Nanohydrogel biocompatible immunostimulant anti-tumoral puissant fabriqué à partir d'ADN

Introduction

L'ADN bactérien contenant des motifs CpG non méthylés sont des adjuvants vaccinaux, des anti-allergènes et des agents immunoprotecteurs et anticancéreux extrêmement prometteurs [1]; il pourrait être reconnu par des récepteurs sur les cellules endosomales du système immunitaire, telles que les cellules dendritiques (DC), les macrophages, les cellules T, les cellules tueuses naturelles (NK) et les cellules NKT [2]. Ces cellules immunitaires innées sont capables de répondre à des motifs CpG non méthylés grâce à la reconnaissance de modèles moléculaires associés à des agents pathogènes (PAMP) à des molécules spécifiques d'un agent pathogène dans le micro-organisme pathogène. Il a été confirmé que l'oligonucléotide CpG (CpG-ODN) pouvait être reconnu par le récepteur Toll-like 9 (TLR9) [3] et induit une réponse immunitaire de type Th1 via la voie de signalisation dépendante de Myd88 [4]. Cependant, ces inconvénients du CpG-ODN ont entravé son application clinique en raison de sa prématuration par adsorption protéique, de sa digestion par les endonucléases dans le sérum [5] et de son instabilité in vivo. Ces problèmes devraient être résolus en encapsulant l'acide nucléique simple brin (ss) dans un support d'administration ou en le faisant s'auto-assembler en une nanostructure qui améliore sa stabilité in vivo ainsi qu'un taux d'internalisation plus efficace pour les cellules immunitaires innées. Actuellement, divers supports tels que les polymères cationiques polyéthylèneimines (PEI) [6], les liposomes [7, 8] et les microparticules [9] ont été utilisés pour l'administration de CpG-ODN ; il reste encore quelques inconvénients à améliorer, comme sa cytotoxicité, son taux de charge limité et etc.

Les matériaux d'ADN qui sont constitués d'acide nucléique présentent un grand potentiel pour être utilisés comme vecteurs de délivrance de CpG-ODN. Par rapport à l'ADNsb, les matériaux d'ADN à structure bidimensionnelle ou tridimensionnelle présentent des propriétés différentes, telles qu'une pénétration facile des membranes cellulaires et une stimulation des macrophages pour sécréter des cytokines [10]. L'ADN en forme de X a été utilisé pour délivrer des motifs CpG et augmenter avec succès l'activité immunostimulatrice de CpG-ODN par une absorption cellulaire accrue, alors que l'absorption cellulaire accrue est en partie due à la structure en forme de X [11]. De même, un tétraèdre d'ADN tridimensionnel qui peut être auto-assemblé en nanostructures de tailles uniformes a été introduit de manière non invasive et efficace dans les cellules RAW264.7 pour fonctionner. De plus, un tel tétraèdre s'est avéré mécaniquement stable et non cytotoxique selon la recherche [12]. Récemment, il a été démontré que l'hydrogel CpG-RCA (gel CpG-RCA) avec une structure de nanoflore préparée par amplification en cercle roulant (RCA) était capable de fournir un signal de stimulation immunitaire, de résister à la dégradation de la nucléase, d'augmenter la sécrétion de cytokines immunitaires et inhiber la prolifération des lymphocytes T de la leucémie lymphoïde aiguë humaine (CCRF-CEM) [13]. Ces résultats ci-dessus suggèrent que la forme et la structure des matériaux d'ADN ont joué un rôle important dans l'amélioration de l'absorption cellulaire et l'augmentation de l'efficacité de la stimulation immunitaire. Étant donné que les cellules CCRF-CEM proviennent de la leucémie lymphoblastique T humaine, un type de malignité hématologique, elles étaient différentes d'une tumeur maligne hématologique ; les tumeurs solides entourent souvent un microenvironnement immunosuppresseur qui peut entraver une immunité anti-tumorale valide [14]. Pour cela, nous avons construit un immunostimulant à ADN contenant beaucoup plus de copies de CpG-ODN par amplification en chaîne multi-amorcée (MCA) [15] plutôt que RCA [16]. Profitant du principe de l'appariement de bases complémentaires, l'amorce impliquée dans CpG et la séquence matrice spécialement conçue ont été mélangées à la ligase et étendues par la polymérase phi29 en présence de dNTP libres. RCA (R) ou MCA (M) a réagi pour x ou y les heures doivent être représentées séparément par Rx ou My (Fig. 1) ; les produits ont été identifiés par électrophorèse sur gel d'agarose (Fig. 2a). Sur la base de la réaction MCA, les produits obtenus ont été appelés hydrogels CpG-MCA (gels CpG-MCA) possédant des centaines ou des milliers de CpG en tandem en raison de la forte augmentation des copies de motifs CpG. Les gels CpG-MCA étaient également un puissant immunostimulant qui augmentait significativement la sécrétion de cytokines des cellules RAW264.7 et inhibait efficacement la prolifération des lignées cellulaires de gliome humain U251. Nous nous attendions à ce que cette étude conduise à un nouvel immunostimulant nanohydrogel basé sur des matériaux d'ADN et a promu son application pour l'immunothérapie tumorale [17].

Les images des gels CpG-MCA et du gel CpG-RCA. un Image d'électrophorèse sur gel d'agarose du gel CpG-RCA (R12) et des gels CpG-MCA (R4M4 et R4M8). Piste 1, marqueur standard d'ADN MW digéré par -Hind III ; piste 2, R12; voie 3, R4M4 ; piste 4, R4M8, piste 5, marqueur d'ADN DL5000. Images SEM de R12 (b ), R4M4 (c ), et R4M8 (d ). Images MET de R12 (e ), R4M4 (f ), et R4M8 (g ). La barre d'échelle noire est de 3 m ; la barre d'échelle rouge est de 1 m ; la barre d'échelle blanche est de 500 nm

Les images du microscope confocal et l'intensité de fluorescence moyenne dans les cellules RAW 264.7 traitées avec des gels CpG-ODN, CpG-RCA (R12) et CpG-MCA (R4M4 et R4M8) (équivalents 100  nM CpG). Les gels CpG-MCA et CpG-RCA ont été marqués avec du Cy5 (rouge) en ajoutant du Cy5-dCTP pour leur absorption cellulaire. CpG-ODN marqué au Cy5 a été utilisé comme groupe témoin. un Images de microscopie confocale du gel CpG-RCA et des gels CpG-MCA par des cellules RAW 264.7 après incubation pendant 2 h. b L'intensité de fluorescence moyenne de Cy5 dans les cellules RAW264.7. Les résultats sont exprimés comme la moyenne  ± SD de trois expériences indépendantes. ****P < 0,0001

Méthodes/Expérimental

Matériaux

Tous les oligonucléotides ont été achetés auprès de Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. et purifiés par chromatographie liquide à haute performance. Ensembles de dNTP (100 mM chacun), ADN polymérase phi29 (10 U/μL) et 10× tampon de réaction ADN polymérase phi29 (330 mM Tris-acétate (pH 7,9 à 37 °C), 100 mM Mg acétate, 660 mM K acétate , 1% (v /v ) Tween 20, 10  mM DTT) ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). T4 ADN ligase (400  U/μL), 5′-triphosadénine (ATP) et tampon de réaction 10 × T4 ADN ligase (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂ , 1 mM d'ATP, 10 mM de DTT, pH 7,5 à 25°C) ont été achetés auprès de New England Biolabs, Inc. (Ipswich, MA). La cyanine 5-dCTP a été achetée auprès de PerkinElmer, Inc. (Waltham, MA, USA). Les dispositifs de filtration centrifuge Amicon Ultra-0,5 ont été achetés auprès de Merck KGaA (Darmstadt, Allemagne). L'eau utilisée dans cet article a été purifiée par le système de purification d'eau Millipore Synergy UV Ultrapure. Sérum fœtal bovin (FBS) Gibco, milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, à haute teneur en glucose, L-glutamine, rouge de phénol, pyruvate de sodium, sans HEPES), Trypsine-EDTA (0,25 %) et pénicilline (10 000  U/mL)- la streptomycine (10000  μg/mL) ont été achetées auprès de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Les kits ELISA ont été achetés auprès de R&D Systems, Inc. Le kit de comptage de cellules-8 (CCK-8) a été acheté auprès de Dojindo (Kumamoto, Japon). La lignée cellulaire de type macrophage de souris (cellules RAW264.7) a été obtenue auprès de la banque de cellules de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). Les lignées cellulaires de gliome humain (cellules U251) ont été obtenues auprès de la banque de cellules de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine).

Préparation de modèles d'ADN circulaires

Un long ADN simple brin avec un groupe phosphorylé à l'extrémité 5' avec un rapport égal d'amorces CpG-ODN (amorce 1) ont été mélangés dans un tampon de réaction phi29 1 × et annelés à 95°C pendant 5'min et lentement refroidis à 4°C à un vitesse de − 1 °C/s en utilisant un thermocycleur (Bio-Rad T100, Allemagne). Après l'annelage, 20 U/μL T4 ADN ligase avec ATP et tampon de réaction ADN ligase T4 ont été ajoutés et incubés à 4°C pendant une nuit. Les enzymes étaient inactives à 75 °C pendant 10 min.

Préparation des gels CpG-MCA et CpG-RCA

Une matrice d'ADN circulaire (10 L) a été mélangée avec 1 x tampon de réaction d'ADN polymérase phi29, 4 mM de dNTP pour chacun, et 5 U d'ADN polymérase phi29 et DDW stérile ont été ajoutés, 50  μL au total. Le mélange a été incubé à 30 °C sous agitation pendant 12 h (R12). Pour la formation du gel MCA, après 4 h de réaction RCA, 500 pM d'amorce 2 et d'amorce 3 ont ensuite été ajoutés au mélange résultant respectivement pour être incubés pendant les heures de repos à 30° C sans ajouter de réactifs supplémentaires (R4M4 et R4M8). La polymérase phi29 a été inactivée à 65°C pendant 10 min. Le gel CpG-RCA et les gels CpG-MCA ont été purifiés par ultrafiltration.

Concentration des gels CpG-MCA et CpG-RCA

La concentration des gels CpG-MCA et du gel CpG-RCA a été mesurée sur la base du nombre de copies CpG impliquées dans tous les hydrogels du groupe de traitement. Comme le dNTP ajouté dans le système réactionnel était de 4 mM pour chacun, une matrice circulaire contenait 81 nucléotides et 1 copie de CpG. Si Abs est l'absorbance du dNTP à 260 nm et ε est le coefficient d'extinction du dNTP à 260 nm, alors le dNTP consommé dans la réaction pourrait être mesuré et le nombre total de copies de CpG calculé par l'équation suivante :CpG copies = (4 mM × 4 − Abs/ε × 1 000 000)/81 [13]. Abs et ε de dNTP ont été mesurés par NanoDrop 2000c.

Électrophorèse sur gel d'agarose

L'électrophorèse sur gel d'agarose a été utilisée pour évaluer la formation et la dégradation des gels CpG-MCA et la formation d'une matrice circulaire. Les hydrogels ont été exécutés sur du gel d'agarose à 1% à 100 V pendant 60 min, et le modèle circulaire a été exécuté sur du gel d'agarose à 3% à 100 V pendant 60 min.

Caractérisation des gels CpG-MCA et CpG-RCA

La microscopie électronique à transmission (MET, Hitachi HT7700, Japon) a été utilisée pour caractériser la structure interne et la taille approximative des gels CpG-MCA. Les gels CpG-MCA ont été examinés aux ultrasons pendant 30 min avant d'être déposés sur cuivre et séchés. Les tests ont été effectués au laboratoire central de l'hôpital Renji. La microscopie électronique à balayage (MEB, Hitachi SU8020, Japon) a été utilisée pour obtenir la morphologie des gels CpG-MCA. Les gels CpG-MCA ont été examinés par ultrasons pendant 30 min avant d'être déposés sur une plaquette de silicium propre, et l'échantillon a été recouvert de métal avec Au.

Imagerie microscopique confocale

L'absorption cellulaire a été imagée par un microscope confocal Leica. Les cellules RAW264.7 ont été ensemencées sur une boîte de Pétri confocale à une densité de 2 × 10 ⁵ cellules/mL. Après lavage deux fois avec du tampon phosphate (PBS), les cellules ont été incubées avec des gels CpG-ODN, CpG-RCA et CpG-MCA marqués au Cy5 100 nM dans du milieu DMEM frais pendant 2 h à 37 ° C. Les cellules ont ensuite été lavées trois fois avec du PBS et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min, puis les cellules ont été colorées avec du FITC-phalloidine et Hoechst 33342. Toutes les images ont été prises à l'aide d'un microscope confocal laser Leica. L'intensité semi-quantitative de l'intensité fluorescente moyenne a été calculée par Image J, une application Java pour l'analyse d'images.

Test ELISA

Les cellules RAW264.7 ont été ensemencées à une densité de 7 × 10 ⁴ cellules/mL dans une plaque de 24 puits cultivée pendant 24 h avant utilisation. Les cellules ont été incubées en présence de gels CpG-MCA et d'autres groupes à 37°C pendant 8h pour le TNF-α et 24h pour l'IL-6; les surnageants ont été récupérés. Les niveaux de cytokines dans les surnageants ont été détectés par dosage immuno-enzymatique (ELISA) selon les protocoles suggérés par le fabricant.

Test d'expression génique

Les niveaux d'expression génique ont été dosés par PCR quantitative en temps réel (Q-PCR). Les cellules RAW264.7 ont été ensemencées à une densité de 1 × 10 ⁶ cellules/mL dans une plaque à 6 puits cultivées pendant 24 h avant utilisation. Les cellules ont été incubées en présence de gels CpG-MCA et d'autres groupes à 37°C pendant 2h pour TNF-α et TLR9 et 8h pour IL-6 et autres. L'isolement et la purification de l'ARNm ont été effectués en utilisant le réactif TRIzol (Thermo Fisher Scientific). L'ARNm extrait a été quantifié par NanoDrop 2000c. Un microgramme d'ARN total a été rétro-transcrit en utilisant le kit de réactif PrimeScript RT avec gDNA Eraser (Takara Bio Inc.); l'amplification a été réalisée dans un volume réactionnel total de 20 μL, en utilisant TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio Inc) selon les instructions du fabricant. Les amorces pour les gènes sont les suivantes :GAPDH :F :AGGTCGGTGTGAACGGATTTG; R : TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA ; TLR9 : F : ATGGTTCTCCGTCGAAGGACT ; R : GAGGCTTCAGCTCACAGGG ; TNF-α :F :GACGTGGAACTGGCAGAAGAG; R :TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG ; IL-6 : F : CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC ; R :CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT ; CD86 : F :GAGCTGGTAGTATTTTGGCAGG ; R :GGCCCAGGTACTTGGCATT ; CD206(MRC1):F:CTCTGTTCAGCTATTGGACGC; R :CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC.

Test de migration des plaies rayées

Les cellules RAW264.7 ont été ensemencées 70 μL à une densité de 5 × 10 ⁵ cellules/mL dans des inserts de culture pendant 24 h avant utilisation. Ensuite, les inserts ont été soigneusement retirés et les cellules ont été lavées deux fois avant d'être traitées avec chaque groupe dans un milieu frais. Les photos ont été collectées en 0 h, 6 h et 24 h ; la zone de la plaie a été mesurée par ImageJ. Chaque groupe a eu trois répétitions et l'expérience a été répétée trois fois.

Test de cytotoxicité

La cytotoxicité a été testée à l'aide de CCK8. Les cellules RAW264.7 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits et traitées avec chaque groupe pendant 24h. Ensuite, 10 μL de solution de CCK8 ont été ajoutés à chaque puits, suivis de 1–2 h d'incubation à 37 °C. L'absorbance a été mesurée à 450  nm, chaque groupe a eu trois répétitions et l'expérience a été répétée trois fois.

Cellules U251 co-cultivées avec des cellules RAW264.7

Les cellules RAW264.7 ont été ensemencées dans les chambres supérieures et les cellules U251 ont été ensemencées séparément dans les chambres inférieures et incubées pendant 24 heures avant le traitement. Après trois lavages avec du PBS, des gels GpC-ODN, CpG-ODN, CpG-RCA et CpG-MCA dans le milieu frais ont été ajoutés dans les chambres supérieure et inférieure pendant la durée indiquée. Les cellules U251 des chambres inférieures ont été collectées et ont mené l'expérience de clonage sur plaque.

Test de formation de clones sur plaque

L'effet sur la prolifération des cellules U251 co-cultivées avec des cellules RAW264.7 a été analysé avec des expériences de clonage sur plaque. Les cellules U251 sur les chambres inférieures ont été collectées et diluées avec de multiples proportions dans du DMEM contenant 15% de FBS sur un nombre final de 200 cellules/puits sur une plaque de culture à 6 puits et ont continué à cultiver pendant 2 semaines jusqu'à ce que les grappes de clones puissent être observées par yeux nus (plus de 50 cellules/clone). Après un lavage doux avec du PBS, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 min, puis colorées au cristal violet pendant 1 h. Les grappes contenant plus de 50 cellules seraient incluses dans le décompte en tant que formation de clone réussie. Les expériences ont été répétées trois fois et chaque expérience avait trois puits répétés :taux de formation de clones = (nombre de formation de clones/nombre de cellules inoculées) × 100 %.

Stabilité des gels CpG-MCA et CpG-RCA

Les gels CpG-MCA lyophilisés ou le gel CpG-RCA ont été placés dans 400 L de DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal (10 % de FBS-DMEM) respectivement et incubés à 37 °C pendant 24 h; les concentrations d'ADN dans le surnageant ont été mesurées par NanoDrop 2000c après centrifugation à 1000 rpm pendant 10 s. Les hydrogels restants ont été calculés en fonction des concentrations d'ADN dans le surnageant. Le gel restant = (m − c × V )/m × 100 %, où m est la masse de gel que nous avons ajoutée, c est la concentration d'ADN dans le surnageant, et V est le volume de surnageant. Les gels CpG-MCA ou CpG-RCA ont été placés dans du FBS-DMEM ou du PBS à 10 % respectivement et incubés à 37°C pendant 12h ou 24h. Après incubation, les gels ont été passés sur gel d'agarose 1% à 100 V pendant 60 min.

CpG-ODN

Le CpG-ODN simple brin a été synthétisé par Sangon Company (Beijing, Chine) et purifié par chromatographie liquide haute performance (HPLC). Le CpG-ODN utilisé dans cette étude était CpG-ODN 1668 [18] :5′-TCCATGACGTTCCTGATGCT, et les oligonucléotides non CpG ont été nommés GpC-ODN [18] :5′-TCCATGAGCTTCCTGATGCT.

Analyse statistique

Toutes les données de cette étude sont représentées sous forme de valeurs moyennes ± écart-type (moyenne ± SD) à partir de deux ou trois expériences indépendantes. L'analyse statistique entre les différents groupes a été réalisée à l'aide d'un t de Student test. La signification statistique a été fixée à P < 0,05 (niveau de confiance de 95 %).

Résultats et discussion

L'immunostimulant ADN a été construit avec succès par réaction MCA [16]. Dans cette réaction, la première et importante étape avant l'amplification isotherme est la réaction de cyclisation d'une longue matrice simple brin (ss) (Schéma 1). Nous avons utilisé une électrophorèse sur gel d'agarose pour confirmer la formation d'ADN circulaire après annelage et ligature avec une amorce (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1). La distance de migration entre l'amorce et la longue matrice d'ADNsb est devenue plus courte puisque la structure a changé après que la matrice est devenue un cycle et ligaturée avec l'amorce. La réaction MCA contient une chaîne d'unités répétitives en série et a facilement conduit à l'apparition de nanofleurs en raison de l'enroulement continu (Schéma 1). Les résultats de l'électrophorèse sur gel d'agarose ont démontré que les produits de la réaction RCA (gel CpG-RCA ou R12) et de la réaction MCA (gel CpG-MCA ou R4M4/R4M8) étaient obtenus avec succès (Fig. 1a). Le gel CpG-RCA et les gels CpG-MCA étaient difficiles à migrer à travers le gel d'agarose et restaient la rétention en position initiale. Les deux gels étaient trop collants, ils ont donc été retirés comme de la soie lorsque nous les pipetons (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2A-C). Ces résultats suggèrent que la matrice d'ADN est amplifiée de manière exponentielle avec des dNTP libres pour former un hydrogel [15]. Il convient de mentionner que la distance de migration n'était pas significativement différente entre le gel CpG-RCA et les gels CpG-MCA. De plus, les résultats SEM et MET ont en outre montré que le diamètre du gel CpG-RCA (Fig. 1b, e) et des gels CpG-MCA (Fig. 1c, d, f et g) allait de l'échelle nanométrique à l'échelle micrométrique, et présentaient une morphologie de nanofleurs. Le CpG-ODN doit être internalisé dans les cellules immunitaires TLR9-positives et interagir avec le TLR9 localisé dans les endosomes à l'intérieur des cellules immunitaires pour exécuter son activité immunostimulante. Pour cela, nous avons utilisé des gels CpG-ODN, CpG-RCA et CpG-MCA marqués Cy5 pour rechercher leur absorption dans les cellules RAW264.7 en utilisant la microscopie confocale. Comme observé sur la figure 2a, les gels CpG-MCA marqués au Cy5 étaient efficacement internalisés et distribués dans le cytoplasme des cellules RAW264.7. Sur la base de l'intensité de fluorescence moyenne mesurée, l'efficacité d'absorption des gels CpG-MCA a été significativement augmentée (P < 0,0001) par rapport à celui de CpG-ODN (Fig. 2b), démontrant l'absorption efficace des gels CpG-MCA, ce qui est favorable pour exercer une stimulation immunitaire plus forte. Il est rapporté que l'absorption d'ADN par les cellules RAW264.7 des macrophages de souris a été augmentée en concevant différentes nanostructures d'ADN. Tels que l'ADN structuré de type tétrapode (tétrapode), l'ADN tétraédrique (tétraèdre) et l'ADN tétragonal (tétragone) [19]. De même, il a également été prouvé que l'ADN en forme de X, l'ADN en forme de Y et l'hydrogel d'ADN X augmentaient l'absorption d'ADN par les cellules [20, 21]. Ces résultats suggèrent que les structures d'ADN d'ordre supérieur étaient des formes plus efficaces pour fournir des fragments d'ADN fonctionnalisés. Nous avons donc émis l'hypothèse que l'absorption cellulaire élevée des gels CpG-MCA dérivait du changement de forme des gels CpG-MCA par la formation de gel. Nous avons ensuite testé la stabilité des gels CpG-MCA. Les gels CpG-MCA ont été incubés à 37°C pendant différentes durées dans différentes solutions. Les résultats de l'électrophorèse sur gel d'agarose ont montré que les gels CpG-MCA étaient relativement stables dans une solution de PBS et étaient partiellement dégradés dans le sérum impliqué dans le milieu (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3A). Les gels CpG-MCA présentaient toujours une échelle plutôt qu'une bande unique, ce qui suggérait une dégradation incomplète. Nous avons ensuite étudié la stabilité des gels dans 10 % de FBS-DMEM. Les résultats MET ont confirmé que les gels CpG-MCA étaient partiellement digérés et ne ressemblaient plus à des fleurs mais conservaient toujours la forme (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2D-F). La courbe de dégradation des gels CpG-MCA a été tracée en détectant la concentration d'ADN dans le surnageant en 24 h (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3B). Il a été démontré qu'après une incubation de 24 h dans du FBS-DMEM à 10 %, R12 a conservé près de 80 %, tandis que R4M4 et R4M8 sont restés à près de 85 %, ce qui correspond aux résultats de l'électrophorèse sur gel d'agarose. Afin de confirmer la dégradation des gels, les gels CpG-MCA ont été incubés à 37°C jusqu'à 48 h dans le sérum, et la production de dégradation a été effectuée par électrophorèse sur gel d'agarose (Fichier supplémentaire 1 :Figure S4). Les gels ne ressemblent plus à des échelles puisqu'ils ont été digérés en morceaux par l'enzyme dans le sérum et ont perdu leur viscosité et sont même devenus des morceaux de nucléotides simples, suggérant que les gels CpG-MCA sont biodégradables car ils pourraient être digérés en présence de sérum bovin fœtal ( FBS). En conséquence, les gels CpG-MCA résistent efficacement à la digestion du sérum dans les 24  h et se sont finalement complètement dégradés. La grande capacité de résistance à la dégradation contribuera à améliorer son efficacité de stimulation immunitaire; les niveaux d'expression du TNF-α et de l'IL-6 dans le surnageant des cellules RAW264.7 ont également clairement montré que les gels CpG-MCA pouvaient efficacement stimuler les cellules à produire des cytokines immunitaires.

L'illustration schématique sur la préparation et l'absorption cellulaire des gels CpG-MCA et du gel CpG-RCA. De longs ADN simple brin avec un groupe phosphorylé à l'extrémité 5' ont été mélangés avec des amorces composées de motifs CpG ont d'abord été annelés et ligaturés par l'ADN ligase T4 pour former une matrice circulaire. La réaction RCA et MCA a été réalisée par l'ADN polymérase phi29 pour générer une grande quantité d'ADN de concatémère séquentiel et convoluer comme de nombreuses nanofleurs. Les gels peuvent alors être absorbés par les macrophages et stimuler la sécrétion de cytokines

L'efficacité immunostimulante des gels CpG-MCA a été évaluée plus avant, nous avons traité les macrophages RAW264.7 avec GpC-ODN (la séquence est passée de l'effet GACGTT à GAGCTT) [22], CpG-ODN, gel CpG-RCA et CpG- gels MCA puis détecté l'expression de TNF-α et d'IL-6. La concentration de TNF-α dans le surnageant de cellules RAW264.7 incubées pendant 8 h avec le gel CpG-RCA (R12) et les gels CpG-MCA (R4M4 et R4M8) a suscité un niveau beaucoup plus élevé de TNF-α que CpG-ODN dans le même concentration de traitement (Fig. 3a). Pour les gels CpG-MCA, R4M8 plutôt que R4M4 a induit un niveau plus élevé de sécrétion de TNF-α (P <0,001), suggérant que la sécrétion de TNF-α augmentait à mesure que les copies augmentaient. De plus, R4M8 a induit un effet significatif (P <0,001) concentration plus élevée de TNF-α que R12, indiquant que les gels CpG-MCA sont des stimulateurs plus puissants que les gels CpG-RCA lorsque le temps de réaction total est égal. La même tendance a également été trouvée dans la détection de l'IL-6 (Fig. 3d). La sécrétion d'IL-6 stimulée par les gels CpG-MCA et CpG-RCA était significativement augmentée. La sécrétion d'IL-6 dans les groupes R12, R4M4 et R4M8 était de 2,97 fois (P < 0,0001), 4,39 fois (P < 0,0001), et 27,81 fois (P < 0,0001) de celui du groupe CpG-ODN, respectivement. La sécrétion d'IL-6 dans le groupe R4M8 était de 6,33 fois (P < 0,0001) de celui noté dans le groupe R4M4 et 9,36 fois (P <  0,001) de celui noté dans le groupe R12. Il convient de mentionner que la sécrétion d'IL-6 ne présentait aucune différence significative entre les groupes CpG-ODN, GpC-ODN et témoins. Ces résultats ont confirmé qu'une efficacité plus élevée du TNF-α et de l'IL-6 libéré a été observée à partir des cellules RAW264.7 traitées avec des gels CpG-MCA plutôt qu'à partir de CpG-ODN. De plus, l'effet des gels CpG-MCA avec une concentration différente sur la sécrétion de cytokines a également été étudié, et nous avons constaté que la sécrétion de TNF-α et d'IL-6 augmentait avec la concentration des gels (Fig. 3b, e). Le résultat de la capacité de stimulation immunitaire des gels non CpG (indiqués par R12-C, R4M4-C et R4M8-C sur la figure 3c) et GpC-ODN a démontré qu'ils induisaient à peine la sécrétion de TNF-α (Fig. 3c), indiquant que les réponses immunitaires induites par les gels CpG-MCA résultent des motifs CpG.

Détection des cytokines libérées par les cellules RAW264.7 stimulées avec des gels CpG-ODN, CpG-RCA et CpG-MCA à l'aide d'un kit ELISA. un La sécrétion de TNF-α par les cellules RAW264.7. b La sécrétion de TNF-α à partir de cellules RAW264.7 après traitement avec différentes concentrations de gels CpG-MCA. c Détection de la capacité immunostimulante des gels CpG et non-CpG (R12-C, R4M4-C et R4M8-C). d La sécrétion d'IL-6 à partir de cellules RAW264.7. e La sécrétion d'IL-6 à partir de cellules RAW264.7 après traitement avec différentes concentrations de gels MCA. Les résultats sont exprimés comme la moyenne  ± SD de deux expériences indépendantes. **P < 0,01, ****P < 0.001, ****P < 0,0001

Ensuite, nous avons testé l'expression de l'ARNm des cytokines, des marqueurs de surface cellulaire et du TLR-9. L'ARNm du TNF-α dans le groupe CpG-ODN était 1,25 fois supérieur à l'expression détectée dans le groupe témoin, et le changement de facteur dans les groupes R12, R4M4 et R4M8 était 3,28 fois (P < 0,01), 2,53 fois (P < 0,05), et 4,57 fois (P <0,001) de celui testé séparément dans le groupe CpG-ODN (Fichier supplémentaire 1 :Figure S5A). L'expression de l'ARNm de l'IL-6 dans le groupe CpG-ODN était 1,01 fois supérieure à celle du groupe témoin. L'expression de l'ARNm de l'IL-6 dans les groupes R12, R4M4 et R4M8 était de 3,87 fois (P < 0,01), 4,63 fois (P < 0,05), et 23,04 fois (P < 0,0001) autant que dans le groupe CpG-ODN respectivement (Fichier supplémentaire 1 :Figure S5B).

L'expression de l'ARNm du TLR-9, le récepteur du CpG à l'intérieur des cellules [4], a également augmenté dans tous les groupes par rapport au groupe témoin, mais les groupes de gel CpG-MCA ont remarquablement amélioré l'expression de l'ARNm du TLR-9 par rapport au CpG. -Groupe ODN (Fichier supplémentaire 1 :Figure S5C). En plus des cytokines et du TLR9, nous avons également détecté des molécules de costimulation (CD) CD86 et CD206, qui ont été utilisées pour marquer les macrophages pro-inflammatoires (M1) et stimulateurs de croissance (M2), respectivement [23]. Il a été constaté qu'il n'y avait pas de différence significative entre le groupe CpG-ODN et le groupe témoin dans CD86 ou CD206 (Fichier supplémentaire 1 :Figure S5D, E). Par rapport au groupe de gel CpG-RCA, CD86 dans les groupes de gel CpG-MCA a augmenté à des degrés divers, tandis que CD206 a diminué à des degrés divers, et le groupe R4M8 a augmenté et diminué le plus, suggérant que les cellules RAW264.7 traitées avec des gels CpG-MCA sont enclins à se différencier en population M1 avec le marqueur de surface CD86, qui a en outre vérifié la capacité de stimulation immunitaire des gels CpG-MCA.

La sécrétion de cytokines par les macrophages est extrêmement importante dans la réponse à la stimulation immunitaire ainsi que dans la prolifération et la migration des macrophages. La stimulation des macrophages avec CpG-ODN augmenterait la production de cytokines anti-inflammatoires par voie dépendante de TLR9. Les cytokines induites par CpG-ODN ont augmenté la migration des macrophages et favorisé la prolifération des macrophages en régulant négativement l'expression d'un régulateur négatif du cycle cellulaire [24]. CpG-ODN a également induit l'expression de l'inhibiteur de l'activateur du plasminogène de type 1 (PAI-1) dans les macrophages, ce qui a entraîné une migration accrue à travers la vitronectine [25]. Nous avons également étudié plus avant la capacité des gels CpG-MCA à favoriser la migration des macrophages et à évaluer leur cytotoxicité. La migration des cellules RAW264.7 a été induite par des gels CpG-MCA à la fois dans le système de migration transwell (Fig. 4a) et dans le test de migration de plaie par éraflure (Fig. 4b). Les cellules RAW264.7 ont été cultivées en présence ou en l'absence de gels CpG-MCA et laissées migrer pendant 24h. Le nombre de migration de macrophages dans les groupes de gel CpG-MCA était bien supérieur à celui du groupe CpG-ODN (Fig. 4a). Ensuite, nous avons procédé au test de migration des plaies par rayure ; les cellules ont été autorisées à migrer pendant 24h et les images ont été capturées en 0h, 6h et 24h. Les résultats ont démontré que la zone d'éraflure diminuait au fur et à mesure que la plaie guérissait. La migration des macrophages à 6 h a montré que les gels CpG-MCA étaient plus efficaces que le groupe CpG-ODN car le taux de cicatrisation était plus élevé, mais il n'y a pas de signification distincte entre les groupes R12, R4M4 et R4M8 (Fichier supplémentaire 1 :Figure S6A, B). Et la zone de grattage à 24 h a confirmé que le taux de guérison de la zone de grattage dans le groupe CpG-ODN était de 1,70 fois (P < 0,05) de celui du groupe témoin, et le taux de guérison dans les groupes R12, R4M4 et R4M8 était de 1,63 fois (P < 0,001), 1,63 fois (P < 0,0001), et 2,23 fois (P  < 0.0001) of that measured in the CpG-ODN group separately. The healing rate in the R4M8 group was 1.36 times (P  < 0.01) of that in the R12 group. CpG-MCA gels strongly promoted the migration of RAW264.7 cells compared to that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 4c). In addition, RAW264.7 cells were cultured with a series concentration of gels for 24 h. We found that the CpG-MCA gels exhibited a negligible cytotoxicity to RAW264.7 cells due to the non-toxicity of DNA itself; on the contrary, CpG-MCA gels could stimulate RAW264.7 cell proliferation with a dose-dependent effect, which was a benefit to enhance the production of immune cytokines (Fig. 4d).

The analysises of migration and cell viability of CpG-ODN, CpG-RCA gel (R12), and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) in RAW264.7 cells. un The migration assay of RAW264.7 cells induced with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8. b The migration assay of RAW264.7 cells stimulated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. c The scratch area analysis in the scratch migration experiment. The percentages are calculated as the ratio of the original area. d The cell viability of RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. **P < 0,01, ****P  < 0.001, ****P  < 0.0001

For further verifying the inhibited efficiency of CpG-MCA gels for the proliferation of solid tumor cells, we estimated the inhibitory effects of CpG-MCA gels as immune stimulators for the U251 human brain glioma cells. The U251 cells was first co-cultured with RAW264.7 macrophages for 24 h, and the clone formation rate was used to check the proliferate ability of the U251 cells. As shown in Fig. 5a–f, the clone formation rate in the CpG-ODN group was 74.1% of that observed in the control group (P  < 0.05), and the rates in R12, R4M4, and R4M8 groups were 45.4% (P  < 0.01), 15.3% (P  < 0.001), and 12.0% (P  < 0.001) of that in the CpG-ODN group, respectively. The results demonstrated that the U251 cells treated with CpG-MCA gels presented a significantly lower percentage of clone formation rate compared with that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 5g). It is notable that the trend of inhibitory results was in accordance with the secretion of TNF-α among groups, CpG-MCA gels exhibited a stronger effect on stimulating RAW264.7 cells to secrete cytokines to inhibit proliferation of U251 cells than CpG-ODN. Our research provided preliminary evidence to demonstrate the CpG-MCA gels have the potential to be used as an immunostimulant.

The assessment on the therapeutic effect of immunostimulatory CpG-RCA gel (R12) and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) on cancer cells in vitro by plate clone formation assay. U251 cells treated with a none, b RAW264.7 cells, c RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, d RAW264.7 cells treated with R12, e RAW264.7 cells treated with R4M4, and f RAW264.7 cells treated with R4M8. g Results of the proliferation percentage of U251 cells after co-cultured with RAW264.7 cells for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. **P < 0,01, ****P  < 0.001

Conclusions

In summary, we have successfully preparedCpG-MCA nanohydrogels that consist of hundreds of immunostimulatory CpG motifs to effectively deliver immune stimulus signal into cells and significantly induce the expression of immune cytokines. CpG-MCA nanohydrogels exhibited powerful anti-tumor immunity against human glioma cells, demonstrating that CpG-MCA nanohydrogels have the potential to be used as an immunostimulant for the therapy of cancer.

Disponibilité des données et des matériaux

The datasets used and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Abréviations

CpG-MCA gels:

CpG-MCA hydrogel

CpG-RCA gel:

CpG-RCA hydrogel

MCA/M:

Multi-primed chain amplification

R12:

CpG-RCA gel

R12-C, R4M4-C, R4M8-C:

Hydrogels not containing CpG motifs

R4M4, R4M8:

CpG-MCA gels

RCA/R:

Rolling circle amplification