EVs. Similarly, immature dendritic cells internalized EVs at higher levels than mature dendritic cells [32, 59]. However, another study with myeloid precursor cells found that the mature dendritic cells and macrophages internalized more EVs than immature dendritic cells and monocytes [58]. The observed differences can be attributed to the phagocytic activity of further differentiated myeloid cells. Due to the in vitro evidence supporting selective uptake, HEK293T EVs can be used to modulate undifferentiated neurons in future therapeutic applications.

Conclusions

In summary, we have further developed a quantitative and high-throughput platform for quantifying HEK293T EV uptake kinetics. This platform can be extended to other donor EVs and recipient cell types and assays for liposomes and synthetic nanoparticle delivery vectors. Significantly, we found that HEK293T EV uptake is a selective process, with specificity towards HEK293T cells. The IFC assays developed here can be used to better define parameters used in in vivo dose escalation and biodistribution studies and provide instrumental information for a predictive model of EV uptake outcomes in vivo.

Disponibilité des données et des matériaux

The datasets generated and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Abréviations

EV:

Extracellular vesicles

HEK293T:

Human embryonic kidney cell line

IFC:

Imaging flow cytometry

hNSC:

Human neural stem cell

GFP:

Green fluorescent protein

BF:

Bright field

SSC:

Side scatter

ISEV:

International Society of Extracellular Vesicles