Biocapteur de cortisol électrochimique salivaire basé sur des nanoflocons de disulfure d'étain

Introduction

Le cortisol, une hormone stéroïde, est sécrété par le système hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA). C'est un biomarqueur bien connu du stress psychologique et donc appelé « hormone du stress » [1, 2]. Les niveaux de cortisol suivent un rythme circadien sur un cycle de 24 heures; les niveaux les plus élevés sont observés tôt le matin, et les niveaux diminuent progressivement la nuit [3,4,5,6]. Des niveaux excessifs de cortisol peuvent provoquer la maladie de Cushing, avec des symptômes d'obésité centrale, de stries violettes et de faiblesse musculaire proximale. Cependant, des niveaux réduits de cortisol peuvent conduire à la maladie d'Addison, avec fatigue chronique, malaise, anorexie, hypotension orthostatique et hypoglycémie [7,8,9]. Par conséquent, le maintien d'un équilibre approprié du cortisol est essentiel pour la santé humaine.

Un intérêt croissant pour la mesure du cortisol en tant que précurseur d'événements médicalement et psychologiquement pertinents s'est développé, parmi lesquels l'affection la plus récente est le trouble de stress post-traumatique (SSPT). L'importance de la fonction aberrante de l'axe HPA dans le SSPT est incontestable ; par conséquent, les méthodes d'évaluation traditionnelles sont toujours en mesure de fournir des preuves et des informations abondantes [10,11,12,13,14]. Récemment, de nombreuses études ont rapporté l'importance de la détection du cortisol et ont identifié des corrélations avec différentes maladies [15,16,17,18]. Diverses études ont confirmé que le cortisol est lié aux troubles du spectre autistique [19], à la dépression [20], aux idées suicidaires [21], à l'adversité infantile et aux troubles d'extériorisation [22].

Bien que l'identification des niveaux de cortisol représente un outil de diagnostic important, les techniques de routine de détection du cortisol en laboratoire telles que la chromatographie [23, 24], le dosage radio-immunologique [25], le dosage immunologique électrochimioluminescent [26, 27, 28], le dosage immuno-enzymatique [28, 29 ]. Par conséquent, il existe actuellement un besoin pour une détermination sensible, efficace et en temps réel des niveaux de cortisol.

Ces dernières années, les méthodes de dosage immunologique électrochimique, qui reposent sur la reconnaissance moléculaire spécifique entre les antigènes et les anticorps, sont devenues une technologie prometteuse en raison de caractéristiques importantes, telles que l'utilisation de dispositifs simples, une analyse rapide, des tests POC à faible coût et sans marquage, sensibilité élevée et seuils de détection bas du cortisol dans les biofluides [34, 35]. Les changements de potentiel électrique sont attribués aux variations de la concentration des réactions redox électrochimiques à l'électrode. Le cortisol sécrété finit par pénétrer dans le système circulatoire et peut être trouvé dans divers biofluides tels que le liquide interstitiel [36], le sang [37], l'urine [38], la sueur [39] et la salive [40]. Les avantages de la détection électrochimique du cortisol salivaire, qui est une méthode non invasive, avec une collecte, une manipulation et un stockage faciles des échantillons, ont amélioré son potentiel d'application dans les capteurs POC pour la mesure en temps réel [41].

Un biocapteur idéal doit avoir des limites de détection basses, une sélectivité rapide et une sensibilité élevée. Afin de fabriquer un immunocapteur, la matrice d'immobilisation choisie doit posséder une fonctionnalité de surface élevée, une charge biomoléculaire élevée et une faible résistance au transport d'électrons, avec un taux de transfert d'électrons élevé [42]. Cependant, les nanomatériaux de sulfure métallique ont rarement été suggérés pour l'immobilisation de protéines pour la biodétection électrochimique. Par conséquent, ici, le disulfure d'étain a été sélectionné comme matrice d'immobilisation potentielle pour le développement d'immunocapteurs afin de détecter le cortisol présent dans la salive.

Les matériaux nano-bidimensionnels (2D) ont suscité de nombreux intérêts de recherche au cours de la dernière décennie. Il existe une variété de types de matériaux 2D allant du semi-conducteur au métal et de l'inorganique à l'organique [43,44,45,46] et composites connexes [47,48,49,50]. La découverte, la fabrication et l'enquête sur le matériau nano 2D sont des courants dominants dans divers domaines. Disulfure d'étain nano 2D (SnS₂ ), un semi-conducteur de type n avec une bande interdite de 2,18 à 2,44 eV [51, 52], se compose d'atomes de Sn pris en sandwich entre deux couches d'atomes de soufre (S) disposés de manière hexagonale et étroitement disposés, avec des couches S adjacentes liées par de faibles van der Forces de Waals [53]. En raison de ses propriétés électriques intrigantes, de sa mobilité élevée des porteurs, de sa bonne stabilité chimique, de son faible coût et de ses propriétés optiques [54], SnS₂ est devenu un matériau prometteur pour diverses applications dans les cellules solaires et les dispositifs optoélectroniques [55, 56], comme les électrodes dans les batteries lithium-ion [57, 58], les capteurs de gaz et les glucomètres [59, 60]. Le choix du matériau de l'électrode est un facteur clé important pour améliorer les performances en fournissant une grande zone de réaction et un microenvironnement favorable pour faciliter le transfert d'électrons entre l'enzyme et la surface de l'électrode.

Dans ce travail, des biocapteurs ont été fabriqués en utilisant SnS₂ comme matrice d'immobilisation pour détecter le cortisol. Les résultats des études de voltamétrie pulsée différentielle (DPV) liées à la détection électrochimique montrent une sensibilité élevée de 0,0103 mA/Mcm ² et la concentration de détection la plus faible de 100 pM.

Matériaux et méthodes

Matériaux

Hydrocortisone (cortisol), anticorps anti-cortisol de lapin (anti-cortisol, C-M_ab ), l'hexacyanoferrate de potassium (II), l'hexacyanoferrate de potassium (III), le -estradiol, la testostérone, la progestérone et la corticostérone ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). L'albumine de sérum bovin (BSA) a été obtenue auprès de PanReac. Chlorure d'étain (IV) pentahydraté (SnCl₄ ^. 5H₂ O) et le thioacétamide (C₂ H₅ NS) ont été fournis par Showa (Japon) et Alfa Aesar (Royaume-Uni). Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préparée avec NaCl, KCl, Na₂ HPO₄ , et KH₂ Bon de commande₄ ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich. L'alumine micropolie provient de Buehler (Royaume-Uni). Tous les autres produits chimiques étaient de qualité analytique et ont été utilisés sans autre purification. Le kit Cortisol Saliva ELISA (Cat # SA E-6000) a été acheté auprès de LDN (Allemagne).

Synthèse du disulfure d'étain

Poudres de SnCl₄ ·5H₂ O et C₂ H₅ Les NS ont été mélangés dans 70 ml d'eau déminéralisée et le pH ajusté à 7,4. Un réacteur autoclave hydrothermal contenant les réactifs a été chauffé de la température ambiante à 200 ^° C en 1 h, et maintenu à 200 ^° C pendant 11 h. Ensuite, le SnS₂ résultant la poudre a été lavée avec de l'eau déminéralisée et de l'éthanol à 6000 rpm pendant 15 min, et enfin séchée à l'air à 80 ^° C. Cette méthode hydrothermale a été appliquée avec succès pour la synthèse de SnS₂ .

Caractérisation des matériaux

La diffraction des rayons X (XRD, PANalytical, Pays-Bas) a été utilisée pour étudier la phase cristalline du SnS hexagonal 2D₂ flocons. La microscopie électronique à balayage à émission de champ multifonctionnelle (FE-SEM, Zeiss, Allemagne) a été utilisée pour imager la morphologie de surface des matériaux. La microscopie électronique à transmission par canon à émission de champ (FEG-TEM, Tecnai, USA) a été utilisée pour discerner la microstructure de SnS₂ , et la diffraction de zone sélectionnée (SAED, Tecnai) a été utilisée pour obtenir des motifs cristallins.

Fabrication de BSA/C-M_ab /SnS₂ /Biocapteurs GCE

Les électrodes de carbone vitreux (GCE) ont d'abord été polies avec une suspension d'alumine, puis des gouttes d'un mélange de 5 M SnS₂ ont été déposés à la surface des GCE prétraités. Des solutions d'anticorps anti-cortisol (1 mg/mL) et de BSA (1%) ont été préparées en PBS. SnS₂ /GCE a ensuite été décoré avec les solutions d'anticorps et de BSA en séquence. Le BSA/C-M_ab fabriqué /SnS₂ Les biocapteurs /GCE ont été conservés au réfrigérateur à 4 ^° C lorsqu'il n'est pas utilisé. Le concept de recherche et la configuration du système de détection sont illustrés à la Fig. 1.

Concept de recherche et mise en place du système de détection

Analyse électrochimique

BSA/C-M_ab fabriqués /SnS₂ /GCEs ont été caractérisés en utilisant la spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS) et la voltamétrie cyclique (CV) pour comparer leurs comportements électroactifs. Des études de réponse électrochimique en fonction de la concentration de cortisol ont été menées en utilisant le CV et la voltampérométrie différentielle (DPV). Toutes les expériences ont été réalisées en utilisant un système à trois électrodes avec un GCE comme électrode de travail, un fil de Pt comme électrode auxiliaire et une électrode au calomel saturé comme électrode de référence dans du PBS 10 mM (pH 7,4) contenant 5 mM Fe(CN )₆ ^3-/4- . Les mesures électrochimiques ont été effectuées sur une station de travail électrochimique de la série modèle CHI6114E (CH Instruments, USA). Les mesures CV et DPV ont été effectuées entre − 0,4 V et 1,0 V à une vitesse de balayage de 10 mV/s, sauf indication contraire.

Collecte d'échantillons de salive et détection électrochimique

Un échantillon de salive (2 ml) a été prélevé sur deux sujets volontaires sains vers midi pour valider le BSA/C-M_ab développé /SnS₂ /GCE. Des échantillons de salive ont été obtenus sans aucune filtration et initialement stockés à - 20 °C pour maintenir les caractéristiques biologiques. Avant la détection, les échantillons de salive ont été décongelés à température ambiante et centrifugés à 3 500 tr/min pendant 15 min pour collecter le surnageant pour la mesure. La salive séparée a été conservée à - 20 °C. Le BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE a été utilisé pour la détection électrochimique des concentrations de cortisol dans des échantillons de salive. La détection du cortisol par analyse électrochimique avec le BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE a été comparé à celui du kit de cortisol ELISA disponible dans le commerce mentionné ci-dessus.

Étude sur les interférences

L'effet inhibiteur d'agents de confusion potentiels, tels que d'autres hormones stéroïdes, sur la BSA/C-M_ab /SnS₂ La spécificité /GCE a été étudiée en plaçant le biocapteur dans les différentes solutions suivantes :100 nM de β-estradiol, 100 nM de testostérone, 100 nM de progestérone et 100 nM de corticostérone, pendant 10 min puis scanné par CV. Le taux de balayage était de 10 mV/s et la plage de balayage était de − 0,4 V à 0,6 V.

Détection du cortisol salivaire par ELISA

Un ELISA a été réalisé sur les échantillons de salive selon le protocole du fabricant. Pour établir une courbe d'étalonnage pour les mesures de cortisol, le dosage a été effectué dans une plaque de titrage à 96 puits contenant six concentrations de cortisol standard connues (0,0, 0,1, 0,4, 1,7, 7,0 et 30 ng/mL) pour déterminer l'absorbance de chaque puits à 450 nm. La courbe d'étalonnage a été équipée d'une ligne de tendance pour obtenir une équation pour le calcul des échantillons inconnus.

Résultats et discussion

Analyse matérielle du SnS₂

Comme le montre le motif XRD de la figure 2a, le produit tel que synthétisé n'affiche que les pics XRD correspondant à la phase hexagonale SnS₂ (carte JCPDS n° 89-2358). La figure 2b, c illustre les images FE-SEM du SnS₂ tel que synthétisé ayant une morphologie de type flocon uniforme avec une taille d'environ 300 nm. La figure 2d–f montre les images FEG-TEM et SAED de SnS₂ , dans lequel des espacements de franges de réseau de 0,167 nm et 0,316 nm sont identifiés pour le SnS hexagonal₂ comme une structure cristalline unique. L'empilement des nanoflocons est inférieur à 10 couches avec une épaisseur totale inférieure à 10 nm.

un Modèle XRD de SnS₂ . Images FE-SEM de SnS₂ les nanoflocons ont été pris à des grossissements de (b ) × 250 000 et (c ) × 100 000. d Images FEG-TEM de SnS₂ nanoflocons. e FEG-TEM en coupe de SnS₂ nanoflocons et image FEG-TEM agrandie. f Image SAED de SnS₂ nanoflocons

Réponses électrochimiques de l'électrode

Le courant d'oxydation peut augmenter considérablement par l'ajout de disulfure d'étain. Comme le montre la Fig. 3a, b, l'amplitude du courant d'oxydation réduit de SnS₂ /GCE à C-M_ab /SnS₂ /GCE, suivi de BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE, à mesure que la valeur de résistance de transfert de charge augmente. Par conséquent, les résultats indiquent que les propriétés du capteur ont été modifiées sur l'électrode. Initialement, BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE a été étudié en faisant varier la vitesse de balayage de 10 mV/s à 100 mV/s, comme le montre la figure 3c. Le changement de réponse en courant avec la vitesse de balayage, comme représenté sur la figure 3d, montre que le courant d'oxydation augmente linéairement avec la vitesse de balayage et suit la relation :I =0,5156 υ–0,0319 (R ² =0,9985) en oxydation, et I =0,6758υ–0,0288 (R ² =0,9997) en réduction. Cependant, la quasi-linéarité de l'augmentation du courant de crête avec l'augmentation de la vitesse de balayage avec des pics redox bien définis indique un processus contrôlé en surface, avec un transfert d'électrons stable.

un Etude de la réponse CV de l'électrode GCE (courbe a), SnS₂ Électrode /GCE (courbe b), C-M_ab /SnS₂ Électrode /GCE (courbe c), BSA/C-M_ab /SnS₂ /Electrode GCE (courbe d). b Etude de réponse EIS du GCE, SnS₂ /GCE, C-M_ab /SnS₂ /GCE et BSA/C-M_ab /SnS₂ /Électrodes GCE. En médaillon :le circuit équivalent correspondant. c Amplitude accrue du courant de réponse d'oxydation de BSA/C-M_ab /SnS₂ Électrode /GCE avec une vitesse de balayage augmentée de 10 mV/s à 100 mV/s. d L'amplitude du courant augmente avec l'augmentation de la vitesse de balayage. e CV études de BSA/C-M_ab /SnS₂ Electrode /GCE en fonction de la concentration en cortisol variant de 100 pM à 100 µM. f Courbe de linéarité pour la réponse actuelle avec différentes concentrations de cortisol. g Études DPV de BSA/C-M_ab /SnS₂ Electrode /GCE en fonction de la concentration en cortisol variant de 100 pM à 100 µM. h Courbe de linéarité pour la réponse actuelle avec différentes concentrations de cortisol

Le courant diminuait avec l'augmentation de la concentration de cortisol dans la plage de 100 pM à 100 M. La différence de courant est directement corrélée à la concentration de cortisol détectée. Les valeurs actuelles et les pics d'oxydation bien séparés ont été obtenus pour BSA/C-M_ab /SnS₂ /électrodes GCE, comme le montre la Fig. 3e, f. Le changement de courant avec le log de la concentration était presque linéaire. Il est clair que la réduction du coefficient de régression linéaire est meilleure pour CV. Par conséquent, d'autres mesures ont été effectuées avec une DPV plus spécifique et plus précise. Les résultats de ces études DPV ont indiqué que l'amplitude de la réponse actuelle diminuait avec l'ajout de cortisol, comme illustré sur la figure 3g. Une courbe d'étalonnage présentée sur la figure 3h trace l'amplitude de la réponse actuelle et le logarithme de la concentration de cortisol, et s'est avérée être linéairement dépendante et suivre l'équation :y =− 0,0103x + 0,0443 ; R ² =0.9979. Ce capteur présentait une plage de détection comprise entre 100 pM et 100 μM, avec une limite de détection de 100 pM et une sensibilité de 0,0103 mA/Mcm ² (R ² =0,9979).

Étude de stabilité de stockage

Des études CV ont également été réalisées pour étudier la durée de conservation du BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE à des intervalles de 1 jour à 1 semaine. Afin de comparer deux conditions de conservation, une condition était de stocker les électrodes séchées sous vide, tandis que l'autre était de stocker les électrodes à 4°C. La stabilité du pic redox des électrodes à 4 °C et sous vide est illustrée sur les figures 4a, c, respectivement. Il est clair que les conditions de conservation à 4°C étaient meilleures que celles sous vide. La figure 4b, d montre que la valeur de stabilité des électrodes était de 82 % avec les électrodes stockées sous vide pendant 7 jours, tandis que la valeur de stabilité des électrodes était de 91 % avec les électrodes stockées à 4 ° C. On peut observer que la stabilité des électrodes stockées à 4°C était plus élevée que celle sous vide. La perte d'activité de l'électrode a peut-être été causée par la dégradation de l'activité des anticorps du cortisol sous vide. La stabilité au stockage est un enjeu crucial pour les capteurs enzymatiques. Un revêtement protecteur peut être introduit dans la future conception de l'électrode.

Stabilité du pic redox de BSA/C-M_ab /SnS₂ Électrode /GCE avec différentes conditions de conservation (a et b ) sous vide (c et d ) à 4 °C pendant 7 jours

Étude sur les interférences

Les résultats des études CV de BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE pour mesurer les agents de confusion potentiels, tels que le β-estradiol (100 nM), la testostérone (100 nM), la progestérone (100 nM) et la corticostérone (100 nM) par rapport au cortisol (10 nM), sont illustrés à la Fig. 5a. Par rapport au changement de la réponse du signal du cortisol, les effets des interférences étaient inférieurs à 5 % du résultat pour le cortisol, ce qui suggère que de telles interférences potentielles peuvent être commodément négligées.

un Étude d'interférence impliquant le β-estradiol (100 nM), la testostérone (100 nM), la progestérone (100 nM) et la corticostérone (100 nM) par rapport au cortisol (10 nM). b Comparaison des mesures du cortisol salivaire par ELISA et méthodes électrochimiques

Détection du cortisol salivaire par ELISA et méthodes électrochimiques

Mesures d'échantillons de cortisol salivaire réalisées avec ELISA et le BSA/C-M_ab /SnS₂ Les électrodes /GCE sont résumées dans le tableau 1 et la figure 5b. Les concentrations de cortisol déterminées par ELISA étaient de 1,105 ×10 ⁻⁸ M et 3,998 × 10 ⁻⁹ M. Les résultats calculés du cortisol à l'aide d'une mesure électrochimique étaient de 1,046 × 10 ⁻⁸ M et 3,911 × 10 ⁻⁹ M. Une bonne corrélation a été obtenue avec ces deux techniques, présentant des résultats comparables avec seulement une différence de 2 à 5 %. Par conséquent, les résultats démontrent que ce BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE peut être utilisé pour la détection électrochimique du cortisol dans des fluides biologiquement pertinents tels que la salive.

Comparaison avec d'autres études

Les résultats de cette étude ont été comparés à d'autres études impliquant des capteurs électrochimiques de cortisol salivaire rapportés dans la littérature afin de mieux comprendre les performances de ce BSA/C-M_ab /SnS₂ /GCE. Les tableaux 2 et 3 présentent des comparaisons de résultats obtenus en utilisant des électrodes sans or dans la détection du cortisol. Le présent travail présente trois avantages principaux. Premièrement, les matériaux sont beaucoup moins coûteux que les dispositifs présentés dans d'autres études. Deuxièmement, le processus de préparation était relativement simple et rapide. Enfin, la limite de détection était similaire à celle rapportée dans d'autres publications ou même meilleure que celles rapportées, tandis que la plage de détection cible pour le cortisol salivaire est facilement obtenue.

Conclusions

Une méthode hydrothermale a été appliquée avec succès pour la synthèse de SnS₂ . Les propriétés de SnS₂ ont été caractérisés par XRD, FE-SEM, FEG-TEM et SAED. Les réponses électrochimiques de l'électrode en fonction des concentrations de cortisol ont été déterminées en utilisant CV et DPV. Notre capteur de cortisol présentait une plage de détection de 100 pM à 100 μM, une limite de détection de 100 pM et une sensibilité de 0,0103 mA/Mcm ² (R ² =0,9979). Les paramètres de détection obtenus étaient dans des plages physiologiques normales. L'impact des interférences potentielles était inférieur à 5%, indiquant une bonne spécificité de ce capteur. Les tests de stabilité ont démontré que l'activité du capteur stocké à 4 °C était meilleure que sous vide. Les résultats de cette électrode pour la mesure du cortisol dans les échantillons de salive étaient cohérents avec ELISA. Par conséquent, l'analyse électrochimique utilisant ce BSA/C-M_ab /SnS₂ L'électrode /GCE peut remplacer les approches de dosage immunologique plus longues et plus traditionnelles.

Disponibilité des données et des matériaux

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié.

Abréviations

2D :

Bidimensionnel

BSA :

Sérum albumine bovine

C-M_ab :

Anticorps cortisol

CV :

Voltamétrie cyclique

DPV :

Voltamétrie différentielle à impulsions

EIS :

Spectroscopie d'impédance électrochimique

ELISA :

Dosage immuno-enzymatique

FEG-TEM :

Microscope électronique à transmission par canon à émission de champ

FE-SEM :

Microscope électronique à balayage à émission de champ

GCE :

Électrodes en carbone vitreux

HPA :

Hypothalamo-hypophyso-surrénalien

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

POC :

Point de service

TSPT :

Trouble de stress post-traumatique

SAED :

Diffraction de zone sélectionnée

XRD :

Diffraction des rayons X