Co-administration de dacarbazine et d'acide rétinoïque tout-trans (ATRA) à l'aide de nanoformulations lipidiques pour une efficacité antitumorale synergique contre le mélanome malin

Introduction

Le mélanome malin est l'une des tumeurs malignes agressives survenant principalement dans la peau humaine [1]. Le mélanome représente 4% de tous les cancers dermatologiques, mais il est responsable de 80% de mortalité par cancer de la peau et devient une préoccupation croissante dans les pays sous-développés et en développement [2, 3]. Le mélanome a une forte tendance à se métastaser dans les différentes parties du corps, y compris le cerveau, le cœur et les poumons, ce qui en fait l'une des formes agressives de malignité [4]. Si elle est diagnostiquée à un stade précoce, l'excision chirurgicale fait partie des options thérapeutiques potentielles. Cependant, l'intervention chirurgicale ne garantit pas une guérison complète du mélanome [5]. En outre, la phase de croissance radiale de cette tumeur maligne devient résistante à la majorité des autres options thérapeutiques, notamment la chimiothérapie et la radiothérapie [6]. Pour être précis, les récepteurs peptidiques sont surexprimés à la surface du cancer du mélanome, ce qui en fait une perspective attrayante. Il a été démontré que le récepteur de la somatostatine de sous-type 2 (SSTR2) s'exprime fortement dans les cellules de mélanome [7].

La dacarbazine (DBZ) ou le diméthyl-triazéno-imidazole carboxamide (DTIC), un agent d'alkylation de l'ADN, est le seul et premier choix de médicament chimiothérapeutique approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) [8]. Le DBZ est un agent alkylant puissant qui tue les cellules cancéreuses en ajoutant les groupes alkyle à l'ADN ou aux matériaux nucléaires des cellules cancéreuses [9]. Malgré son action puissante, le DBZ souffre d'une faible solubilité aqueuse et d'une courte demi-vie (41 min) dans la circulation sanguine, ce qui diminue son effet thérapeutique dans le traitement des mélanomes malins [10]. Par ailleurs, un taux de réponse décevant entre 10 et 25 % a été observé avec moins de 5 % de guérison complète du cancer indiquant la limitation d'une monothérapie [11, 12]. Par conséquent, il est urgent de développer une stratégie alternative pour améliorer l'efficacité du traitement de DBZ.

La co-administration de plusieurs agents thérapeutiques en une seule administration s'est avérée plus efficace que celle de l'agent thérapeutique individuel [13]. La co-administration d'agents thérapeutiques dans un système de support unique conférera une activité synergique, des propriétés pharmacocinétiques similaires et une efficacité anticancéreuse plus élevée [14]. L'acide tout-trans-rétinoïque (ATRA) est un agent anticancéreux prometteur utilisé dans le traitement de plusieurs cancers [15]. L'ATRA a montré son efficacité thérapeutique en se liant aux récepteurs de l'acide rétinoïque dans le noyau des cellules cancéreuses, entraînant l'inhibition de la croissance, de la prolifération, de la différenciation et, à terme, de la mort cellulaire [16]. Contrairement à d'autres agents chimiothérapeutiques, l'ATRA n'a entraîné aucun effet indésirable tel qu'une cardiotoxicité ou une hypoplasie de la moelle osseuse. Il a été rapporté que l'ATRA améliore l'efficacité anticancéreuse lorsqu'il est utilisé en association avec un agent chimiothérapeutique approprié. Encore une fois, l'ATRA lipophile souffre d'une faible solubilité aqueuse et d'une clairance systémique rapide nécessitant la nécessité d'un système d'administration stable [17].

Il a été démontré que les systèmes d'administration de nanoparticules améliorent l'efficacité thérapeutique des produits thérapeutiques encapsulés en les libérant dans les tissus tumoraux cibles et en évitant l'effet hors cible dans la circulation systémique en utilisant un effet amélioré de perméation et de rétention (EPR) [18, 19]. Les nanoparticules lipidiques solides (SLN) sont considérées comme une alternative à de nombreux supports existants, y compris les liposomes ou les micelles en raison des caractéristiques principales telles qu'une stabilité améliorée, une libération contrôlée de médicament, une efficacité de chargement élevée et une facilité de préparation/mise à l'échelle [20] . L'un des aspects importants du SLN en tant que vecteur d'administration de médicaments est le profil d'innocuité des lipides de statut GRAS, bien tolérés et des lipides physiologiques [21]. L'incorporation stable de médicaments dans le noyau lipidique améliore la solubilité aqueuse et améliore le profil pharmacocinétique et prolonge la stabilité physiologique dans la circulation systémique [22].

Dans cette étude, nous abordons une stratégie prometteuse de co-administration de DBZ et d'ATRA à l'aide de nanoformulations lipidiques pour le traitement combiné des mélanomes malins. Le DBZ devrait se charger dans le noyau lipidique tandis que l'ATRA devrait faire partie de la structure des nanoparticules. Nous avons étudié les propriétés physico-chimiques, l'absorption cellulaire et la cytotoxicité in vitro de nanoparticules combinées. De plus, l'effet anticancéreux a été évalué plus avant par un test d'apoptose, une analyse du cycle cellulaire, la formation de colonies et une analyse de la migration cellulaire.

Conclusion

En conclusion, nous avons formulé avec succès des nanoformulations lipidiques chargées de dacarbazine et d'acide rétinoïque tout-trans. Nos résultats démontrent clairement que le RD-LNF inhibe la prolifération cellulaire du mélanome, induit une apoptose remarquable et inhibe la progression du cycle cellulaire et les migrations cellulaires. Les travaux futuristes se concentreront sur l'étude de l'efficacité anticancéreuse dans des modèles animaux cliniquement pertinents et sur le développement d'une thérapie ciblée contre le mélanome malin. Il s'agit d'une étude préliminaire réalisée dans les cellules de mélanome et des études à grande échelle dans différents modèles animaux cliniquement pertinents constituent la prochaine partie de notre travail de recherche.

Matériaux et méthodes

Préparation de nanoformulations lipidiques chargées de DBZ/ATRA

Les nanoparticules lipidiques chargées de médicament ont été préparées par la méthode de sonication. Brièvement, 10 mg de DBZ et 10 mg d'ATRA ont été dissous dans 2 ml d'une solution de chloroforme contenant 50 mg d'œuf l-α-phosphatidylcholine (PC) et 2 mg de DSPE-méthyl(polyéthylène glycol)-2000 (mPEG₂₀₀₀ ). Le solvant organique a été séché en utilisant l'exposition au gaz argon pendant 20 minutes. Le mélange médicament + lipide séché a été additionné de 80 mg de trimyristine (Tm) et incubé à 65°C pendant 1 h. A ce mélange d'huile, 5 ml d'une solution de poloxamère à 4 % ont été ajoutés et la sonde immédiatement soniquée à 80 W pendant 6 min. L'émulsion résultante a été refroidie sur de la glace pendant 30 min. Les nanoparticules ont été soumises à une unité de filtre centrifuge Amicon Ultra 0,5 (seuil de 3 kDa ; Merck, Allemagne) à 12 000 ×g pendant 20 minutes. La quantité de DBZ et d'ATRA libres dans le filtrat a été évaluée par la méthode HPLC et l'efficacité de chargement et la capacité de chargement ont été calculées. Un système HPLC Waters composé d'une pompe binaire Waters 1525, d'un détecteur UV Waters 2487, d'un détecteur à fluorescence Waters 2475, d'un réchauffeur de colonne 1500 et d'une colonne Symmetry C18 a été utilisé pour l'analyse du médicament. Pour l'ATRA, la phase mobile était constituée d'acétonitrile et d'acide trifluoroacétique dans un rapport 90/10 v/v à un débit de 1 ml/min et détectée à 348 nm. Pour DBZ, de l'acétonitrile et de l'hydrogénophosphate disodique 0,05 M dans un rapport 30/70 v/v contenant 0,5 % de TEA ont été utilisés. Le pH de la phase mobile a été maintenu à pH 3,7 et un débit de 1 ml/min a été utilisé.

Analyse de la taille des particules et de la morphologie

La distribution granulométrique des nanoparticules combinées a été évaluée par Malvern Zetasizer Nano ZS90 avec un laser He-Ne (633 nm). Tous les échantillons ont été dilués avec de l'eau distillée et les expériences ont été réalisées à 24 °C en triple. La morphologie de la nanoparticule a été évaluée au microscope électronique à transmission (MET; JEOL JEM200CX à 120 kV). Les particules diluées ont été colorées avec de l'acide phosphotungstique à 2%, séchées et observées sous MET.

Libération de médicaments in vitro de nanoformulations chargées de médicaments

La libération de médicaments encapsulés a été évaluée par la méthode de dialyse. Deux millilitres de nanoparticules chargées de médicament contenant un équivalent de 1 mg d'ATRA et 1 mg de DBZ ont été scellés dans une membrane de dialyse (Spectra/Por, MWCO 3,5 kDa). Le tube de dialyse a été placé dans 25 ml de tampon de libération et maintenu à une rotation de 100 tr/min à 37°C. À un intervalle de temps prédéterminé jusqu'à 72 h, 1 ml d'échantillons a été prélevé et remplacé par du tampon frais de quantité égale. La quantité de DBZ et d'ATRA a été évaluée par la méthode HPLC comme décrit ci-dessus.

Culture cellulaire et analyse de l'absorption cellulaire

Des cellules de mélanome cutané murin (B16F10) ont été achetées auprès de China Infrastructure of Cell Line Resources (Beijing, Chine). Les cellules ont été cultivées en milieu RPMI-1640 additionné de 10% de FBS et 1% du mélange antibiotique. Les milieux ont été régulièrement changés tous les 2 jours et cultivés après 90 % de confluence. Pour l'analyse de l'absorption cellulaire, les cellules B16F10 ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits pour une incubation de 24 h. Les nanoparticules ont été chargées avec de la Coumarine-6 ​​en tant que tracker fluorescent. L'ancien milieu a été retiré et remplacé par un milieu frais contenant les nanoparticules de coumarine-6-lipide et incubé pendant 1 à 3 h dans l'ordre inverse. Les cellules ont été lavées et grattées avec un grattoir à cellules. Les cellules ont été centrifugées à 1200 rpm pendant 5 min et le culot cellulaire a été remis en suspension dans 1 ml de PBS froid. Les échantillons ont été évalués par cytomètre en flux AccuriTM C6 (BD Co., USA).

Test de cytotoxicité in vitro

L'effet cytotoxique de l'ATRA libre, du DBZ, du D-LNF et du RD-LNF sur les cellules B16F10 a été évalué par le test MTT. Les cellules (1 × 10 ⁴ ) ont été ensemencés dans chaque puits de la plaque 96 puits et incubés pendant 24 h. Les cellules ont d'abord été traitées avec différentes concentrations d'ATRA et de DBZ libres et ont testé son effet anticancéreux sur les cellules de mélanome. Ensuite, les cellules ont été traitées avec une concentration fixe d'ATRA libre, DBZ, D-LNF et RD-LNF à 25 ug/ml et 50 ug/ml, respectivement. Les cellules ont été incubées pendant 24 h puis le milieu a été soigneusement retiré et lavé deux fois avec du PBS. A la fin, les cellules ont été traitées avec 100 µl de solution de MTT à 5 mg/ml et incubées pendant 4 h. Le milieu de culture a été soigneusement retiré et 100 µl d'isopropanol ont été ajoutés et incubés pendant 15 min sous agitation. Les cristaux de formazan dissous ont été étudiés à 570 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques. Des cellules non traitées ont été utilisées comme témoins et les calculs ont été effectués sur la base de la viabilité cellulaire des témoins.

Test d'apoptose – Cytomètre en flux

L'effet d'apoptose de l'ATRA libre, du DBZ, du D-LNF et du RD-LNF dans les cellules B16F10 a été évalué après la coloration avec l'annexine PE V et le kit d'apoptose à base de 7AAD. Les cellules ont été ensemencées dans une plaque de 12 puits à une densité cellulaire de 2 × 10 ⁵ cellules/puits et incubés pendant 24 h. Les cellules ont été traitées avec des équivalents de 25 ug/ml de formulations libres d'ATRA, DBZ, D-LNF et RD-LNF et les cellules non traitées ont été considérées comme témoins. Après 24 h d'exposition au traitement, les cellules ont été colorées selon le protocole du fabricant. Le cytomètre en flux AccuriTM C6 a été utilisé pour l'expression de PE et 7AAD et un minimum de 10 000 événements ont été acquis dans le cytomètre en flux. Les cellules PE-positives et 7AAD-négatives étaient précocement apoptotiques ; Les cellules PE-positives et 7AAD-positives étaient apoptotiques tardivement.

Analyse du cycle cellulaire—Cytomètre en flux

Les cellules ont été ensemencées dans une plaque de 12 puits à une densité cellulaire de 2 × 10 ⁵ cellules/puits et incubés pendant 24 h. Les cellules ont été traitées avec des équivalents de 25 ug/ml de formulations libres d'ATRA, DBZ, D-LNF et RD-LNF et les cellules non traitées ont été considérées comme témoins. Après 24 h, les cellules traitées ont été lavées et collectées par trypsinisation et fixées avec de l'éthanol à 70 % pendant 2 h à 4 °C. Les cellules ont ensuite été traitées avec de la ribonucléase pour se débarrasser de toute contamination par l'ARN. Maintenant, les cellules ont été colorées avec de l'iodure de propidium (PI) pendant 30 min à 37°C dans l'incubateur. La fluorescence des cellules colorées au PI a été déterminée par le cytomètre en flux AccuriTM C6. La phase du cycle cellulaire a été divisée en phases subG1, G1, S et G2/M.

Test de formation de colonie

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 12 puits à une densité cellulaire de 2 × 10 ⁵ cellules/puits et incubés pendant 24 h. Les cellules ont été traitées avec des équivalents de 25 ug/ml de formulations libres d'ATRA, DBZ, D-LNF et RD-LNF. Les cellules traitées ont été trypsinisées, lavées et comptées à l'aide d'un compteur de cellules. Les cellules ont ensuite été ensemencées dans une plaque 6 puits à une densité de 1500 cellules/puits. Les cellules ont ensuite été incubées dans des conditions ambiantes de 37°C pendant 12 jours jusqu'à ce que les colonies soient visibles. Les cellules ont été lavées avec du PBS et fixées avec du méthanol à de l'acide acétique dans de l'eau (1:1:8) pendant 10 min, suivi d'une coloration avec un colorant cristal violet à 0,1 % pendant 45 min. Les cellules colorées ont ensuite été observées au microscope optique.

Test de migration cellulaire

Une chambre transwell à douze puits avec une taille de pores de 8 um a été utilisée pour cet essai. Pour lancer l'étude, 5 × 10 ⁴ cellules/puits a été ensemencé dans la chambre supérieure. Le milieu supérieur est dépourvu de FBS tandis que le milieu de la chambre inférieure est constitué de 10 % de FBS. Après 24 h, la quantité de cellules ayant migré vers la surface inférieure de la membrane a été fixée et colorée avec un colorant violet cristal à 0,5 %. Le nombre de cellules a été compté dans cinq champs choisis au hasard sous un microscope optique; le nombre moyen de cellules a été enregistré et analysé.

Analyse statistique

Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD et réalisées en triple, sauf mention contraire. Deux groupes ont été comparés en utilisant des t non appariés tests, tandis que la comparaison de plus de deux groupes a été effectuée à l'aide de l'ANOVA à un facteur avec le test de comparaison multiple de la Turquie. Les statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel GraphPad Prism et une différence de p <0,05 a été considéré comme significatif.

Résultats et discussion

Préparation et caractérisation de nanoformulations lipidiques chargées de DBZ/ATRA

Le traitement du mélanome reste un défi majeur et les options de traitement standard comprenant la chimiothérapie ou la radiothérapie ou la résection chirurgicale ne seront efficaces que sur les tumeurs solides en vrac accompagnées de mauvais pronostic. La FDA a approuvé des médicaments tels que le paclitaxel ou sa combinaison, mais il n'a pas réussi à améliorer l'impact global sur la survie des patients et la guérison du cancer. Dacarbazine (DBZ) est le premier choix de médicament chimiothérapeutique approuvé par la FDA; cependant, DBZ souffre de mauvaises propriétés physico-chimiques et a entraîné un taux de réponse décevant entre 10 et 25 %. Pour faire face à ces défis, nous avons développé une nouvelle stratégie thérapeutique de combinaison avec ATRA et DBZ dans des nanoformulations lipidiques (Fig. 1). Nous avons émis l'hypothèse que la combinaison de deux composants thérapeutiques améliorerait l'efficacité antitumorale dans les mélanomes malins. Il convient de noter que l'ATRA, bien que présentant des propriétés anticancéreuses, n'a entraîné aucun effet indésirable dans l'environnement systémique [23]. Comme la DBZ est de nature hydrophobe, nous avons conçu des nanoformulations lipidiques qui peuvent incorporer de manière stable les médicaments hydrophobes dans le noyau lipidique et l'ATRA sera chargée en tant que composant structurel des nanoparticules. Les nanoparticules lipidiques transportant les composants thérapeutiques contribueront à l'administration dans la tumeur la plus profonde du corps. L'efficacité de chargement de DBZ et ATRA était de 91,2 ± 1,25 % et 95,8 ± 1,14 % respectivement. La capacité de charge du DBZ et de l'ATRA dans le RD-LNF était de 7,07 ± 0,65% w/w et de 7,48 ± 1,05% w/w, respectivement. La taille des particules de D-LNF était de 121,5 ± 1,65 nm avec un indice de polydispersité (PDI) de 0,134 et un potentiel zêta de -23,5 ± 0,85 mV. La taille des particules de RD-LNF était de 138,2 ± 1,28 nm avec un PDI de 0,159 et un potentiel zêta de -25,4 ± 0,58 mV. L'augmentation de la taille globale des particules a été principalement attribuée à la charge structurelle d'ATRA; cependant, la taille finale du RD-LNF était inférieure à 150 nm permettant une accumulation préférentielle des mélanomes malins grâce à l'effet EPR. En outre, la présence de PEG hydrophile empêchera l'agrégation des particules et réduira son absorption par le système réticulo-endothélial (RES) et améliorera ainsi ses performances systémiques dans le corps. La charge de surface autour de – 25 mV conférera une excellente stabilité au stockage. La morphologie des particules a été étudiée au microscope électronique à transmission (MET) (Fig. 2). Comme on le voit, le D-LNF et le RD-LNF sont de taille parfaitement sphérique et répartis uniformément dans la grille de cuivre. La différence de taille entre D-LNF et RD-LNF était cohérente avec l'observation DLS. L'absence de débris de particules, de petites particules et d'agrégation indique le succès du processus de formulation.

Structure de la dacarbazine (DBZ) et de l'acide tout-trans rétinoïque (ATRA). Une illustration schématique de nanoformulations lipidiques chargées de DBZ/ATRA est présentée. La nanoformulation lipidique a été préparée par la méthode des ultrasons. Le DBZ et l'ATRA sont des molécules hydrophobes avec un poids moléculaire inférieur à 300 g/mol. Les molécules hydrophobes devraient se concentrer au cœur des nanoparticules stabilisées par un tensioactif

Analyse morphologique du D-LNF et du RD-LNF par microscopie électronique à transmission. Une image représentative illustrant la morphologie précise est présentée

Analyse de stabilité et libération de médicament in vitro à partir du D-LNF et du RD-LNF

Le RD-LNF a présenté une excellente stabilité à la fois dans des conditions de pH 7,4 (PBS) et de sérum (10 % de FBS) (Fig. 3a). La taille des particules n'a montré aucune augmentation significative dans les deux conditions tout au long de la période d'étude, indiquant la stabilité des nanoparticules. La capacité de libération du médicament en temps opportun décide de l'efficacité des systèmes de nanoparticules chargés de médicament. Nous avons effectué la cinétique de libération de DBZ et ATRA à partir de D-LNF et RD-LNF dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4). Comme le montre la figure 3b, aucune libération en rafale ou libération progressive de médicament n'a été observée à partir de l'un ou l'autre des systèmes à deux nanoparticules, ce qui indique le chargement stable au cœur des nanoparticules et non à la surface des nanoparticules. Aucune différence significative dans la libération de DBZ n'a été observée entre le D-LNF et le RD-LNF, ce qui indique que la présence d'ATRA n'a pas ralenti ou modifié le schéma de libération du médicament. Un léger retard dans la libération de DBZ de RD-LNF pourrait être attribué à la longueur de chemin accrue attribuée à l'ATRA dans la structure lipidique. Il est intéressant de noter que l'ATRA a libéré significativement plus lentement par rapport à celui de DBZ dans le système porteur RD-LNF. Des différences significatives ont commencé à apparaître après 24 h jusqu'à 72 h principalement attribuées à la nature extrêmement hydrophobe de l'ATRA et faisant partie de la composante structurelle. Dans l'ensemble, l'absence de libération en rafale et de libération contrôlée de composants thérapeutiques profitera au traitement du cancer du mélanome.

un Analyse de stabilité du RD-LNF dans des conditions de pH 7,4 et de sérum (10 % FBS). b Libération de médicament in vitro de DBZ à partir de D-LNF ; et libération de médicament in vitro de DBZ et d'ATRA à partir de RD-LNF. L'étude de libération a été réalisée dans une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4) pendant une période d'étude de 72 h. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écarts types (n =4)

Captation cellulaire in vitro

Une absorption cellulaire plus élevée ou améliorée de la nanoparticule détermine l'efficacité thérapeutique dans les cellules cancéreuses. Nous avons effectué l'absorption cellulaire de RD-LNF dans des cellules cancéreuses B16F10 et la Coumarine-6 ​​a été utilisée comme tracker fluorescent. Comme le montre la figure 4, une internalisation remarquable des nanoparticules a été observée après 1 h d'incubation des nanoparticules et l'absorption a augmenté de manière constante jusqu'à 3 h. L'absorption remarquable des nanoformulations lipidiques est cohérente avec l'absorption cellulaire plus élevée du système porteur à base de lipides. Il a été supposé que la diffusion passive et le mécanisme basé sur l'endocytose pourraient être responsables de l'absorption cellulaire plus élevée. Les nanoparticules après l'endocytose atteindront le lysosome où les médicaments encapsulés sont libérés et présentent leurs actions pharmacologiques respectives.

Analyse de l'absorption cellulaire in vitro des cellules de mélanome B16F10. Les cellules cancéreuses ont été traitées avec du RD-LNF et les temps d'incubation ont varié de 1 h à 3 h et l'absorption cellulaire a été analysée à l'aide d'un cytomètre en flux. Le Coumarin-6 a été utilisé comme un tracker fluorescent

Dosage de cytotoxicité in vitro

Le test MTT a été réalisé sur des cellules B16F10 après traitement avec les formulations respectives pour évaluer l'effet anticancéreux d'agents thérapeutiques individuels (Fig. 5a). Dans un premier temps, la cytotoxicité des DBZ et ATRA libres individuels a été évaluée. Le DBZ a présenté un effet cytotoxique dépendant de la concentration dans les cellules cancéreuses du mélanome, tandis que l'ATRA a présenté un effet cytotoxique significativement plus élevé dans les cellules B16F10. À 100 g/ml, DBZ a présenté une viabilité cellulaire d'environ 45 % par rapport à une viabilité cellulaire d'environ 22 % pour l'ATRA, ce qui indique l'excellente efficacité thérapeutique de l'ATRA. Afin de prouver que la co-administration de DBZ et d'ATRA pouvait potentiellement inhiber la progression du cancer, des nanoformulations lipidiques chargées de DBZ + ATRA (RD-LNF) ont été traitées sur des cellules de mélanome. Des nanoformulations lipidiques chargées en DBZ (D-LNF) contenant le médicament à entité unique ont été utilisées comme groupe de référence pour mettre en évidence l'efficacité synergique de l'ATRA (Fig. 5b). Comme prévu, à 25 g/ml de concentration fixe, l'ATRA a montré une viabilité cellulaire légèrement inférieure à celle du DBZ tandis que le D-LNF à base de nanoparticules n'a pas amélioré l'effet anticancéreux du DBZ et est resté loin d'être efficace. Comme prévu, le RD-LNF a montré une viabilité cellulaire significativement plus faible et un effet anticancéreux plus élevé que celui du D-LNF, indiquant un effet thérapeutique synergique apparent des composants doubles vers la mort des cellules cancéreuses du mélanome. Le RD-LNF a montré un effet anticancéreux significativement plus élevé que celui de tout autre groupe de traitement. On pourrait s'attendre à ce qu'une libération lente et prolongée de DBZ ainsi que la libération lente d'ATRA à partir du système nanoporteur puissent contribuer à l'effet thérapeutique synergique. Dans cette étude, la dacarbazine (DBZ) était le principal médicament chimiothérapeutique et l'ATRA était utilisé comme composant structurel des nanoparticules lipidiques, n'a donc pas créé de groupe distinct pour le R-LNF. Nous avons étudié l'effet anticancéreux de l'ATRA nu et de la DBZ dans les cellules cancéreuses. En outre, de nombreux rapports publiés sont la preuve de l'effet anticancéreux de l'ATRA; par conséquent, nous avons utilisé l'ATRA comme composant structurel qui pourrait également améliorer l'efficacité anticancéreuse des thérapies encapsulées de manière synergique.

un Test de cytotoxicité in vitro de DBZ et ATRA libres d'une manière dépendante de la concentration. b Cytotoxicité in vitro des ATRA libres, DBZ, D-LNF et RD-LNF à une concentration fixe de 25 g/ml et 50 g/ml

Test de formation de colonie

Le test de formation de colonies a été réalisé afin d'évaluer le potentiel de tumorigenèse des cellules de mélanome. Comme indiqué, la DBZ et l'ATRA libres ont un rôle limité dans l'inhibition de la formation de colonies et, de même, le D-LNF était inefficace pour contrôler la formation de colonies (Fig. 6). Comme prévu, la combinaison de DBZ + ATRA a entraîné une potentialisation significative de l'inhibition de la formation de colonies par rapport à celle de médicaments libres individuels ou de nanoparticules chargées de médicament. Le test de formulation de colonies réitère en outre l'efficacité anticancéreuse supérieure du RD-LNF par rapport aux médicaments libres.

Effet de l'ATRA libre, du DBZ, du D-LNF et du RD-LNF sur la formation des colonies. Les cellules B16F10 ont été traitées avec les formulations respectives et la formation des colonies a été photographiée après coloration au cristal violet

Test d'apoptose in vitro et analyse du cycle cellulaire

L'induction de l'apoptose des cellules B16F10 après traitement avec le D-LNF et le RD-LNF a été étudiée à l'aide d'un cytomètre en flux après coloration des cellules avec le mélange Annexine V-FITC/PI (Fig. 7a). Comme indiqué, l'ATRA et le DBZ n'ont causé que 10 à 12 % de l'apoptose des cellules cancéreuses et la plupart des cellules restent intactes. Une légère augmentation des cellules apoptotiques précoces a été observée après le traitement par D-LNF pourrait suggérer l'effet du transporteur de livraison. Il est important de noter que le RD-LNF a induit une plus grande proportion de cellules en apoptose avec une plus grande proportion de cellules en apoptose tardive et en apoptose précoce, indiquant l'efficacité anticancéreuse supérieure des nanoparticules combinatoires. Le RD-LNF a montré que les cellules en apoptose tardive augmentaient de 21,5% tandis que les cellules en apoptose précoce augmentaient jusqu'à 18,3% et la proportion de cellules viables diminuait de 95 à 52%, respectivement, suggérant que la combinaison DBZ + ATRA contribuait à l'apoptose des cellules cancéreuses et pouvait inhiber l'inhibition proliférative des cellules de mélanome B16F10. L'effet d'apoptose des formulations a été en outre confirmé par l'analyse du cycle cellulaire. Comme indiqué, DBZ et ATRA ont présenté une légère augmentation de la population sous-G0 tandis que D-LNF a montré une population sous-G0 relativement plus élevée que celle des médicaments libres individuels (Fig. 7b). Notamment, une augmentation remarquable de la population sous-G0 a été observée pour les cellules de mélanome traitées par RD-LNF, indiquant l'apoptose marquée des cellules cancéreuses. Il est bien connu que DBZ pourrait augmenter les niveaux d'expression de p21, de caspase-3 et de PARP clivée et ainsi favoriser l'apoptose cellulaire par la stabilisation de p53. L'induction de p53 inhibera la progression du cycle cellulaire [24, 25]. L'association DBZ + ATRA devrait potentialiser le mécanisme d'apoptose et arrêter la progression du cycle cellulaire des cellules cancéreuses et présenter l'efficacité anticancéreuse.

un Illustration de l'apoptose des cellules B16F10 après traitement par ATRA, DBZ, D-LNF et RD-LNF libres. Les cellules non traitées ont été considérées comme un contrôle approprié. L'apoptose a été analysée à l'aide d'un cytomètre en flux. b Illustrations de l'analyse du cycle cellulaire réalisée dans des cellules B16F10 après traitement avec les formulations respectives

Effet des nanoparticules combinatoires sur la migration cellulaire

La migration cellulaire a été analysée à travers la membrane transwell et observée les cellules migrantes par coloration au cristal violet (Fig. 8). Après 24h, les cellules témoins avaient presque atteint la migration complète des cellules cancéreuses. L'ATRA semble inhiber la migration cellulaire relativement mieux que les cellules traitées par DBZ. Le D-LNF a également montré un effet inhibiteur notable sur la migration cellulaire; cependant, l'effet de migration cellulaire le plus remarquable a été observé dans les cellules de mélanome B10F16 traitées par RD-LNF. Comme on le voit, une diminution de la migration cellulaire a été observée par rapport à celle des cellules témoins non traitées. Ces résultats démontrent clairement que le RD-LNF diminue potentiellement la prolifération cellulaire maligne aberrante et supprime efficacement la migration cellulaire.

Microphotographies représentatives du test de migration cellulaire des cellules B16F10 après traitement avec ATRA, DBZ, D-LNF et RD-LNF libres et sa quantification

Disponibilité des données et des matériaux

Non applicable

Abréviations

DBZ :

Dacarbazine

ATRA :

Acide rétinoïque tout-trans

D-LNF :

Nanoformulations lipidiques chargées en DBZ

RD-LNF :

Nanoformulations lipidiques chargées en ATRA/DBZ

SLN :

Nanoparticules lipidiques solides