Un nouveau mécanisme sous-jacent à la formation de racines latérales de tomates déclenchées par des nanotubes de carbone à parois multiples :l'implication de l'oxyde nitrique

Introduction

Il existe de nombreuses applications biologiques et biomédicales des nanotubes de carbone [1, 2]. En raison de la capacité unique de pénétrer facilement les membranes cellulaires, la biosécurité des nanotubes de carbone est toujours un sujet de débat [3, 4]. Parallèlement, comme la production et l'utilisation des nanotubes de carbone se développent rapidement, il devient important de caractériser les mécanismes détaillés de sa cytotoxicité chez l'homme et les mammifères, et récemment chez les plantes [3,4,5,6,7,8,9]. Il est bien connu que les plantes et leurs communautés sont très importantes pour l'homme et l'environnement, et elles sont également à risque d'exposition aux nanotubes de carbone, en raison de l'accumulation dans les sols par l'application d'engrais biosolides [6, 10, 11]. En tant que membres importants des nanotubes de carbone, la toxicité des nanotubes de carbone à parois multiples (MWCNT), constitués de plusieurs couches laminées de graphène, a été largement étudiée. Des études chez les mammifères ont révélé que l'exposition aux MWCNT et aux nanotubes de carbone à paroi simple induisait des dommages oxydatifs et une activation de NF-κB dans les kératinocytes humains et les cellules A549 [9, 12]. Les MWCNT et les nanotubes de carbone à paroi simple peuvent fusionner avec la membrane plasmique, provoquant ainsi des dommages cellulaires par peroxydation lipidique et stress oxydatif [9, 11, 13, 14]. La cytotoxicité et le stress oxydatif déclenchés par les MWCNT, ainsi que des réponses inflammatoires modestes, ont été observés dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine [15]. Une étude précédente a suggéré que la toxicité primaire des MWCNT dans les épinards rouges était principalement dérivée de la surproduction d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et que les effets toxiques pourraient être inversés par l'acide ascorbique supplémenté [7]. En ce sens, les MWCNT sont considérés comme un nouveau facteur de stress pour les organismes, que ce soit chez les animaux ou chez les plantes.

La formation de racines latérales (LR), un déterminant important de l'architecture racinaire, a été considérée comme un indicateur de réponse adaptative à diverses contraintes [16]. Chez les plantes supérieures, la formation de LR est influencée par les phytohormones et un large éventail d'indices environnementaux, notamment la disponibilité en eau, les nutriments et le stress abiotique, comme l'hypoxie et le stress des métaux lourds [17,18,19]. Pendant ce temps, de nombreuses preuves ont confirmé que la formation de LR agit non seulement comme un support physique, mais contribue également à l'absorption d'eau et de nutriments pour la croissance et le développement des plantes [19,20,21]. Différents indices environnementaux pourraient déclencher plusieurs phénotypes spécifiques de réponse morphogénique induite par le stress (SIMR), notamment la promotion de la formation de LR et une inhibition de l'élongation des racines [17]. La régulation de la formation de LR est également étroitement contrôlée par des phytohormones, telles que l'auxine, et l'activation de gènes régulateurs du cycle cellulaire en réponse à l'auxine a été suggérée [19, 22]. Pendant ce temps, l'implication de certaines petites molécules dans l'organogenèse racinaire déclenchée par l'auxine a été confirmée chez les plantes de concombre, de tomate, de soja et de colza [23,24,25,26,27]. Ces petites molécules comprennent le peroxyde d'hydrogène (H₂ O₂ ), l'oxyde nitrique (NO), le monoxyde de carbone (CO) et l'hydrogène gazeux (H₂ ).

Parmi ceux-ci, le NO, un gaz radicalaire, s'est avéré avoir de multiples fonctions physiologiques chez les plantes [28, 29]. Outre l'amélioration de l'adaptation des plantes contre les stress, les fonctions du NO incluent la promotion du développement des poils absorbants, l'enracinement adventif et la formation des racines latérales [30,31,32,33], bien que la ou les ressources enzymatiques de la biosynthèse du NO dans ces les processus susmentionnés restent insaisissables. Chez les animaux, la synthèse de NO à partir de la l-arginine est catalysée par l'enzyme contenant de l'hème, l'oxyde nitrique synthase (NOS) [34]. Bien que le ou les gènes codant pour les enzymes NOS n'aient pas été identifiés dans les plantes, l'activité de type NOS chez les mammifères est largement détectée [35, 36] et les inhibiteurs de la NOS chez les mammifères, tels que N ^G Le chlorhydrate d'ester méthylique de -nitro-l-arginine (l-NAME) peut inhiber la production de NO dans les plantes [25, 33, 36,37,38,39]. Il est important de noter que de nombreuses preuves génétiques ont révélé que le NO peut être produit par la nitrate réductase (NR), une enzyme bien connue responsable du métabolisme de l'azote chez les plantes [28]. L'implication de la production de NO médiée par NR dans la fermeture des stomates et l'acclimatation au froid a été démontrée génétiquement [37, 38]. Notre étude précédente a montré que la synthèse de NO dépendante de NR est impliquée dans la formation de racines latérales induite par l'hydrogène gazeux induite par l'auxine [39].

Jusqu'à présent, différentes réponses dans la formation, la promotion ou l'inhibition de la LR ont été respectivement rapportées chez diverses espèces végétales lorsqu'elles sont complétées par des nanomatériaux, notamment des MWCNT [40,41,42,43], des nanoparticules d'or (Au NP, [44]), de l'oxyde de zinc nanoparticules (ZnO NP [45, 46];), nanoparticules de dioxyde de titane (TiO₂ NP [46];), et l'oxyde de graphène (GO [47,48,49];) (tableau 1), et aucune étude n'a encore fourni la preuve définitive d'un rôle du NO dans les réponses ci-dessus. Dans cette étude, la détection du NO endogène par la méthode du réactif de Greiss, la microscopie confocale à balayage laser (LSCM) et les analyses par résonance paramagnétique électronique (RPE) ont révélé que le niveau de NO était augmenté dans les plants de tomates traités par MWCNT. Par la suite, la formation de LR a été observée. Nous étudions en outre l'implication du NO dans la formation de LR déclenchée par les MWCNT, en manipulant les niveaux de NO endogènes à l'aide d'un piégeur de NO et d'antagonistes qui inhibent l'activité NOS de type NR et mammifère. Une autre expérience a révélé que le NO dépendant de NR pourrait être, au moins partiellement, essentiel pour la formation de LR en réponse aux MWCNT. Ce travail ouvre ainsi une nouvelle fenêtre pour comprendre les effets biologiques des nanomatériaux dans les plantes.

Matériaux et méthodes

Produits chimiques

Sauf indication contraire, tous les autres produits chimiques ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Les MWCNT, achetés auprès de Sigma-Aldrich, ont été caractérisés comme décrit précédemment [50]. Le diamètre extérieur, le diamètre intermédiaire et la longueur des MWCNT étaient respectivement de 6 à 12 nm, 2,5 à 5 nm et 1 à 9 m. Après traitement par sonication, la suspension colloïdale d'homogénat obtenue a été stérilisée et utilisée.

D'autres nanoparticules de carbone ont été obtenues auprès de Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd., notamment des nanotubes de carbone à paroi unique (SWCNT, XFS22 ; pureté> 95 %, diamètre 1–2 nm, longueur 5-30 m, surface spéciale> 1075  m ² /g), graphène (XF001W ; pureté ~ 99 %, diamètre 0,5–5 m, épaisseur ~ 0,8  nm, rapport monocouche ~ 80 %, surface BET 500~1000 m ² /g; résistivité électrique ≦ 0,30 Ω.cm) et charbon actif (AC, XFP06 ; pureté> 95%, taille des particules 5 ± 1 μm, volume des pores 1–1,2 cm ³ /g, ouverture 2,0–2,2 nm, surface spéciale ~ 1500–1700 m ² /g).

De plus, le nitroprussiate de sodium (SNP) a été utilisé comme composé libérant du NO [30,31,32,33]. Le sel de potassium du 2-(4-carboxyphényl)-4,4,5,5-tétraméthylimidazoline-1-oxyl-3-oxyde (cPTIO) a été considéré comme un piégeur de NO [51,52,53,54]. Tungstate (Tg ; un inhibiteur de NR [28, 33, 37, 55, 56, 57] ;) et N ^G Le chlorhydrate d'ester méthylique de -nitro-L-arginine (NOM ; un inhibiteur de l'enzyme de type NOS chez les mammifères [25, 33, 36,37,38,39] ;) ont également été appliqués. Dans cette étude, les concentrations des produits chimiques ci-dessus ont été déterminées dans les expériences pilotes, à partir desquelles les réponses significatives ont été observées.

Matériel végétal et conditions de croissance et détermination de la formation de LR

Tomate (Solanum lycopersicum L.) les graines « Jiangshu 14 » ont été aimablement fournies par les instituts agricoles du Jiangsu, à Nanjing, dans la province du Jiangsu, en Chine. Des graines sélectionnées de taille identique ont été mises à germer dans de l'eau distillée à 25 ± 1 °C dans l'obscurité pendant 3 jours. Les semis identiques sélectionnés avec des radicules de 2 à 3 mm ont ensuite été transférés dans des solutions de traitement de 6 mL contenant les concentrations indiquées de MWCNT, 200  nM d'acide 1-naphtylacétique (NAA ; une auxine bien connue), 0,1 mM de SNP, 0,2  mM de cPTIO, 20 M de tungstate (Tg), 0,2  mM NAME et autres nanoparticules de carbone, y compris 5 mg/mL de nanotubes de carbone monoparoi (SWCNT), de graphène et de charbon actif (AC), seuls ou en combinaison pour les moments indiqués. Les semis ont été cultivés dans un incubateur éclairant (25 ± 1 °C) avec une intensité lumineuse de 200 μmol m ⁻² s ⁻¹ à 14/10 h (clair/obscur) photopériode.

Après les traitements, des photos ont été prises, et le nombre et la longueur des racines latérales émergées (> 1 mm) par plant ont ensuite été déterminés en utilisant le logiciel Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/) [39 , 58]. Comme décrit précédemment, seuls les segments radiculaires latéraux ont été utilisés pour l'analyse ultérieure.

Imagerie de la distribution MWCNT par microscopie électronique à transmission

La distribution des MWCNT dans la racine des plantules de tomate a été caractérisée en utilisant la microscopie électronique à transmission (MET; JEOL, JEM-200CX, Tokyo, Japon). La préparation des échantillons pour l'analyse MET était conforme au protocole précédent [59].

Imagerie du NO endogène par microscope confocal à balayage laser

L'imagerie NO a été réalisée en utilisant une sonde fluorescente NO assez spécifique 4-amino-5-méthylamino-2′,7′-difluorofluorescéine diacétate (DAF-FM DA). Une fois la sonde soigneusement lavée, les images ont été obtenues à l'aide du microscope confocal Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne, excitation à 488 nm, émission à 500-530  nm pour l'analyse du NO). Dans notre expérience, 20 échantillons individuels ont été sélectionnés au hasard et mesurés par traitement. Les photographies sont représentatives de résultats identiques.

AUCUN contenu déterminé par le test de réactif de Griess

Selon les méthodes décrites précédemment [50], la teneur en NO a été déterminée avec le test de réactif de Griess. Il est important de noter que pour échapper aux interférences causées par les teneurs en nitrates et en nitrites concentrés dans les plantes, les échantillons identiques pré-incubés dans 200 M cPTIO (le piégeur de NO) pendant 30 min ont été considérés comme les échantillons blancs. Après l'ajout de réactif de Griess pendant 30 min, l'absorbance a été enregistrée à 540  nm et la teneur en NO a été déterminée par comparaison à une courbe standard de NaNO₂ .

Détermination de NO avec résonance paramagnétique électronique (RPE)

Selon nos méthodes précédentes [39, 55, 60], la détermination du niveau de NO par résonance paramagnétique électronique (RPE) a été réalisée. La couche de solvant organique a été utilisée pour déterminer le NO sur un spectromètre Bruker A300 (Bruker Instrument, Karlsruhe, Allemagne) dans les conditions suivantes :température ambiante; fréquence micro-ondes, 9,85 GHz ; puissance micro-ondes, 63,49  mW; et fréquence de modulation, 100,00 kHz.

Détermination de l'activité nitrate réductase (NR)

L'activité NR a été détectée par spectrophotométrie à 540 nm selon la méthode précédente [57]. Le nitrite produit a été déterminé par spectrophotométrie à 540 nm par l'ajout de 1 mL de sulfénilamide à 1 % (p/v) dans 3 M HCl avec 1 mL de 0,02 % (v/v) de n-(1-naphtyl)-éthylènediamine.

Analyse statistique

Lorsqu'indiqué, les résultats ont été exprimés comme les valeurs moyennes  ± SE de trois expériences indépendantes avec trois répétitions biologiques pour chacune. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel SPSS Statistics 17.0. Pour l'analyse statistique, le test multiple de Duncan (p < 0,05) a été choisi comme approprié.

Résultats

MWCNT non seulement l'entrée dans les cellules racines, mais aussi la promotion de la formation LR

La formation de LR est un déterminant majeur de l'architecture des systèmes racinaires. Pour étudier l'effet des MWCNT sur la formation de LR, des plants de tomates âgés de 3 jours ont été incubés avec une gamme de concentrations de MWCNT (0,05, 0,5, 5 et 50  mg/mL) pendant 3 jours. L'application d'acide 1-naphtylacétique (NAA) a été considérée comme un contrôle positif. Dans notre expérience, le nombre et la longueur de LR ont été déterminés comme deux paramètres de la formation de LR. Comme le montre la figure 1, par rapport aux échantillons témoins, les MWCNT exogènes ont induit de manière significative la formation de LR d'une manière approximativement dose-dépendante, avec un effet maximal dans 5 et 50  mg/mL. Une réponse inductible similaire a été observée lorsque 200  nM de NAA ont été administrés. Compte tenu du coût des MWCNT et de la réponse inductible dans la formation de LR, 5  mg/mL de MWCNT ont été appliqués dans les expériences suivantes.

La formation de LR de tomate induite par les MWCNT était approximativement dose-dépendante. Des semis de tomates âgés de trois jours ont été traités avec 200  nM de NAA et les concentrations indiquées de MWCNT, respectivement. Le nombre et la longueur des racines latérales émergées (> 1 mm) par plantule ont ensuite été déterminés après 3 jours de traitement. Il y avait 30 plantes (10 × 3) dans trois répétitions biologiques, et les expériences ont été menées 3 fois. Les données sont les moyens  ± SE. Dans chaque série d'expériences, les barres désignées par la même lettre ne différaient pas significativement à p < 0,05 niveau selon le test multiple de Duncan

Pour valider la fonction spécifique des MWCNT dans l'induction de la formation de LR, nous étudions en outre si les autres allotropies des MWCNT ont également de tels effets inductibles. Comme le montre la figure 2a, tous ces nanomatériaux de carbone ont présenté des effets toxiques sur la croissance des pousses (données non présentées). Fait intéressant, l'application de MWCNT, de nanotubes de carbone à paroi simple (SWCNT), de graphène et de charbon actif avec une concentration identique (5 mg/mL) pourrait entraîner une augmentation différentielle du nombre et de la longueur de LR, par rapport aux plantes témoins sans produits chimiques. (Fig. 2b). Parmi ces produits chimiques, la réponse inductible maximale a été découverte dans des semis de tomates incubés par MWCNT.

Changements dans la formation des racines latérales en réponse à différentes nanoparticules de carbone. Des semis de tomates de trois jours ont été traités avec de l'eau distillée (Con), 5 mg/mL de MWCNT, des nanotubes de carbone à paroi simple (SWCNT), du graphène et du charbon actif (AC), respectivement, pendant encore 3 jours. un Des photos représentatives ont ensuite été prises. b Le nombre et la longueur des racines latérales émergées (> 1 mm) par plantule ont ensuite été également déterminés. Barre d'échelle = 50 mm. Il y avait 30 plantes (10 × 3) dans trois répétitions biologiques, et les expériences ont été menées 3 fois. Les données sont les moyens  ± SE. Dans chaque série d'expériences, les barres désignées par la même lettre ne différaient pas significativement à p < 0,05 niveau selon le test multiple de Duncan

A l'aide de la microscopie électronique à transmission (MET), la distribution des MWCNTs peut être évaluée facilement. Les résultats présentés sur la figure 3 ont révélé que les MWCNT, lorsqu'ils étaient appliqués de manière exogène, pouvaient être absorbés par les plantules de tomates, et la distribution des MWCNT s'est avérée être dans les cellules racinaires. Ce résultat peut être compris, puisque les racines des plantules sont directement cultivées dans une solution liquide contenant des MWCNT.

Distribution des MWCNT dans les racines de tomate. Images MET de plants de tomates de 3 jours traités avec de l'eau distillée (Con; a ) ou 5 mg/mL de MWCNT (b ) pendant 1 jour ont été prises. La flèche rouge indique la paroi cellulaire, tandis que la flèche blanche indique les MWCNT

La synthèse de NO induite par MWCNT et la formation de LR par la suite étaient sensibles au cPTIO, un piégeur de NO

Pour déterminer si le NO est également impliqué dans la formation de LR induite par les MWCNT, la fonction de NO dans la formation de LR provoquée par les MWCNT a été évaluée en manipulant les niveaux de NO endogènes à l'aide d'un composé libérant du NO et du piégeur. Semblable aux résultats précédents [31], l'administration de nitroprussiate de sodium (SNP) pourrait entraîner l'induction de la formation de LR, et une réponse additive a été observée lorsque SNP et MWCNT étaient appliqués ensemble (Fig. 4). Lorsque le sel de potassium du 2-(4-carboxyphényl)-4,4,5,5-tétraméthylimidazoline-1-oxyl-3-oxyde (cPTIO ; un piégeur de NO) a été ajouté, les réponses de promotion dans la formation de LR causées par les MWCNT étaient significativement altéré. Seul, le cPTIO pourrait inhiber le développement de la LR, par rapport au témoin sans produits chimiques, indiquant le rôle important du NO endogène dans l'organogenèse des racines.

La formation de LR induite par MWCNT était sensible à l'élimination du NO endogène avec cPTIO, son piégeur. Des semis de tomates âgés de trois jours ont été traités avec de l'eau distillée, 5 mg/mL de MWCNT, 0,1 mM de SNP, 0,2  mM de cPTIO, seuls ou en combinaison pendant 3 jours. Ensuite, le nombre et la longueur des racines latérales émergées (> 1 mm) par plantule ont été déterminés. Il y avait 30 plantes (10 × 3) dans trois répétitions biologiques, et les expériences ont été menées 3 fois. Les données sont les moyens  ± SE. Dans chaque série d'expériences, les barres désignées par la même lettre ne différaient pas significativement à p < 0,05 niveau selon le test multiple de Duncan

Afin d'évaluer davantage le rôle important du NO endogène dans la réponse MWCNT, une évolution dans le temps de la production de NO in vivo a d'abord été détectée avec la méthode du réactif de Greiss. Au cours de la détermination ci-dessus, le filtrat identique prétraité avec cPTIO a été considéré comme un blanc pour des résultats précis. Il a été observé que la production de NO dans les racines des plantules de tomate a augmenté de façon spectaculaire jusqu'à 24h après le traitement MWCNT, puis revient aux niveaux initiaux (48h; Fig. 5a). Au-dessus du niveau maximal de NO endogène déclenché par les MWCNT pendant 24  h, le cPTIO, un piégeur de NO, a manifestement aboli, suggérant le rôle spécifique du NO.

La production de NO induite par MWCNT a été bloquée par cPTIO, le piégeur de NO. Des semis de tomates âgés de trois jours ont été traités avec de l'eau distillée et 5 mg/mL de MWCNT avec ou sans 0,2  mM de cPTIO, respectivement. un Modifications de l'activité NR (à gauche) et de la production de NO (à droite) déterminées à l'aide de la méthode du réactif de Greiss. b Après 24h de traitement, le signal NO a été analysé par LSCM (gauche) et EPR (droite). Barre d'échelle = 0.1 mm. Les données sont les moyens  ± SE. Les barres désignées par la même lettre ne différaient pas significativement à p < 0,05 niveau selon le test multiple de Ducan

Pour confirmer les résultats ci-dessus, LSCM et ESR ont été adoptés. Premièrement, les changements dans les niveaux de NO endogène dans les racines des plantules de tomate ont été surveillés en marquant le NO à l'aide de la sonde fluorescente perméable aux cellules et assez spécifique au NO DAF-FM DA et en imagerie avec LSCM. Semblable aux résultats précédents (Fig. 5a), en présence de cPTIO, l'augmentation de l'intensité de fluorescence dépendante de DAF-FM déclenchée par les MWCNTs a été considérablement abolie (Fig. 5b). Ces résultats impliquent que la fluorescence déclenchée par DAF-FM est liée aux niveaux de NO endogène dans les racines des plantules de tomate.

La production de NO induite par les MWCNT a été confirmée par spectroscopie EPR. Comme prévu, les racines des plantules traitées pendant 24 h avec des MWCNT présentaient le triplet de structure hyperfine typique du complexe NO. Cependant, l'ajout de cPTIO a aboli le signal ci-dessus, indiquant que l'exposition aux MWCNT a entraîné une forte production de NO (Fig. 5b). Collectivement, ces données suggèrent qu'aucune synthèse pourrait être nécessaire pour la formation de LR déclenchée par MWCNT dans les semis de tomates.

NR pourrait être responsable de la production de NO induite par MWCNT et de la formation LR par la suite

Étant donné que NR et NOS de type mammifère sont deux enzymes majeures liées à la synthèse de NO dans les plantes, le tungstate (un inhibiteur de NR) et le NAME (un inhibiteur de NOS de mammifère) ont été appliqués dans l'expérience suivante. Ici, le traitement au tungstate a considérablement supprimé la promotion de la formation de LR dans les racines des plantules de tomates traitées au MWCNT (Fig. 6). Comparativement, l'induction de la formation de LR déclenchée par les MWCNT n'a pas été fortement inhibée par l'ajout de NAME, ce qui indique que la NOS de type mammifère pourrait ne pas être l'enzyme synthétique cible de NO responsable de la production de NO induite par les MWCNT. Il a également été observé qu'une diminution légère mais non significative de la formation de LR a été observée dans les semis de tomates lorsque le tungstate ou le NAME étaient appliqués séparément.

Modifications de la formation de LR en réponse aux MWCNT et deux inhibiteurs de la synthèse de NO. Des semis de tomates âgés de trois jours ont été traités avec 5 mg/mL de MWCNT, 20 μM de tungstate (Tg), 0,2 mM NAME, seuls ou en combinaison pendant 3 jours. Ensuite, le nombre et la longueur des racines latérales émergées (> 1 mm) par plantule ont été déterminés. Il y avait 30 plantes (10 × 3) dans trois répétitions biologiques, et les expériences ont été menées 3 fois. Les données sont les moyens  ± SE. Dans chaque série d'expériences, les barres désignées par la même lettre ne différaient pas significativement à p < 0,05 niveau selon le test multiple de Duncan

Le rôle de NR dans la formation de LR déclenchée par MWCNT a été examiné plus en détail en surveillant la production de NO en réponse aux MWCNT appliqués avec ou sans tungstate. Par rapport aux changements dans la production endogène de NO (Fig. 5a), l'analyse de l'évolution dans le temps de l'activité NR a montré une tendance similaire (Fig. 7a), culminant également à 24h après le traitement avec les MWCNT. Ces résultats suggèrent que l'augmentation de la production de NO induite par MWCNT peut principalement résulter d'une activité accrue de NR. De manière cohérente, l'inhibition de la production de NO dépendante du NR par le tungstate a été confirmée en utilisant la méthode du réactif de Greiss (Fig. 7b), LSCM et EPR (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1).

La production de NO induite par les MWCNT a été bloquée par le tungstate, un inhibiteur de NR. Des semis de tomates de trois jours ont été traités avec de l'eau distillée et 5 mg/mL de MWCNT avec ou sans 20 M de tungstate (Tg). Changements dans l'activité NR (a ) et PAS de production (b ) déterminé par la méthode du réactif de Greiss. Les données sont les moyens  ± SE. Les barres désignées par la même lettre ne différaient pas significativement à p < 0,05 niveau selon le test multiple de Ducan

Discussion

La phytotoxicité est une considération importante pour comprendre l'impact environnemental potentiel des nanoparticules [4, 7, 61, 62, 63]. De nombreuses preuves ont révélé que les MWCNT sont toxiques pour les plantes, notamment en induisant des dommages oxydatifs, en inhibant la germination des graines, la croissance des racines et le développement [11, 63, 64]. Cependant, étant un phénotype de SIMR, la ramification des racines par formation de racines latérales est un élément important de l'adaptabilité du système racinaire à divers signaux environnementaux [17]. Dans ce travail, nous avons intégré des analyses biologiques, pharmacologiques et biochimiques pour montrer l'implication de la production de NO induite par NR dans la formation de LR induite par MWCNT, au moins partiellement dans nos conditions expérimentales. De plus, la fonction du NO dans l'organogenèse racinaire stimulée par les MWCNT a souligné les rôles centraux de ce second messager impliqué dans le processus de développement des plantes et leur adaptation contre le stress [29,30,31,32,33, 37, 38].

Tout d'abord, nous avons confirmé que 5 mg/mL de MWCNT (DO 6–12  nm) pouvaient pénétrer dans les tissus racinaires (Fig. 3). Par la suite, l'induction de la formation de LR de tomate a été observée (Fig. 1), imitant les rôles d'induction du NAA et du SNP (Fig. 4), un composé libérateur de NO bien connu [30, 31]. Des réponses inductrices similaires ont été découvertes dans des arbres résineux [41], des laitues [42] et Arabidopsis [43] lorsqu'ils ont été confrontés à des MWCNT (OD 6-13 nm, environ 9,5 nm et 30-40  nm, respectivement). Par exemple, l'application avec des MWCNT vierges (p-MWCNT) ou des MWCNT à fonction carboxyle (c-MWCNT) (diamètre moyen de 9,5 nm) pourrait favoriser le développement de la LR dans les plantules de laitue [42]. En revanche, l'inhibition de la racine primaire et même la formation de LR ont été trouvées simultanément dans les plants de soja soumis aux MWCNT (DO 20–70 nm [40];). En comparant avec les données de diamètre extérieur des MWCNT (tableau 1), nous avons supposé que les effets présentés par les MWCNT sur la formation de LR variaient avec leurs diamètres, montrant la promotion avec un diamètre inférieur et l'inhibition avec un diamètre plus élevé. Certes, le mécanisme connexe doit être soigneusement étudié. Un phénomène similaire a été confirmé dans la tolérance à la salinité des plantes [50]. Combiné avec les résultats ci-dessus, il a en outre été déduit que la fonction des nanomatériaux peut varier d'une espèce à l'autre, et vice versa, différents types de nanomatériaux peuvent provoquer divers effets biologiques. Cependant, d'autres facteurs d'influence, tels que différentes doses de MWCNT [48] et même les conditions de croissance des plantes, ne pourraient pas être facilement exclus.

Par rapport à d'autres nanomatériaux, y compris SWCNT, graphène et AC avec une concentration identique, l'induction maximale de la formation de LR et même des effets toxiques sur la croissance des pousses ont été observés dans les MWCNT (Fig. 2). Ceux-ci pourraient être liés aux caractéristiques physiques particulières des MWCNT, un type de nanomatériaux qui ont une conductivité électrique élevée, une grande surface spécifique, un rapport d'aspect élevé et une stabilité thermique remarquable [65]. Les effets toxiques des nanomatériaux ont été largement rapportés dans le concombre, le chou, la carotte, l'oignon, etc. [66, 67].

De nombreuses preuves ont montré que le NO, agissant comme une molécule de signalisation, peut réguler un large éventail de processus végétaux allant de l'adaptation environnementale au développement et dont ce dernier comprend la germination des graines et l'organogenèse des racines [29, 68, 69, 70, 71, 72, 73 ]. Notre expérience ultérieure a révélé que le NO peut être impliqué dans la formation de LR induite par les MWCNT. Bien que plusieurs méthodes d'imagerie de la production de NO dans les cellules végétales aient été appliquées, les inconvénients, notamment le manque de sensibilité et l'interférence par des molécules indépendantes du NO, peuvent exister dans chaque méthode [74]. Ainsi, trois méthodes responsables de l'imagerie et de la détermination du NO, y compris la méthode du réactif de Greiss, le LSCM et l'EPR, ainsi que l'application de cPTIO, un piégeur de NO, ont été appliquées dans nos conditions expérimentales. En utilisant trois méthodes, nous avons observé qu'une augmentation de la production endogène de NO induite par les MWCNT dans les plants de tomates était abolie par cPTIO (Fig. 5), un piégeur de NO [30,31,32]. Il est important de noter que ce processus était corrélé à la réponse biologique du développement de LR induit par MWCNT, qui était sévèrement bloqué lorsque cPTIO était appliqué simultanément (Fig. 4).

Une évaluation plus poussée de ces réponses et de la ou des sources potentielles de NO induites par les MWCNT appliqués de manière exogène a révélé que la production de NO et par la suite la formation de LR pouvaient être attribuées à l'activité NR. Chez les plantes, la production de NO est principalement générée à partir de NR et de protéines de type NOS de mammifères [28]. Cependant, le gène NOS végétal n'est toujours pas identifié [35, 75, 76], bien que certaines expériences utilisant les inhibiteurs de l'enzyme NOS de mammifère aient fourni des preuves d'une voie dépendante de la l-arginine dans la production de NO [36, 76]. Il est confirmé que NR est la source la plus importante de NO dans les plantes [28]. Des études antérieures ont montré que la production de NO dépendante de NR fonctionne comme un signal lié au nitrate impliqué dans la régulation de l'architecture racinaire [32, 33]. En outre, la production de NO dépendante du NR était étroitement associée à l'acclimatation au froid [38], à la tolérance à la salinité [50] et à la fermeture des stomates induite par l'acide abscissique [77]. Nos résultats ont en outre révélé que le tungstate (un inhibiteur de NR) altère manifestement la formation de LR induite par les MWCNT, en particulier dans la longueur de LR (Fig. 6). En revanche, il n'y avait qu'une légère diminution de la longueur du LR et aucune différence significative n'a été observée dans le nombre de LR lorsque l-NAME (un inhibiteur de la NOS des mammifères) était utilisé. De manière cohérente, l'analyse biochimique a montré que l'activité NR était augmentée de manière évidente par les MWCNT (Fig. 7a), parallèlement aux changements dans la production de NO (Fig. 5a). Les réponses ci-dessus pourraient être totalement bloquées par le tungstate (Fig. 7a, Fichier supplémentaire 1 :Figure S1). Nous avons ainsi déduit que l'augmentation de la production endogène de NO induite par les MWCNTs était principalement attribuée à la voie NR. Certes, d'autres preuves génétiques devraient être étudiées.

Conclusion

In summary, we provide evidence to show that MWCNT-induced NO production via NR might be required for tomato lateral root formation and this was summarized in Fig. 8. Importantly, above findings provide insights into the intricate molecular mechanism of MWCNTs functions in plants.

Schematic representation of the proposed MWCNT-induced tomato lateral root formation mainly via NR-dependent NO production. The role of mammalian NOS-like enzyme was preliminarily ruled out

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données sont entièrement disponibles sans restriction.

Abréviations

CO:

Carbon monoxide

cPTIO:

2-(4-Carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide potassium salt

DAF-FM DA:

4-Amino-5-methylamino-2′,7′-difluorofluorescein diacetate

EPR :

Résonance paramagnétique électronique

GO :

Oxyde de graphène

H₂ :

Hydrogen gas

H₂ O₂ :

Hydrogen peroxide

l-NAME:

N ^G -Nitro-l-arginine methyl ester

LR:

Lateral root

LSCM:

Laser scanning confocal microscopy

MWCNT :

Nanotubes de carbone multi-parois

NAA:

1-Naphthylacetic acid

NO:

Nitric oxide

NOS:

Nitric oxide synthase

NR :

Nitrate reductase

ROS :

Espèces réactives de l'oxygène

SIMR:

Stress-induced morphogenic response

SNP:

Sodium nitroprusside

SWCNT :

Nanotubes de carbone monoparoi

TEM :

Microscopie électronique à transmission

Tg:

Tungstate