Nanodétection du cancer de la tête et du cou sur une surface de détection d'oxyde de titane

Introduction

Le cancer de la tête et du cou montre une croissance cellulaire anormale dans la région de la tête et du cou et est largement rapporté. Il provient de la gorge, de la bouche, des muqueuses, des épithéliums de la cavité buccale, des glandes salivaires et des fosses nasales [1]; est le sixième cancer le plus fréquemment signalé dans le monde ; et touche plus de 644 000 personnes chaque année [2]. La plupart des patients atteints sont diagnostiqués à des stades avancés et affectent fortement leur survie. L'identification à un stade précoce du cancer de la tête et du cou est obligatoire pour améliorer la survie et le mode de vie. Les marqueurs sérologiques tumoraux ont été utilisés pour diagnostiquer et gérer le traitement de suivi du cancer de la tête et du cou. La cellule squameuse libère un antigène de carcinome épidermoïde prédominant (SCC-Ag), sa présence est élevée chez les patients cancéreux et SCC-Ag s'est avéré être un marqueur tumoral prometteur avec les cancers liés aux cellules squameuses tels que les cancers gynécologiques, pulmonaires, œsophagiens et anaux [3, 4]. En ce qui concerne le cancer de la tête et du cou, des niveaux plus élevés de SCC-Ag ont été associés à des métastases, à une récidive et à une mortalité de la maladie, comme l'attestent différentes études menées auprès de patients cancéreux [5,6,7]. Les chercheurs ont découvert que l'Ag-SCC sérique présentait un niveau de risque significatif pour les cancers de l'hypopharynx, de la cavité buccale et du larynx [8, 9]. De plus, il y avait une corrélation entre le niveau d'Ag-SCC et le volume tumoral chez les patients atteints d'un cancer de la tête et du cou [10]. Il est sage de quantifier le niveau de SCC-Ag pour identifier l'état du cancer de la tête et du cou, afin de fournir un traitement plus précoce. La recherche actuelle s'est concentrée sur la détection de SCC-Ag à son niveau inférieur en utilisant le capteur de nanoparticule sur électrode interdigitée (IDE) par l'anticorps SCC-Ag.

L'IDE est un biocapteur électrochimique doté de caractéristiques prometteuses telles qu'un faible coût, portable et sensible, qui permet un large éventail d'applications, en particulier pour la surveillance environnementale et le diagnostic médical [11, 12]. L'amélioration de la propriété électrique sur la surface de détection améliore la détection des biomolécules. L'application des nanomatériaux a été largement utilisée dans le biocapteur pour améliorer la détection biomoléculaire sur les surfaces de détection. Les nanomatériaux sont de plus petite taille, ont une plus grande surface, ont une bonne conductivité thermique et électrique, sont compatibles avec les biomolécules et montrent une énorme capacité à être appliqués dans le domaine des biocapteurs [13, 14]. Le nanomatériau a été appliqué de deux manières différentes à des fins :l'une est la fonctionnalisation de surface et l'autre est la conjugaison de l'analyte ou de la cible afin d'améliorer la détection [15]. L'or est l'un des nanomatériaux bien établis et appliqué dans divers capteurs, notamment la résonance plasmonique de surface, le capteur en mode guide d'ondes, le capteur électrochimique et la colorimétrie [16,17,18]. En dehors de cela, les nanomatériaux d'argent, de graphène, de cuivre et de titane ont également été appliqués dans diverses applications biomédicales. En tant que semi-conducteur respectueux de l'environnement et à faible coût, l'oxyde de titane (TiO₂ ) a une large bande interdite utilisée ici pour la modification de surface sur IDE afin de détecter SCC-Ag. En raison des propriétés électriques et optiques élevées du TiO₂ , il est largement utilisé à des fins de super-capacité, de conversions photocatalytiques et photoélectriques [19,20,21,22,23]. De plus, sa nature d'hydrophilie et sa plus grande surface spécifique conviennent à la modification de surface et aident à détecter les biomolécules à un niveau inférieur. Dans cette recherche, TiO₂ a été enduit sur la surface de détection IDE pour améliorer le flux électrique lorsque l'interaction des biomolécules se produit. Pour améliorer la détection de SCC-Ag, un anticorps a été conjugué à du gold nanostar (anticorps GNS) et immobilisé sur TiO₂ -surface enduite. Puisqu'il a été prouvé que les biomolécules conjuguées à des nanomatériaux d'or présentent une stabilité plus élevée et fournissent les biomolécules immobilisées en surface correctement orientées, il a la capacité d'améliorer la limite de détection [24, 25]. De plus, davantage de biomolécules peuvent être immobilisées sur une seule particule d'or, ce qui conduit à attirer les niveaux élevés de la molécule cible. Dans ce travail, deux nanomatériaux différents, à savoir TiO₂ (pour la modification de surface) et GNS (pour la conjugaison d'anticorps), ont été utilisés pour améliorer la détection de SCC-Ag sur la surface de détection IDE. L'application du GNS devrait améliorer les performances du capteur de courant grâce à sa plus grande surface pour capturer le plus grand nombre d'anticorps.

Matériaux et méthodes

Réactifs et biomolécules

L'antigène SCC (une glycoprotéine avec des isoformes allant de 45 à 55 kDa) a été acheté auprès de Randox Life Sciences (Malaisie). L'anticorps anti-SCC a été obtenu auprès de Next Gene (Malaisie). (3-aminopropyl)triéthoxysilane (APTES), éthanolamine, albumine (une protéine sanguine majeure à 45 mg/mL ; 50 à 70 % des protéines sanguines avec un poids moléculaire de 66,5 kDa), solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; pH 7,4) et l'isopropoxyde de titane IV provenaient de Sigma Aldrich (USA). La serpine (une inhibition de la sérine protéase couramment distribuée avec un poids moléculaire de 40 à 50 kDa) provenait de Sino Biological (Chine). La nanostar d'or a été synthétisée comme décrit par Shan et al. [26]. Tous les réactifs et produits chimiques obtenus ont été stockés dans les conditions recommandées par le fabricant.

Fabrication d'électrodes interdigitées

La conception de base et la fabrication de l'IDE ont été suivies comme indiqué précédemment [27]. Initialement, la plaquette de silicium a été nettoyée par les solutions de nettoyage standard, et l'électrode IDE en aluminium a été déposée par la méthode traditionnelle de gravure humide sur la plaquette de silicium. Ensuite, la résine photosensible positive a été déposée sur la surface de la plaquette de silicium, suivie d'une oxydation thermique. Le dépôt d'aluminium a été réalisé par la technique de photolithographie. Trois étapes ont été impliquées, dans lesquelles l'étape 1 était à 1200 rpm pendant 10 s, puis l'étape 2 était à 3500 rpm pendant 20 s, suivie de 500 rpm pendant 10 s. Et puis, la lumière ultraviolette (UV) a été exposée sur la surface de détection pour transférer le motif de l'IDE sur la surface de l'échantillon. Après cela, le développeur RD-6 a été utilisé pendant 15 secondes pour effectuer le processus de développement. Une photorésistance a été réalisée pour éliminer les régions non exposées. L'échantillon développé a été cuit à 100°C pour éliminer l'humidité inutile et améliorer l'adhérence entre le SiO₂ couche et l'aluminium. Enfin, en utilisant 23 s d'agent de gravure d'aluminium, la zone non exposée a été retirée et nettoyée à l'acétone. La surface finale a été modifiée par TiO₂ pour détecter SCC-Ag. La surface IDE fabriquée a été observée sous microscopie à haute puissance et nanoprofiler 3D. Les images ont été capturées à l'aide du système associé à un grossissement × 50.

Revêtement de TiO₂ sur la surface de détection IDE

Sur la surface IDE fabriquée, TiO₂ solution a été enduite et de l'isopropoxyde de titane IV a été utilisé comme précurseur pour préparer la solution de TiO₂ . Pour cela, de l'éthanol a été mélangé avec de l'isopropoxyde de titane IV et vigoureusement agité pendant 5 min. Ensuite, le stabilisant (100 μL d'acide acétique) a été déposé sous agitation puis chauffé sur une plaque chauffante à une température de 85 °C. Le mélange de rapport molaire a été fixé à 9:1:0,1 (éthanol à TIP à acide acétique). Après 3 h de mélange, une solution limpide a été obtenue. Après 24 h de processus de vieillissement, la solution a été déposée sur du dioxyde de silicium (SiO₂ ) substrats en utilisant la tournette à une vitesse de 2000 tr/min. Après revêtement, la surface a été séchée pendant 15 min à une température de 175 °C et recuite pendant 1 h à 450 °C. Le TiO₂ le film mince obtient une épaisseur suffisante après avoir enduit trois couches.

Préparation d'Anti-SCC-Ag conjugué GNS

L'anticorps SCC-Ag a été immobilisé sur GNS en utilisant le linker acide 16-mercaptoundécanoïque (16-MDA). Initialement, 5 mM de 16-MDA dilué ont été mélangés avec 100 μL de GNS et maintenus à température ambiante (RT) pendant 30 min. Le 16-MDA lié avec le GNS a été éliminé par centrifugation à 13 000 ×g , 5 min. Ensuite, la pastille d'or collectée a été activée par EDC (400 mM) et NHS (50 mM) avec un rapport de 1:1 en incubant pendant 15  min à température ambiante. L'EDC et le NHS non liés du mélange de solution ont été éliminés par centrifugation à 13 000 ×g , 5 min. Le culot contenant le GNS activé a été collecté pour conjuguer l'anticorps. Ensuite, 200 nM d'anticorps SCC-Ag ont été mélangés avec du GNS activé par EDC-NHS et maintenus à température ambiante pendant 1 h. Enfin, les anticorps non liés ont été éliminés par centrifugation à 13 000 ×g , 5 min. L'anticorps conjugué avec le GNS a été maintenu à 4°C pour une utilisation ultérieure, et la conjugaison a été confirmée par le balayage par spectroscopie UV-Vis. Le balayage a été effectué dans la région entre 480 et 560 nM, et les pics maximaux ont été trouvés.

Immobilisation sur Anticorps GNS sur TiO₂ -Surface IDE

Le TiO₂ La surface IDE revêtue a été en outre modifiée en amine par APTES pour immobiliser l'anticorps GNS. APTES avec 3% (dilué dans 30% d'éthanol) a été déposé sur TiO₂ surface et conservé pendant 3 h à TA. La surface a été lavée trois fois avec de l'éthanol à 30 % pour éliminer l'APTES non lié. Pour immobiliser l'anticorps, l'étape d'activation a été suivie comme mentionné ci-dessus. L'anticorps ou l'anticorps GNS a été déposé sur les surfaces et a attendu 1hh pour terminer le processus d'immobilisation. Enfin, la surface a été lavée cinq fois par du tampon PBS pour éliminer complètement les anticorps non liés. Ces surfaces modifiées par anticorps ou anticorps GNS ont été utilisées pour détecter le SCC-Ag et comparées. Le TiO₂ immobilisé par anticorps GNS surface a été analysée par microscopie à force atomique (AFM), microscopie électronique à transmission par émission de champ (FETEM) et analyseur à rayons X à dispersion d'énergie (EDX) comme décrit précédemment [15]. Les observations AFM étaient à l'échelle de 5 m, tandis que SEM était à l'échelle de 100  nM exploité avec 15 kV. La présence des éléments a été trouvée par EDX.

Détection de l'antigène SCC sur les surfaces d'anticorps/anticorps Nanostar Gold

Pour détecter SCC-Ag, anticorps ou TiO₂ modifié par anticorps nanostar d'or -Les surfaces IDE ont été bloquées par 1 M d'éthanolamine pour masquer les surfaces sans anticorps et maintenues pendant 30 min à température ambiante. Sur la surface bloquée à l'éthanolamine, 1 nM de SCC-Ag ont interagi et les réponses actuelles ont été remarquées avant et après l'ajout de SCC-Ag. Pour évaluer la limite de détection, SCC-Ag a été titré de 10 fM à 1  nM et déposé individuellement sur l'anticorps ou les surfaces modifiées par l'anticorps GNS et les réponses avec le courant ont été notées. Les expériences ont été réalisées en triple et ont calculé les statistiques. Une tension de balayage linéaire de 0 à 2 µV à une tension de pas de 0,01 µV a été suivie pour les mesures. La limite de détection (LOD) a été considérée comme la concentration la plus faible d'un analyte (à partir de la ligne d'étalonnage à de faibles concentrations) par rapport au signal de fond (S /N = 3:1), en d'autres termes, LOD = écart-type de la ligne de base + 3σ .

Détection sélective de SCC-Ag

Pour vérifier l'interaction sélective de SCC-Ag avec son anticorps, des expériences de contrôle ont été réalisées avec deux protéines différentes, à savoir, la serpine et l'albumine. Une concentration de 1 nM de ces protéines de contrôle a été déposée sur des surfaces d'anticorps ou d'anticorps GNS modifiés, et les changements de courant ont été remarqués avant et après l'interaction. Ces niveaux actuels ont été comparés à la détection spécifique de SCC-Ag par son anticorps et son anticorps GNS. D'autres configurations expérimentales de contrôle incluent l'interaction de SCC-Ag avec GNS seul et SCC-Ag avec TiO₂ -Surface IDE recouverte de GNS marqué par des anticorps non immuns. Les expériences ont été réalisées en triple et ont calculé les statistiques. Une tension de balayage linéaire de 0 à 2  V à une tension de pas de 0,01  V a été suivie pour les mesures.

Résultats et discussion

Le cancer de la tête et du cou a été décrit lorsque différentes tumeurs se développent dans ou autour du nez, de la bouche, du larynx et des sinus [28]. Un diagnostic précoce et un traitement avec un biomarqueur approprié sont obligatoires pour améliorer le taux de survie des patients. SCC-Ag s'est avéré être un biomarqueur sérique approprié pour le cancer de la tête et du cou ; ici, les expériences ont été réalisées pour détecter et quantifier le niveau de SCC-Ag sur TiO₂ -un capteur à électrodes interdigitées (IDE) modifié par son anticorps. TiO₂ est utilisé ici pour améliorer la réponse en courant lors de l'interaction de biomolécules. Comparé à d'autres nanomatériaux, TiO₂ est considéré comme attractif dans le capteur électrochimique en raison de son comportement actif en surface le long des électrodes et de l'amélioration de l'activité électrocatalytique. De plus, il donne plus de stabilité à la surface, ce qui donne la répétabilité de la réponse par l'électrode et l'amélioration de la limite de détection en augmentant le courant de crête [29,30,31]. Pour utiliser cette caractéristique positive, dans cette recherche, enduit TiO₂ sur la surface IDE (IDE-TiO₂ ) améliore le flux de courant. Un autre nanomatériau GNS a été utilisé pour immobiliser l'anticorps anti-SCC-Ag sur l'IDE-TiO₂ surface et d'augmenter la limite de délétion. Puisqu'il a été prouvé que la surface immobilisée de biomolécule conjuguée à l'or améliore la détection de la cible [32, 33], ici, SCC-Ag a été détecté et comparé à l'anticorps et à l'anticorps GNS modifié IDE-TiO₂ superficies. Comme généralisé ailleurs, avec une augmentation de la surface de la nanoparticule, il y aura une amélioration de l'attachement biomoléculaire. Dans ce contexte, le GNS a une plus grande surface par rapport à la nanoparticule sphérique d'or. Pour mettre en œuvre cette idée, l'expérience actuelle a été réalisée en utilisant GNS pour améliorer la sensibilité.

Caractérisation de surface et immobilisation d'anticorps GNS

La figure 1 montre la représentation schématique de la détection de SCC-Ag sur IDE-TiO₂ surface de détection. Comme le montre la figure 1a, initialement, la surface de détection IDE était recouverte de TiO₂ puis l'anticorps a été immobilisé avec ou sans conjugaison GNS. Ces surfaces modifiées par des anticorps ont été utilisées pour détecter le niveau de SCC-Ag. Avant d'effectuer la détection, la conjugaison du GNS avec l'anticorps a été confirmée par spectroscopie UV-Vis. Les profils de balayage GNS avec la plage de longueurs d'onde souhaitée avant et après la conjugaison avec l'anticorps ont été déterminés. Il a été clairement observé qu'après immobilisation, le décalage a été déplacé de 535 à 545  nM (Fig. 1b). Ce résultat confirme la conjugaison des anticorps à la surface du GNS. D'autre part, la surface de détection fabriquée a été observée morphologiquement. La figure 2a affiche l'image de microscopie à haute puissance, tandis que la figure 2b décrit l'image capturée à partir de l'imagerie nanoprofiler 3D. Les deux profils d'imagerie sont clairement représentés avec des régions d'espace et d'électrode, qui forment les doigts. La disposition des espaces et des doigts semblait uniforme et intacte.

un Représentation schématique pour la détection de SCC-Ag. IDE-TiO₂ surface a été modifiée en amine par APTES suivi de l'immobilisation d'anticorps ou d'anticorps GNS. Le groupe amine d'APTES réagit avec le groupe carboxyle sur l'anticorps. SCC-Ag a été détecté par l'interaction au niveau de la région antigénique et comparé. b Mesures de spectroscopie UV-Vis avec GNS. Le balayage était dans la région entre 480 et 560 nM, et les pics maximaux étaient ~ 530  nM. Les GNS avec et sans anticorps sont indiqués par les flèches

un Image de microscopie haute puissance sur la surface IDE. Les images ont été capturées à × 50. b Image nanoprofiler 3D sur la surface IDE. Les images ont été capturées à × 50. Les régions d'électrode et d'espace sont affichées. Les interstices sont indiqués par des étoiles. Des dispositions uniformes indiquent la réussite de la fabrication. c Image de microscopie à force atomique. L'AFM affiche une discrimination claire entre TiO₂ et GNS par des points sombres et lumineux, respectivement. d Image de microscopie électronique à transmission à émission de champ. e Analyse par rayons X à dispersion d'énergie. A indiqué les éléments trouvés en surface

Comparaison sur TiO d'immobilisation d'anticorps et d'anticorps GNS₂ -Surfaces de détection IDE

SCC-Ag a été détecté sur TiO₂ -Surface IDE par des surfaces immobilisées par des anticorps ou des anticorps GNS. L'attachement du GNS sur TiO₂ la surface a été confirmée par les observations AFM, SEM et l'analyse EDX (Fig. 2c). Sous observation AFM, une nette discrimination a été remarquée entre TiO₂ et GNS par des points sombres et lumineux, respectivement. Ceci a été soutenu par les analyses SEM et EDX, dans lesquelles des pics d'or et de titane modérés ont été observés. Ces résultats mettent en évidence l'apparition de GNS sur le TiO₂ surface. La figure 3 montre les processus d'immobilisation de l'anticorps et de l'anticorps GNS sur l'IDE-TiO₂ modifié par une amine surfaces de détection. TiO₂ - la surface de détection IDE modifiée affiche le niveau actuel comme 4,65E-12 (Fig. 3a). Après avoir ajouté APTES, le niveau actuel a été augmenté à 5.37E-11 ; cet accroissement de courant indique que la surface a été modifiée en amine par APTES. Lorsque l'anticorps a été immobilisé, le niveau actuel est passé de 5,375E-11 à 1,05E-9. La différence dans le courant a été remarquée comme 1.04E-9 (Fig. 3a). Cette immobilisation est due à l'interaction chimique du groupe amine du groupe APTES et COOH dans l'anticorps [18]. Les changements de courant ont confirmé la liaison de l'anticorps sur la surface modifiée APTES. Après cela, la surface restante a été recouverte d'éthanolamine 1 M pour réduire l'effet d'encrassement biologique dû à la liaison non spécifique de biomolécules sur la surface de détection. De même, l'anticorps GNS a été immobilisé sur TiO₂ -IDE surface, et lorsque l'anticorps GNS a été immobilisé sur la surface modifiée APTES, le niveau de courant a été augmenté de 4,41E-12 à 1,23E-9 (Fig. 3b). Il a été clairement constaté que lorsque l'anticorps était immobilisé sur la surface du GNS, il présentait la réponse la plus élevée sur la surface modifiée par une amine. Cela pourrait être dû au plus grand nombre d'anticorps se liant à la surface d'un seul GNS et à la forte liaison de ce complexe sur la surface modifiée par une amine. Cette liaison est due au fait que le groupe amino terminal dans l'APTES déplace les groupes citrate sur le GNS et se fixe chimiquement sur la surface IDE modifiée par APTES [34]. Il est bien connu que la détection de biomolécules sur les surfaces de détection dépend principalement de deux facteurs, à savoir, l'affinité de liaison des molécules interactives et la bonne immobilisation de surface des molécules sur la surface de détection. Une immobilisation biomoléculaire plus élevée sur la surface de détection a considérablement amélioré la détection d'une cible à son niveau inférieur. Dans cette recherche, le GNS a été utilisé pour immobiliser l'anticorps anti-SCC-Ag sur IDE-TiO₂ surface afin d'améliorer les chances de liaison d'anticorps plus élevée, ce qui conduit à la détection efficace de SCC-Ag.

Processus d'immobilisation sur IDE-TiO₂ superficies. un Avec anticorps. b Avec anticorps GNS. Les modifications de surface ont été initiées par 3 % d'APTES, suivies d'une activation par EDC et NHS pour immobiliser l'anticorps; 1 M d'éthanolamine a été utilisé pour bloquer la région d'anticorps non attachée. Une tension de balayage linéaire de 0 à 2 µV à une tension de pas de 0,01 µV a été suivie pour les mesures. Les changements appropriés de courant après chaque immobilisation ont confirmé la liaison de l'anticorps et de l'anticorps GNS sur les surfaces de détection

Détection comparative de SCC-Ag sur IDE-TiO₂ Surface par anticorps ou anticorps GNS

Puisque l'anticorps GNS montre l'immobilisation efficace sur IDE-TiO₂ surface, la concentration similaire de 1 nM de SCC-Ag a été détectée à la fois sur les surfaces des anticorps et des anticorps GNS et a comparé les changements du niveau actuel. La figure 4a montre 1 nM de détection de SCC-Ag sur une surface modifiée par un anticorps. Avant d'effectuer la détection, la surface modifiée par l'anticorps a été recouverte par l'agent bloquant éthanolamine pour éviter la liaison non spécifique des biomolécules. L'éthanolamine montre le changement actuel comme 4.65E-12. Après avoir ajouté 1 nM de SCC-Ag, le niveau actuel a été augmenté à 1,33E-09. Ces changements actuels indiquaient clairement la liaison de SCC-Ag à son anticorps. Dans le cas de la surface d'anticorps GNS, l'éthanolamine indique le niveau actuel comme 1,33E-11 ; après avoir ajouté 1 nM de SCC-Ag, il a été augmenté à 1,62E-09 (Fig. 4b). Les changements actuels avec l'anticorps GNS étaient plus élevés par rapport à la seule surface modifiée par l'anticorps pour une concentration similaire de SCC-Ag. Cela pourrait être dû au nombre plus élevé d'anticorps liés dans IDE-TiO₂ surface via GNS.

Détection SCC-Ag avec a anticorps et b Anticorps GNS. Testé sur IDE-TiO₂ surfaces avec les étapes ci-dessus jusqu'à 1 M de blocage de l'éthanolamine. Une tension de balayage linéaire de 0 à 2 µV à une tension de pas de 0,01 µV a été suivie pour les mesures. Après interaction de 1 nM de SCC-Ag, les niveaux de courant ont augmenté dans les deux cas; en même temps, il montre un changement de courant plus élevé avec l'anticorps GNS

Limite de détection de SCC-Ag sur IDE-TiO₂ Surface par anticorps ou anticorps GNS

Les surfaces modifiées par des anticorps ou des anticorps GNS montrent une détection claire de SCC-Ag, et la limite de détection a été estimée sur les deux surfaces à des fins de comparaison (Figure 5a, b). Pour cela, les concentrations de 10 fM à 1 nM de SCC-Ag ont été diluées et déposées sur ces surfaces individuellement et ont noté les changements de courant. La figure 5a montre les différentes concentrations de liaison SCC-Ag sur la surface modifiée par l'anticorps. Après l'éthanolamine, 10 fM de SCC-Ag ont interagi et aucun changement n'a été observé. Lorsque la concentration est augmentée à 100 fM, il y a eu un changement mineur dans le courant de 4,65E-12 à 6,54E-11. De plus, les concentrations ont été augmentées à 1 pM, 10 pM, 100 pM et 1 nM, et les niveaux actuels ont été augmentés à 4,69E-10, 7,91E-10, 8,78E-10 et 1,33E-09, respectivement. Ces résultats indiquent clairement qu'avec une augmentation des concentrations, la liaison augmente également. La limite de détection a été calculée sur la base de 3σ , et c'était à 100 fM (Fig. 6a).

Interactions dose-dépendantes avec a anticorps et b Anticorps GNS sur IDE-TiO₂ superficies. La surface est aux étapes ci-dessus jusqu'à 1µM de blocage éthanolamine. Une tension de balayage linéaire de 0 à 2 µV à une tension de pas de 0,01 µV a été suivie pour les mesures. Les concentrations de SCC-Ag de 10 fM à 10  nM ont interagi sur les deux surfaces, et les changements actuels ont été remarqués. Le lavage a été effectué par cinq volumes de réaction à chaque étape en utilisant du PBS 10 mM (pH 7,4). Avec une augmentation des concentrations de SCC-Ag, les niveaux actuels ont été progressivement augmentés dans les deux cas. L'anticorps GNS montre les changements actuels à partir de 10 fM, tandis que les changements à partir de 100 fM ont été remarqués avec uniquement l'anticorps. Dans les deux cas (anticorps et anticorps GNS), 1 nM de SCC-Ag a affiché la saturation. Lorsque la concentration est encore augmentée, aucun changement significatif dans le courant n'a pu être observé

Comparaison des changements actuels avec différentes concentrations de SCC-Ag sur des surfaces modifiées par des anticorps et des anticorps GNS. un Graphique de régression linéaire pour la limite de détection de SCC-Ag. Avec anticorps (ligne rouge) et avec anticorps GNS (ligne bleue) sont affichés. La limite de détection était de 10 fM avec l'anticorps GNS et de 100 fM avec l'anticorps seul. b Changements actuels avec l'interaction SCC-Ag et anticorps. Avec toutes les concentrations, un niveau plus élevé de changements de courant a été trouvé sur la surface des anticorps GNS. Une tension de balayage linéaire de 0 à 2 µV à une tension de pas de 0,01 µV a été suivie pour les mesures. La barre d'erreur indique les valeurs moyennes des triples (n = 3) avec les écarts types sont dans la plage de ± 0,1 à 0,15 × 10 ⁻⁹ A. La limite de détection (LOD) a été considérée comme la concentration la plus faible d'un analyte (à partir de la ligne d'étalonnage à de faibles concentrations) par rapport au signal de fond (S /N = 3:1), en d'autres termes, LOD = écart-type de la ligne de base + 3σ

Les mêmes concentrations de SCC-Ag interagissaient indépendamment sur des surfaces modifiées par des anticorps GNS. Lorsque 10 fM de SCC-Ag ont été déposés à la surface, le courant a clairement changé de 1,33E-11 à 3,74E-11. Ce résultat montre que même 10 fM de SCC-Ag peuvent clairement interagir avec la surface immobilisée par l'anticorps GNS, ce qui ne peut pas être détecté dans le cas avec un seul anticorps. De plus, lorsque les concentrations ont été augmentées à 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM et 1  nM, les niveaux actuels ont encore augmenté à 4,69E-10, 9,23E-10, 1,41E-09, 1,48E-09 et 1,62E-09, respectivement (Fig. 5b). Les calculs statistiques avec les écarts types sont de l'ordre de ± 0,1 à 0,15 × 10 ⁻⁹ A. Par rapport à la détection sur les deux surfaces ci-dessus, la surface modifiée par anticorps GNS montre les changements les plus élevés du courant avec toutes les concentrations de SCC-Ag testées (Fig. 6b). Basé sur 3σ , il pourrait trouver la limite de détection à 10 fM (Fig. 6a), c'est une détection 10 fois meilleure (inférieure) par rapport à la seule surface modifiée par anticorps. Le calcul statistique avec les écarts types est de l'ordre de ± 0,1 à 0,15 × 10 ⁻⁹ R. Auparavant, le SCC-Ag a été évalué sur différents nanomatériaux, tels que les nanoparticules de strontium et le graphène ; cependant, ces surfaces ont affiché une sensibilité ~ 1000 fois inférieure à celle de l'étude actuelle [35].

Détection sélective de SCC-Ag sur des surfaces modifiées par anticorps/anticorps GNS

La détection sélective de SCC-Ag a été comparée à deux protéines de contrôle, à savoir, la serpine et l'albumine qui sont abondantes dans la circulation sanguine. La serpine est un inhibiteur de protéase qui remplit différentes fonctions physiologiques humaines et processus biologiques, tandis que l'albumine représente 45 mg mL ⁻¹ et contribue à 50-70% dans le sérum sanguin. Comme le montre la figure, une concentration de 1 nM de ces deux protéines de contrôle et de SCC-Ag a été déposée individuellement sur les surfaces d'anticorps ou d'anticorps GNS (Fig. 7a) ; il a été clairement observé que les changements actuels n'ont été remarqués qu'avec SCC-Ag dans les deux cas, indiquant que l'anticorps est capable de reconnaître uniquement SCC-Ag. Il n'y a pas de changements significatifs remarqués dans le courant avec l'interaction des protéines de contrôle. Cette expérience confirme que le dispositif expérimental actuel peut spécifiquement détecter/diagnostiquer SCC-Ag. D'autres supports ont été rendus par d'autres expériences de contrôle par les interactions de SCC-Ag avec GNS seul et SCC-Ag avec TiO₂ -Surface IDE recouverte de GNS marqué par des anticorps non immuns. Aucun changement significatif n'a été observé dans le courant par rapport à l'interaction spécifique (Fig. 7b).

un Détection sélective de SCC-Ag sur des surfaces modifiées par des anticorps et des anticorps GNS. Des interactions avec la C1-serpine et la C-2-albumine ont été réalisées. La surface est aux étapes ci-dessus jusqu'à 1µM de blocage éthanolamine. Les valeurs ont été moyennées en triple. Dans les deux cas, l'anticorps n'a reconnu que le SCC-Ag, indiquant la détection spécifique. b Mesures de contrôle. Les interactions de spécificité sont comparées aux interactions non spécifiques. Il y avait des discriminations claires remarquées. Une tension de balayage linéaire de 0 à 2 µV à une tension de pas de 0,01 µV a été suivie pour les mesures. La barre d'erreur indique les valeurs moyennes des triples (n  = 3) with the standard deviations in the range of ± 0.1 to 0.15 × 10 ⁻⁹ A

Conclusion

Head and neck cancer is a common cancer that affects the areas of the mouth, throat and salivary glands. Diagnosing head and neck cancer with a suitable biomarker is mandatory to give the necessary treatment to the patients and improve their lifestyle. SCC-Ag has been found to be one of the important biomarkers for cancers; herein, SCC-Ag was detected on the titanium oxide-coated interdigitated electrode sensing surface (IDE-TiO₂ ). Antibody for SCC-Ag was immobilized on IDE-TiO₂ surface and detected the SCC-Ag. The detection limit was found as 100 fM, and further increment in the limit of detection was attained by conjugating the antibody with gold nanostar (GNS antibody). The limit of detection was improved by 10-folds (to 10 fM), this might be due to the larger number of antibody bound on the amine-modified TiO₂ surface through GNS. Moreover, control experiments were carried out with two different proteins and not able to recognize by the anti-SCC-Ag, indicating the selective detection of SCC-Ag. The demonstrated IDE-TiO₂ sensing surface helps to diagnose the head and neck cancer, a strategy can be followed for the earlier detection.

Disponibilité des données et des matériaux

All of the data are fully available without restriction.

Abréviations

16-MDA:

16-Mercaptoundecanoic acid

APTES:

(3-Aminopropyl)triethoxysilane

GNS:

Gold nanostar

IDE:

Interdigitated electrode

PBS :

Phosphate-buffered saline

RT:

Room temperature

SCC-Ag:

Squamous cell carcinoma antigen

SiO₂ :

Silicon dioxide

TiO₂ :

Titanium oxide

UV:

Ultraviolet