Oxydation et nanodispersion des fibres de soie naturelles

Introduction

Les matériaux à structures hiérarchiques sont omniprésents dans les systèmes biologiques naturels [1, 2]. Ils assurent une diversité de fonctions due aux propriétés primaires des polymères et à l'adaptation fonctionnelle des structures à chaque hiérarchie [3,4,5]. Pour concevoir des matériaux artificiels dotés de fonctions améliorées qui reproduisent ces propriétés spéciales, des processus d'extraction qui conservent les nanostructures d'origine des polymères ont été souhaités [6,7,8,9,10]. Diverses études ont été consacrées à l'isolement des nanofibres de polysaccharides (par exemple, la cellulose et la chitine) de leurs structures composites en fibres en utilisant des approches chimiques, physiques et biologiques [11,12,13]. En particulier, des nanofibres complètement individualisées et hautement cristallines ont été obtenues en utilisant l'oxydation médiée par le radical 2,2,6,6-tétraméthylpipéridine-1-oxyle (TEMPO) de la cellulose/chitine native, suivie d'un traitement mécanique doux [14, 15 ]. Cependant, les problèmes économiques et environnementaux demeurent; ces techniques existantes d'isolement des nanofibrilles nécessitent des réactifs coûteux et/ou toxiques, tels que le TEMPO et l'hexafluoroisopropanol (HFIP). Plus important encore, la faible concentration de dispersion de nanofibres résultante a limité leur stockage, leur transport et leurs applications.

Les soies animales tissées par un large éventail d'insectes et d'araignées possèdent également des structures fibreuses hiérarchiques [16, 17]. Ces molécules de protéines se présentent sous la forme de fibrilles assemblées de l'échelle nanométrique à l'échelle macroscopique, résultant en des propriétés mécaniques et biochimiques exceptionnelles dans les matériaux en soie [18,19,20,21]. Pour obtenir des nanostructures de soie, cependant, les processus d'extraction restent des défis en raison de (i) la structure hiérarchique complexe, (ii) la cristallinité élevée et (iii) l'adhérence entre les micro-/nano-fibrilles des fibres de soie. Un traitement par ultrasons a été appliqué aux fibres de soie fendues [22]; cependant, les nanofibres résultantes étaient entrelacées et manquaient de capacité de traitement. La dissolution partielle des fibres de soie à l'aide d'un système sel-acide formique a présenté des faisceaux de nanofibres arborescents instables [23]. Une approche intégrée utilisant une dissolution partielle et des ultrasons a abouti à des fibres de soie qui ont été réduites au diamètre d'une seule nanofibrille [24], tandis que le rapport d'aspect et le rendement de ces nanofibres doivent encore être améliorés.

Pour résoudre ces problèmes, nous avons élaboré une stratégie simple et évolutive pour extraire des mésosilks de taille normale [25]. Semblable à l'isolement des polysaccharides [26], des groupes carboxyle ont été introduits sur Bombyx mori soie (BS) et Antheraea pernyi fibres de soie (AS) pour nanofibres se dispersant par répulsion électrostatique; cependant, les produits chimiques redondants, tels que TEMPO et le bromure de sodium (NaBr), ont été exclus car l'oxydation sélective n'était pas nécessaire. Ici, nous avons divulgué l'efficacité de ce processus pour produire des nanofibres individuelles avec des rapports d'aspect élevés. Des propriétés de mouillage optiquement transparentes, mécaniquement robustes et améliorées ont été obtenues dans les membranes de nanofibres de soie (SN) résultantes. En comparaison avec ces nanofibres à base de polysaccharides (c'est-à-dire les nanofibres de cellulose et de chitine), les propriétés intéressantes d'agrégation-redispersion des SN étaient régulées par les valeurs de pH.

Matériaux et méthodes

Oxydation des fibres de soie désassemblées

Les fibres de soie démontées ont été préparées à partir de Bombyx mori brut (ou Antheraea pernyi ) fibres de vers à soie (Xiehe Silk Co., Chine). Brièvement, 5 g de fibres de soie ont été bouillis pendant 30 min dans une solution aqueuse de carbonate de sodium 0,02 M avec un rapport pondéral de 1:400, suivi d'un lavage soigneux dans de l'eau distillée puis d'un séchage à l'air. Ensuite, les fibres de soie dégommées ont été immergées dans une solution d'acide formique (88 % en poids) avec un rapport pondéral de 1:20. Le mélange a été incubé à température ambiante pendant au moins 1 h puis homogénéisé à 10 000 r/min pendant 3 min pour obtenir une suspension. Les fibres de soie désassemblées ont été obtenues à l'état solide après centrifugation de la suspension à 8000 r/min.

Pour l'oxydation, les fibres de soie désassemblées ont été lavées à pH 7 et coupées en petits morceaux de plusieurs centimètres de long, et une quantité souhaitée de solution d'hypochlorite de sodium (NaClO) a été ajoutée dans 100 ml d'eau avec 1 g de fibres de soie désassemblées. De l'hydroxyde de sodium (NaOH) a été ajouté en continu dans le mélange pour maintenir le pH à 10. Lorsque la consommation de NaOH n'était plus observée, la réaction a été stoppée en ajoutant des gouttes d'acide chlorhydrique (HCl) 0,5 µM pour ajuster le pH à 7. Ensuite, la fraction insoluble dans l'eau a été centrifugée à 10000 r/min et lavée plusieurs fois. Enfin, des nanofibres de soie ont été obtenues après traitement de la fraction insoluble dans l'eau avec un homogénéisateur à ultrasons à 19,5 kHz avec une puissance de sortie de 300 W pendant 20 min. Un bain d'eau glacée a été utilisé pour éviter la surchauffe pendant la longue période d'ultrasonication.

Analyse par diffraction des rayons X des fibres de soie oxydées

Les expériences de diffraction des rayons X (XRD) ont été réalisées à l'aide d'un système de diffraction des rayons X polyvalent Ultima IV (Ultima IV, Rigaku, Japon) avec une source Cu-Kα (λ = 0,1542 nm). La tension et le courant de la source de rayons X étaient respectivement de 40 kV et 30 mA. Les résultats de déconvolution des fibres de soie oxydées ont été analysés à l'aide du logiciel PeakFit (4.0). Les nombres et les positions des pics ont été définis à partir des résultats des dérivées secondes des spectres et fixés au cours du processus de déconvolution. La bande passante a été ajustée automatiquement par le logiciel.

Observations morphologiques des nanofibres

Pour observer la formation des différentes nanofibres, la dispersion a été diluée à 0,01 % en poids. Pour la microscopie électronique à balayage, une aliquote de 10 L de la dispersion diluée a été placée sur une plaquette de silicium puis séchée à l'air. Les échantillons ont été recouverts d'or et de palladium et imagés à l'aide d'un MEB JEOL-JSM 7600F (JEOL, Japon) à une tension de 5 kV. Pour la microscopie électronique à transmission (MET), une aliquote de 10 L de la dispersion diluée a été placée sur une grille de microscopie électronique Cu revêtue de carbone. L'excès de liquide a été absorbé par du papier filtre puis séché à l'air. La grille d'échantillonnage a été observée à 80 kV en utilisant un microscope électronique à transmission Titan 80-300 (FEI, U.S.). Les tailles des nanofibrilles ont été analysées avec le logiciel ImageJ (1.48) développé aux National Institutes of Health aux États-Unis.

Tests mécaniques

Les membranes BS, AS, CN (nanofibre de cellulose) et ChN (nanofibre de chitine) d'une épaisseur d'environ 50 µm ont été coulées en utilisant une méthode d'évaporation de solvant. Chaque membrane de nanofibres a été conçue en plusieurs bandes d'une longueur de 60 à 80   mm et d'un diamètre de 5   mm, et elles ont été étirées par une machine d'essai électronique universelle (AG-Xplus, SHIMADZU, Japon) pour déterminer leurs propriétés mécaniques. Dans ce test, l'intervalle initial des appareils était de 20  mm et la vitesse d'étirement était de 1   mm/min.

Propriétés optiques et mouillantes

Les transmissions lumineuses des différentes membranes d'une épaisseur de 25  μm ont été déterminées de 350 à 800  nm à l'aide d'un spectromètre Ultrospec 2100 pro d'Amersham Biosciences.

Un compteur de gouttes (Kyowa Interface Science Co., Ltd.) a été utilisé pour les mesures d'angle de contact. Des analyses d'images ont été effectuées automatiquement à partir des formes de gouttelettes d'eau distillée de 4 μL tombées sur les membranes en ~ 0,5 s.

Résultats et discussion

Oxydation et isolement des nanofibres de soie

La figure 1a présente la stratégie pour isoler les nanofibres des matériaux en fibres de soie. Nous avons d'abord utilisé un processus de prétraitement pour désassembler ces fibres de soie en les traitant avec de l'acide formique (aucune réaction chimique ne s'est produite entre les groupes d'acides aminés ou hydroxyle avec l'acide formique, comme indiqué dans les spectres Raman dans le fichier supplémentaire 1 :Fig. S1 et la discussion pertinente de déposer). Ce prétraitement a désassemblé les fibres de soie en structures en microfibres d'une largeur de 5 à 20  μm (Fig. 1a). Ensuite, de l'hypochlorite de sodium (NaClO) a été utilisé pour oxyder/dissoudre partiellement (dégrader) les fibres de soie désassemblées. De l'hydroxyde de sodium (NaOH) a été ajouté en continu dans le mélange pour maintenir le pH à 10, selon les conditions de l'oxydation des polysaccharides médiée par TEMPO (2, 2, 6, 6-tétraméthylpipéridine-1-oxy-radical) en utilisant TEMPO /NaClO/NaBr, alors que, dans ce cas, le TEMPO et le NaBr n'étaient plus nécessaires pour l'oxydation des fibres de soie en raison des acides aminés réactifs limités dans les séquences de fibroïne de soie. Les fibres de soie initiales avaient une concentration en carboxyle d'environ 0,3  mM/g de protéine, qui a été attribuée aux acides aspartique et glutamique dans la séquence moléculaire [27]. Par la suite, la teneur en carboxyle de la soie oxydée a augmenté de manière approximativement linéaire après l'ajout de NaClO, en raison de l'oxydation des groupes hydroxyméthyle sur les résidus de sérine. Lorsque l'ajout de NaClO a atteint 20 mM/g de protéine, la concentration finale en carboxyle de la soie oxydée était de 0,889 et 1,013  mM/g de protéine pour BS et AS, respectivement (Fig. 1b, c). Cependant, des quantités excessives de NaClO peuvent avoir dégradé les fibres de soie [28]. Par exemple, la fraction insoluble dans l'eau de BS et AS était respectivement de 58,52 et 69,30 % en poids, à l'ajout de NaClO de 20 mM/g de protéine. La perte de poids de la fraction insoluble dans l'eau après oxydation a suggéré que l'ajout de NaClO de ≤ 10 mM/g de protéine était acceptable (plus de 75 % de la protéine est restée), par rapport à une dégradation limitée au cours de l'oxydation. Par conséquent, nous avons utilisé 10 mM de NaClO par gramme de protéine pour oxyder les fibres BS et AS, où la teneur en carboxylate est de 0,724 et 0,837 mg/g de protéine pour BS et AS, respectivement.

Diagramme de processus des SN et teneur en carboxyle de BS et AS. un Schéma de l'oxydation et de la dispersion de la fibre de soie en nanofibres de soie (SN). b La teneur en groupes carboxyle et le poids restant de la fraction insoluble dans l'eau après oxydation de Bombyx mori (BS) correspondant à l'ajout d'hypochlorite de sodium (NaClO). La teneur en carboxyle a augmenté de 0,293 à 0,889 mM/g BS (l'ajout de NaClO était de 20 mM/g de protéine) avec 58,52 % en poids de protéine restante. c Pour Antheraea pernyi soie (AS). La teneur en carboxyle a augmenté de 0,347 à 1,013 mM/g AS (l'ajout de NaClO était de 20 mM/g de protéine) avec 69,30 % en poids de protéine restante

Enfin, des nanofibres ont été obtenues après traitement de la fraction insoluble dans l'eau avec un homogénéisateur à ultrasons (Fig. 2). Les observations en microscopie électronique à balayage ont révélé que l'oxydation a desserré la soie au niveau microscopique, formant des fibres d'un diamètre de plusieurs microns, et le traitement par sonication les a ensuite dispersées en nanofibres d'un diamètre de 105 ± 27 nm (Fig. 2c). Par rapport à d'autres processus [24], qui exfolient principalement la couche superficielle des fibres de soie, un rendement final d'environ ~ 50 % basé sur les soies oxydées a été obtenu pour les nanofibres en raison des forces de répulsion électrostatiques dans les soies oxydées. Une stratégie similaire a également été appliquée aux fibres AS. Le diamètre des nanofibres AS résultantes était de 112 ± 33 nm, et la longueur du contour était supérieure à 1 μm (Fig. 2f).

Observation SEM représentative des fibres de soie résultantes dans chaque processus. un Fibres BS désassemblées après prétraitement à l'acide formique, b fibres BS oxydées, et c les nanofibres BS d'un diamètre de 105 ± 27 nm. d Fibres AS démontées après prétraitement à l'acide formique, e fibres AS oxydées, et f les nanofibres AS d'un diamètre de 112 ± 33 nm. La longueur du contour des nanofibres BS et AS est supérieure à 1 μm

La cristallinité des fibres de soie

Les molécules de protéine de soie agissaient comme des polymères hydrophiles-hydrophobes-hydrophiles, qui se repliaient en micelles de taille irrégulière lors de la formation de billes hydrophiles (régions amorphes) s'étendant à partir de noyaux hydrophobes (régions cristallines) [17]. Les SN ont été assemblés en raison de l'adhésion des régions externes entre les micelles. Cependant, il est suggéré que l'oxydation NaClO des fibres de soie a proposé une faible adhérence entre leurs nanostructures [25]. Comme le montrent les figures 3a et b, après oxydation, les diagrammes de diffraction des rayons X (XRD) des fibres BS oxydées étaient similaires à leur modèle d'origine, ainsi que les diagrammes XRD des fibres AS oxydées. Ainsi, les fibres de soie oxydées sont restées leur nano-élément de construction naturel, c'est-à-dire les structures de feuille β dans les fibres de soie. D'autre part, la déconvolution de ces modèles XRD (Fig. 3c, d) a suggéré un changement significatif de cristallinité dans les fibres BS et AS après oxydation, où les détails sont répertoriés dans le tableau 1. Bien que l'oxydation se soit principalement produite sur les résidus de sérine de la protéine de soie, il y avait plusieurs groupes aminés dans les régions amorphes qui pourraient être attaqués par NaClO [29]. Par conséquent, il est compréhensible que la cristallinité des fibres de BS oxydées dans le tableau 1 soit passée de 24,8% (BS désassemblé) à 41,3% (avec l'ajout de 10 mM/g de protéine NaClO), suivie d'une augmentation de la teneur en carboxyle. Une tendance similaire a également été présentée dans le cas des fibres AS oxydées, où la cristallinité de ces fibres AS a été augmentée de 22,9 à 39,2 %. Les résultats suggèrent que, outre les forces de répulsion électrostatiques, la destruction des régions amorphes dans les protéines de la soie était également un facteur important dans la dispersion des SN. La cristallinité des fibres de soie oxydées (à la fois BS et AS) a été suivie par l'augmentation de la teneur en carboxyle lorsque l'ajout de NaClO était <10 mM/g de protéine. La dégradation des régions amorphes est antérieure aux noyaux cristallisés de la protéine de soie. Cependant, des quantités excessives de NaClO (20 mM/g de protéine) peuvent éventuellement dégrader la soie. Ce phénomène est en bon accord avec les résultats que nous avons révélés dans les Fig. 1b et c.

Analyse XRD des fibres de soie oxydées. Diagramme de diffraction des rayons X (XRD) de a BS et b AS qui s'est oxydé avec divers ajouts de NaClO. Déconvolution représentative et résultats de c BS et d AS matériaux

Les performances des nanofibres de soie

Les morphologies des nanofibres BS et AS oxydées qui ont été obtenues par ultrasonication de fibres de soie oxydées NaClO 10 mM sont montrées sur les Fig. 4a et b. Les nanofibres BS et AS ont un rapport d'aspect similaire (calculé par le logiciel ImageJ), où 16,92 pour les nanofibres BS en moyenne et 19,12 pour les nanofibres AS, respectivement. En comparaison, les nanofibres de cellulose (CN) et les nanofibres de chitine (ChN) préparées à l'aide d'une oxydation induite par TEMPO sont illustrées sur les Fig. 4c et d. Pour caractériser davantage ces SN, des membranes d'environ 50 m d'épaisseur ont été coulées en utilisant une méthode d'évaporation de solvant. Les membranes de soie optiquement transparentes (transmission supérieure à 75 %) ont été évaluées à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis (de 350 à 800  nm) (Fig. 4e).

Tests de morphologie et de propriétés des SN, CN et ChN. Observation en microscopie électronique à transmission (MET) des résultats a BS et b AS nanofibres qui se sont oxydées par addition de 10 mM/g de protéine NaClO, c nanofibres de cellulose (CN) et d nanofibres de chitine (ChN) obtenues par oxydation induite par TEMPO. La barre d'échelle est de 500  nm. e Transmission UV-Vis de membranes d'environ 50 m d'épaisseur moulées par des nanofibres BS, AS, de cellulose (CN) et de chitine (ChN). f Courbes de contrainte-déformation représentatives de membranes d'environ 50 m d'épaisseur moulées par des nanofibres BS, AS, CN et ChN. g Module de Young des membranes coulées à partir de nanofibres BS, AS, CN et ChN. Les données représentent l'écart-type moyen (n = 5). h –k L'angle de contact avec l'eau de la membrane coulée par f Les nanofibres BS étaient de 58,8 ± 1,5°, significativement réduites par rapport à celle de la membrane BS régénérée (71,0 ± 0,3°, l'image en médaillon). 55,7 ± 0,5, 40,3 ± 1,1 et 52,5 ± 0,6° d'angle de contact avec l'eau ont été présentés dans les membranes AS, CN et ChN, respectivement

Les nanofibres obtenues à partir de cette méthode de réduction des effectifs ont conservé une structure hautement cristalline et un rapport d'aspect élevé. En conséquence, ces membranes ont présenté des propriétés mécaniques robustes (Fig. 4g) avec des modules d'Young de 4,51 ± 0,71 et 4,43 ± 0,23 GPa pour BS et AS, respectivement, qui étaient comparables à ceux des membranes CN et ChN (la souche représentative et les courbes de contraintes sont données à la Fig. 4f). De plus, les propriétés de mouillage de la membrane BS ont été significativement améliorées dans la membrane régénérée en raison de l'introduction de groupes carboxyle. Comme le montre la figure 4h, l'angle de contact avec l'eau de la membrane de coulée de nanofibres BS est de 58,8  ± 1,5°, tandis que la membrane BS régénérée (l'image en médaillon de la figure 4h) est de 71,0 ± 0,3°. De plus, 55,7 ± 0,5, 40,3 ± 1,1 et 52,5 ± 0,6° d'angle de contact avec l'eau ont été présentés dans les membranes AS (Fig. 4i), CN (Fig. 4j) et ChN (Fig. 4k), respectivement.

Les dispositifs CN et ChN et en soie ont tous deux été largement appliqués dans la science des matériaux depuis des décennies [13, 30, 31], en raison de leur robustesse mécanique, de leur plasticité de traitement et de leurs propriétés biochimiques, etc. matériaux à base de protéines. On s'est donc demandé comment leurs différences régulaient la formation des nanofibres. Les dispersions BS et AS correctement dispersées avaient un potentiel zêta de - 39,5 ± 0,66 et - 37,4 ± 2,4 mV, respectivement, dans des conditions neutres. Les répulsions électrostatiques entre les groupes carboxyle s'opposent à l'adhésion entre les interfaces micro-/nano-fibrilles de soie; ainsi, ces nanofibres se sont dispersées en phase aqueuse de manière homogène. Fait intéressant, lorsque le pH diminuait, le H ⁺ blindé les surfaces chargées négativement conduisant à l'agrégation des nanofibres, comme le montrent les figures 5a et b. Les agrégats des SN pourraient être redispersés dans l'eau en ajustant le pH> 7, ou ils pourraient être facilement collectés après centrifugation puis redispersés avec une légère agitation. Les graphiques du bas de la figure 5 montrent le poids restant des agrégats de SN collectés dans différentes conditions de pH. Pour le BS, 80,1 ± 1,7 et 90,9 ± 2,2 % en poids (85,7 ± 2,2 et 93,6 ± 1,5 % en poids pour AS) des agrégats ont été récupérés à pH 5 et 3, respectivement. Pendant ce temps, ce processus a concentré les SN d'environ 100 fois (~ 20 % en poids) par rapport à la dispersion initiale, avec une concentration de ~ 0,2 % en poids. Cette propriété fascinante des SN a été attribuée à (i) la réponse pH intrinsèque des matériaux à base de protéines et (ii) la flexibilité des SN de matière molle pendant les processus d'agrégation et de redispersion. Le phénomène d'agrégation-redispersion a suggéré une application prometteuse de ces SN en tant que vecteurs de chargement et de libération de médicaments. De plus, il n'a pas été contesté que les SN résultants sont bien appropriés pour le stockage et le transport.

Processus de redispersion des SN. Photographie du phénomène de réponse du pH pour a BS et b AS nanofibres. Plus de 80 % en poids des protéines (à la fois BS et AS) restaient après centrifugation, avec une teneur en protéines de ~ 20 % en poids

Conclusions

En résumé, des nanofibres individuelles dispersées BS et AS ont été obtenues après oxydation de NaClO. L'approche était similaire à l'oxydation des polysaccharides médiée par TEMPO pour préparer des nanofibres ; cependant, les catalyseurs TEMPO/NaBr n'étaient pas nécessaires. Les SN tels que préparés avaient un diamètre d'environ 110  nm et plusieurs microns de long, avec des surfaces chargées négativement. Des propriétés de mouillage optiquement transparentes, mécaniquement robustes et améliorées ont été obtenues dans les membranes SN. En particulier, les SN pouvaient être concentrés à ~ 20 % en poids en abaissant le pH, et ces SN ressemblant à de la pulpe étaient redispersables dans des solutions aqueuses neutres. Sur la base de ces résultats, les SN sont un excellent candidat pour la science des matériaux et les applications biomédicales.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié.

Abréviations

AS :

Antheraea pernyi soie

BS :

Bombyx mori soie

ChN :

Nanofibre de chitine

CN :

Nanofibre de cellulose

SEM :

Microscopie électronique à balayage

SN :

Nanofibre de soie

TEM :

Microscopie électronique à transmission

XRD :

Diffraction des rayons X