Livraison d'ARNsi à base de micelles cationiques pour une thérapie génique efficace contre le cancer du côlon

Introduction

Le cancer est un problème majeur de santé publique mondiale. Le cancer du côlon est une tumeur maligne courante, touchant chaque année plus d'un million de personnes dans le monde [1]. La thérapie génique a été appliquée pour servir de méthode de traitement des tumeurs solides et des tumeurs sanguines [2, 3]. La clé de la thérapie génique du cancer dépend du système de délivrance de gènes sûr et efficace [4, 5]. Les vecteurs non viraux, y compris les lipides cationiques, les nanoémulsions lipidiques, les nanoparticules lipidiques solides et les vecteurs à base de polymères ont attiré plus d'attention que les vecteurs viraux pour leurs avantages potentiels dans la délivrance de gènes :faciles à préparer, provoquant moins de réponse immunitaire, possédant une toxicité plus faible et meilleure biocompatibilité [6, 7]. La nanotechnologie fournit un nouveau moyen pour l'étude des vecteurs non viraux avec des avantages tels que la biocompatibilité, la biodégradabilité, la sécurité et la capacité de ciblage, etc. [2, 8]. Dans ce document, un grand nombre de porteurs de nanoparticules qui ont une charge positive élevée peuvent se combiner avec le médicament à base d'acide nucléique anionique par effet de charge électrique, montrant une perspective d'application large et brillante en thérapie génique [9, 10].

En tant que type de copolymère polymère, possédant une biodégradabilité et une biocompatibilité, les copolymères PEG/PCL présentent des applications prometteuses dans les systèmes d'administration de médicaments [11,12,13]. Sur la base des micelles MPEG-PCL, nous avons utilisé le DOTAP amphiphile pour modifier le copolymère MPEG-PCL en une seule étape, créant les micelles hybrides DOTAP et MPEG-PCL (DMP) auto-assemblées cationiques [14,15,16,17]. Ces micelles présentent une perspective prometteuse dans l'administration de médicaments chimiques et de médicaments géniques avec une stabilité et une sécurité excellentes. Par exemple, le DMP a été utilisé pour délivrer le gène suicide survivinT34A et la curcumine pour le traitement du cancer du côlon [14, 18]. Cependant, les études précédentes se limitaient à la transmission de l'ADN plasmidique, et il n'y avait aucun rapport concernant l'administration de micelles DMP pour d'autres formes de thérapie génique jusqu'à présent, ce qui limitait l'application des micelles DMP en thérapie génique.

L'interférence génétique basée sur l'ARNsi est également un élément essentiel de la thérapie génique autre que les gènes thérapeutiques de l'ADN plasmidique. En tant que membre essentiel du gène-médicament, l'ARNsi est une petite molécule d'ARN double brin. Les médicaments anticancéreux à ARNsi utilisent des mécanismes d'ARNi endogène pour faire taire l'expression des oncogènes. En raison d'avantages significatifs tels qu'une stabilité améliorée et une efficacité de silençage, l'ARNsi a le potentiel d'être développé dans des applications thérapeutiques contre le cancer [19]. Par rapport au poids moléculaire élevé de l'ADN plasmidique, l'ARNsi a une efficacité de transfection plus élevée, ce qui est particulièrement adapté au point de ciblage génique spécifique de la thérapie génique. Ainsi, cela pourrait être un bon choix pour la thérapie génique. Actuellement, plusieurs médicaments de traitement siRNA basés sur des vecteurs non viraux ont été testés dans des essais cliniques, tels que CALAA-01 basé sur des nanoparticules de polypolymère de cation cyclodextrine et ALN-TTR02 basé sur des lipides [2]. Cependant, la thérapie génique basée sur le siRNA est toujours nécessaire pour développer un nouveau point de ciblage du siRNA et rechercher des vecteurs de livraison sûrs, efficaces et hautement spécifiques du siRNA.

Dans cette étude, nous avons tenté d'utiliser des micelles DMP pour délivrer des siARN afin d'étudier l'efficacité et la sécurité des micelles DMP pour délivrer des siARN. Nous avons utilisé l'ARNsi Bcl-xl et l'ARNsi Mcl1 comme cible thérapeutique, en recherchant leur effet antitumoral pour le traitement du cancer du côlon in vitro et in vivo. Le gène Bcl-xl et le gène Mcl1 sont membres de la famille Bcl-2 du gène anti-apoptotique, et ils ont joué un rôle vital dans l'inhibition de l'apoptose [20, 21]. Nous supposons que les micelles synthétiques de DMP peuvent délivrer efficacement et en toute sécurité les siARN Bcl-xl et Mcl1. L'ARNsi Bcl-xl et l'ARNsi Mcl1 peuvent inhiber l'expression du gène Bcl-xl et du gène Mcl1, induisant l'apoptose des cellules C26 et obtenant ainsi un effet thérapeutique en inhibant la croissance des cellules C26.

Matériaux et méthode

Matériaux

Le méthylsulfate de N-[1-(2,3-dioléoyloxy)propyl]-N,N,N-triméthylammonium (DOTAP) a été acheté auprès d'Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Un copolymère dibloc MPEG-PCL avec un poids moléculaire conçu de 4000 a été synthétisé selon nos rapports précédents [22]. Le Mn du copolymère MPEG-PCL était de 4050. Le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et le bromure de 3-(4,5-diméthythiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium (MTT) ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich (USA ) et utilisé sans autre purification. Le dichlorométhane et d'autres solvants organiques ont été achetés auprès de ChengDu Kelang Chemical Co., Ltd. (Chengdu, République populaire de Chine). Des cellules C26 (adénocarcinome du colon murin) et des cellules 293 T (HEK 293 T/17) ont été achetées auprès de l'American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Les cellules ont été cultivées dans du DMEM additionné de 10% de sérum de veau foetal, incubées à 37°C avec 5% de CO₂ -atmosphère d'air humidifié.

Préparation des micelles DMP

Pour sélectionner un meilleur processus de préparation de DMP, les micelles de DMP ont été préparées dans trois solvants organiques, chaque solvant avec trois dosages différents de DOTAP. En ce qui concerne le solvant, le dichlorométhane, le chloroforme et l'acétate d'éthyle ont été choisis pour étudier, et les dosages de DOTAP comprenaient 5 mg, 10 mg et 20 mg. Le DOTAP et le MPEG-PCL ont été co-dissous dans le solvant organique puis évaporés par une pompe à vide pour former un film séché. Le film séché a ensuite été réhydraté dans de l'eau distillée. Enfin, les micelles de DMP préparées ont été conservées à 4 °C.

Caractérisation des micelles DMP

La taille des particules et le potentiel zêta des micelles DMP ont été déterminés par un calibreur Zeta Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, Royaume-Uni) et maintenus à 25 °C pendant le processus de mesure. Tous les résultats étaient la moyenne de trois passages. La stabilité des micelles de DMP a été évaluée qualitativement. Des agrégats de micelles de DMP ont été examinés à l'œil nu. La présence de précipitations a indiqué l'instabilité des micelles de DMP, tandis qu'une solution uniformément transparente suggère la stabilité.

Retardateur de gel

Les siRNA Scramble délivrés par DMP (DMP/Scramble siRNA) ont été mélangés avec 2 L de tampon de charge, chargés dans du gel d'agarose à 1% et séparés par électrophorèse à 140 V pendant 10 min. 0,2 µg de siRNA Scramble ont été combinés avec 1, 2, 3, 4, 5 et 6 µg de micelles DMP. Le gel a été coloré avec la visionneuse d'or, et les bandes correspondant au siRNA Scramble ont été visualisées sous une lumière UV.

Cytotoxicité des micelles DMP

La cytotoxicité des micelles de DMP sur les cellules 293 T et les cellules C26 a été évaluée par la méthode MTT. Brièvement, des cellules 293T et des cellules C26 ont été étalées à une densité de 1,2 × 10 ³ cellules par puits dans 100 μL de milieu DMEM contenant 10 % de FBS (sérum bovin fœtal) en plaque 96 puits et cultivées pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été exposées à une série de micelles DMP ou PEI25K à différentes concentrations pendant 72 heures. La viabilité des cellules a été mesurée en utilisant un test MTT. Les résultats étaient la moyenne de six tests.

Transfection in vitro

Vingt-quatre heures avant la transfection, les cellules C26 ont été ensemencées dans une plaque de 24 puits à une densité de 5 × 10 ⁴ cellules par puits dans 0,5 µmL de milieu DMEM contenant 10 % de FBS (sérum bovin fœtal). Au moment de la transfection, le milieu dans chaque puits a été remplacé par un milieu de 0,5  mL contenant 0 %, 10 %, 20 % et 30 % de FBS et des siRNA FAM (Carboxyfluorescéine) délivrés par DMP (siRNA DMP/FAM) et PEI- Les siRNA FAM délivrés (PEI/FAM siRNA) contenant 1 µg de siRNA dans un milieu sans sérum ont été pipetés dans chaque puits, et le rapport de masse des siRNA DMP/FAM et PEI25K/FAM siRNA était de 30:1 et 2:1. Vingt-quatre heures plus tard, les cellules transférées ont été observées au microscope et l'activité luciférase a été mesurée par cytométrie en flux (Epics Elite ESP, USA)

In vivo silençage génique

La souris ciblant l'ARNsi Bcl-xl, Mcl1-1, l'ARNsi Scramble et l'ARNsi de contrôle négatif marqué au FAM ont été achetés auprès de GenePharma Co., Ltd (Shanghai, République populaire de Chine) sous une forme non protégée, dessalée et recuite.

Pour déterminer le niveau d'ARNm Bcl-xl, l'ARN total a été extrait des cellules C26 à l'aide du réactif TRIzol™ (Thermo Fisher Scientific, États-Unis), et des ADNc individuels ont été synthétisés avec un test de transcriptase inverse SuperScript II (Invitrogen). La PCR quantitative en temps réel a été réalisée avec un kit PCR quantitative SuperMix Universal SYBR GreenER (Invitrogen). Les amorces PCR ont été synthétisées par TSINGKE Biological Technology (Chengdu, R.P. Chine).

Etude anti-prolifération

Les capacités anti-prolifération des cellules DMP/siBcl-xl et DMP/siMcl1 à C26 ont été évaluées par la méthode MTT. Brièvement, les cellules C26 ont été étalées à une densité de 1,2 × 10 ³ cellules par puits dans 100 μL de DMEM contenant 10 % de FBS dans des plaques à 96 puits et cultivées pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été exposées à une série de DMP/siBcl-xl et DMP/siMcl1 à différentes concentrations pendant 72 h. La viabilité des cellules a été mesurée par la méthode MTT. Les résultats étaient la moyenne de six tests.

Etude de formation de clones

Les cellules C26 ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits à une densité de 10 ³ cellules par puits dans 2 mL de milieu DMEM contenant 10 % de FBS. Vingt-quatre heures plus tard, les cellules ont ensuite été exposées à une série de micelles DMP ou DMP/Scramble siRNA et DMP/siBcl-xl et DMP/siMcl1 à différentes concentrations. Lorsque les cellules se sont développées en un clone visible à l'œil nu, la culture a été interrompue et suivie d'un rinçage, d'une fixation et d'une coloration. Le nombre de clones a été directement compté et le taux d'inhibition a été calculé.

In vitro étude de l'apoptose

L'apoptose cellulaire a été observée via l'isothiocyanate d'annexine V-fluorescéine (FITC) et la coloration à l'iodure de propidium. En bref, les cellules C26 ont été ensemencées dans des plaques à six puits et exposées à une série de micelles DMP, DMP/Scramble siRNA, DMP/siBcl-xl et DMP/siMcl1 pendant 72 heures. Les cellules ont ensuite été soumises à une coloration à l'annexine V-FITC et à l'iodure de propidium.

Étude de xénogreffe tumorale in vivo

Des souris BALB/c âgées de 6 à 8 semaines ont été inoculées avec 5 × 10 ⁶ Cellules C26 sur le flanc droit. Des complexes DMP/siRNA équivalents à 10 μg de siRNA ont été injectés par voie intratumorale tous les deux jours pendant 5 traitements puisque le volume tumoral a atteint 100 mm ³ . Les souris recevant une quantité équivalente de solution saline normale ou de DMP ont été considérées comme groupe témoin. La taille de la tumeur a été mesurée et le poids des animaux a été contrôlé tous les 2 jours jusqu'à ce que tous les animaux soient sacrifiés. Le volume de la tumeur a été calculé comme (1/2 × longueur × largeur [2]).

Analyse histologique

Les tissus excisés ont été fixés dans une solution de formol tamponné neutre à 4% pendant plus de 24 heures et inclus dans de la paraffine. Des coupes de tissus (3 à 5 µm) ont été colorées à l'hématoxyline et à l'éosine. Cette analyse a été réalisée selon le protocole du fabricant, et les échantillons ont été examinés au microscope à fluorescence (× 400).

Un kit TUNEL disponible dans le commerce (Promega, Madison, WI) a été utilisé pour analyser les effets apoptotiques dans les tissus tumoraux de xénogreffes de mélanome de souris C26. Cette analyse a été réalisée selon le protocole du fabricant.

Analyse statistique

Les données ont été exprimées en valeur moyenne ± SD. L'analyse statistique a été réalisée avec une analyse de variance à un facteur (ANOVA) en utilisant le logiciel SPSS. Pour tous les résultats, P ≤ 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

Étude du processus de préparation

Pour obtenir une efficacité de transfection efficace et une faible cytotoxicité pour l'administration d'ARNsi, nous avons étudié différents processus de préparation des micelles de DMP, comme indiqué dans le tableau 1. Dans notre étude, concernant les solvants, les micelles de DMP préparées par l'acétate d'éthyle étaient très instables et le temps stable des micelles de DMP n'était pas plus de 10 min. Et les micelles de DMP préparées par le dichlorométhane et le chloroforme avaient toutes deux une excellente stabilité et pouvaient rester stables pendant 96 heures, à l'exception du DMP préparé par du chloroforme avec une dose de 20 mg de DOTAP. Plus important encore, ils avaient également la bonne taille, le potentiel zêta et le PDI. Cependant, en comparant l'efficacité de transfection initiale, l'efficacité de transfection des micelles DMP préparées par le dichlorométhane était supérieure à celle des micelles DMP préparées par le chloroforme. Nous avons donc sélectionné le dichlorométhane pour préparer les micelles de DMP.

Les micelles DMP préparées par trois doses de DOTAP n'avaient aucune différence apparente de taille, de potentiel zêta et de PDI, mais les micelles DMP préparées avec une dose de 20 mg de DOTAP avaient l'efficacité de transfection la plus élevée dans trois doses de DOTAP. Grâce aux comparaisons ci-dessus, nous avons sélectionné un processus de préparation basé sur DOTAP et MPEG-PCL (Fig. 1a) pour préparer des micelles DMP avec une excellente stabilité et une efficacité de transfection élevée. Le schéma de préparation des micelles de DMP est présenté sur la figure 1b.

un Structure moléculaire de DOTAP et MPEG-PCL. b Schéma de préparation des micelles DMP. c Spectre de distribution de taille des micelles de DMP. d spectre de potentiel zêta des micelles de DMP. e dosage de retardement de l'ARNsi. f Cytotoxicité des micelles de DMP sur les cellules 293T. g cytotoxicité des micelles de DMP sur les cellules C26

Caractérisation des micelles DMP

Comme présenté sur la figure 1c, le spectre de distribution de la taille des particules a indiqué que les micelles de DMP étaient nanométriques (PDI =0,315) avec une taille de particule moyenne de 144,8 nm, suggérant qu'elle avait une distribution de taille de particule très étroite. Le spectre de potentiel zêta du DMP a été présenté sur la figure 1d avec un potentiel zêta de 46,4 mV. La stabilité des micelles DMP a été évaluée qualitativement.

Pour évaluer la capacité de liaison du DMP avec l'ARNsi, un essai de retard sur gel a été effectué et les résultats ont été présentés sur la figure 1e. Lorsque le rapport de masse du DMP au siRNA était 30, un retard complet du siRNA Scramble a été obtenu. L'ARNsi anionique Scramble a été absorbé à la surface du DMP en raison d'une interaction électrostatique, formant un complexe DMP/ARNi.

La cytotoxicité des micelles de DMP sur les cellules C26 et les cellules 293T a été évaluée par la méthode MTT. Comme le montrent les figures 1f et g, PEI25K a montré une toxicité élevée sur les cellules 293T, avec IC₅₀ 0,83  μg/mL. Les micelles DMP, cependant, étaient beaucoup moins toxiques, et l'IC₅₀ de DMP était de 3,7 µg/mL. L'IC₅₀ des micelles de DMP était de 0,497  mg/mL sur les cellules C26. Cependant, PEI25K a montré une toxicité énorme, avec IC₅₀ <0,1 µg. Ainsi, les micelles de DMP avaient une cytotoxicité inférieure à celle de PEI25K et pourraient être utilisées pour délivrer des siARN aux cellules C26 en toute sécurité.

In vitro transfection

Suite à la caractérisation biophysique, nous avons comparé l'efficacité de transfection des micelles de DMP avec celle du PEI25K (agent de transfection « gold standard ») in vitro . Comme le montre la figure 2, dans un milieu contenant 0 %, 10 %, 20 % et 30 % de transfection FBS, les micelles DMP avaient une efficacité de transfection de 85,47 ± 1,01 %, 81,57 ± 2,04 %, 75,29 ± 1,20 % et 71,64 ± 1,59 % et PEI avait une efficacité de transfection de 86,38 ± 2,92 %. Il y avait peu de différence dans l'efficacité de la transfection entre le groupe sérum et le groupe sans sérum. Et les efficacités de transfection du groupe sérum et du groupe sans sérum étaient similaires à l'efficacité de transfection de la PEI. En outre, les images de la figure 2a présentent une observation directe de la capacité de transfection des micelles de DMP avec un gène rapporteur basé sur FAM. D'après la photo, la morphologie de la cave du groupe PEI avait changé par rapport aux groupes DMP, ce qui prouvait que le PEI avait une cytotoxicité élevée tandis que les micelles DMP avaient une faible cytotoxicité.

Efficacité de transfection des micelles DMP. un Image de cellules C26 transfectées (b , c ) efficacité de transfection de micelles DMP dans un milieu contenant 0 %, 10 %, 20 % et 30 % de FBS et PEI25K, compté par cytométrie en flux

Activité anticancéreuse in vitro

Dans le processus de thérapie génique, le siRNA joue un rôle essentiel. Par conséquent, nous avons conçu un siRNA ciblant Bcl-xl et un siRNA ciblant Mcl1 pour étudier leur activité anticancéreuse. Pour évaluer la capacité d'interférence des siARN Bcl-xl et Mcl1, nous avons confirmé la capacité d'interférence des siARN Bcl-xl et Mcl1 par qPCR. Selon nos résultats (Fig. 3), le niveau d'ARNm du groupe DMP/siMcl1 était inférieur à celui des groupes témoins (Fig. 3a). Et le niveau d'ARNm des groupes DMP/siBcl-xl était inférieur à celui des groupes témoins (Fig. 3b). Il a été bien démontré que le DMP/siBcl-xl et le DMP/siMCL1 réduisaient efficacement le niveau d'ARNm pertinent.

un Niveau d'ARNm de Bcl-xl évidemment réduit par DMP/siMcl1. b Niveau d'ARNm de Mcl1 évidemment réduit par DMP/siBcl-xl. c Images de la formation de clones après traitement avec DMP/siBcl-xl ou DMP/siMcl1 sous différentes concentrations. d Le nombre de clones après traitement avec DMP/siBcl-xl de différentes concentrations de siRNA. e Capacité anticancéreuse de DMP/siBcl-xl et DMP/siMcl1 avec une concentration de 50 nM et 100 nM de siRNA sur les cellules C26 in vitro. f Le taux d'inhibition de la formation de clones après traitement avec du DMP/siMcl1 de différentes concentrations de siMcl1. g le taux d'inhibition de la formation de clones après traitement avec du DMP/ siBcl-xl de différentes concentrations de siBcl-xl

De plus, des micelles de DMP ont été utilisées pour délivrer des siARN dans des cellules C26 afin d'étudier que DMP/siBcl-xl et DMP/siMcl1 peuvent inhiber la croissance des cellules C26. La viabilité des cellules C26 a été déterminée par la méthode MTT. Les résultats ont montré que les taux de survie cellulaire de DMP/siBcl-xl (50 nM et 100 nM) étaient de 69,6 % ± 3,3 % et 56,3 % ± 1,9 %, et les taux de survie cellulaire de DMP/siMcl1 (50 nM et 100 nM) étaient de 82,8 %±3,1% et 56,3%±3,2% (Fig. 3e).

Pour étudier plus avant l'activité anticancéreuse de DMP/siBcl-xl et DMP/siMcl1, un essai de formation de clones a été effectué. Il a été évidemment montré que sur les figures 3c et d, par rapport au groupe témoin, les nombres de clones dans DMP/siBcl-xl et DMP/siMcl1 (50 µnM et 100 µnM) étaient inférieurs. Ces résultats suggèrent que DMP/siBcl-xl et DMP/siMcl1 ont un effet anti-prolifération évident sur les cellules C26. Ainsi, en combinant les résultats du test MTT, les résultats ont démontré que le DMP/siBcl-xl et le DMP/siMcl1 pouvaient inhiber la prolifération des cellules C26 et avoir une activité anticancéreuse importante sur les cellules C26.

Pour déterminer si la perte de capacité de prolifération induite par DMP/siBcl-xl et DMP/siMcl1 et la viabilité cellulaire des micelles de DMP étaient associées à l'induction de l'apoptose, le nombre de cellules apoptotiques a été évalué par cytométrie en flux. Comme le montre la figure 3f, les taux d'apoptose du groupe DMP/siMcl1 étaient de 37,9 % ± 4,7 %, ce qui était supérieur à celui du groupe témoin et du groupe DMP et du groupe siRNA DMP/Scramble. Comme le montre la figure 3g, le taux d'apoptose du groupe DMP/siBcl-xl était de 33,0 % ± 3,8 %, ce qui était également supérieur à celui des autres groupes témoins. Ces données d'apoptose ont indiqué que DMP/ siMcl1 et DMP/ siBcl-xl avaient une forte capacité d'induction d'apoptose. Les résultats du test d'apoptose étaient cohérents avec les résultats du MTT et les résultats de la formation de clones décrits précédemment, suggérant que l'induction de l'apoptose est un mécanisme possible pour inhiber la prolifération et la viabilité des cellules C26.

Le complexe DMP/siRNA inhibe la croissance tumorale C26 in vivo

Un modèle animal de xénogreffe C26 a également été utilisé pour tester l'efficacité antitumorale du complexe DMP/siRNA in vivo. Les courbes de croissance tumorale et les images des tumeurs xénogreffes C26 de chaque groupe sont présentées sur les figures 4a et b. Selon nos résultats, l'injection intratumorale de DMP/siMcl1 et DMP/siBcl-xl a entraîné une inhibition significative de la croissance tumorale des xénogreffes par rapport aux groupes témoins. Le poids des tumeurs dans chaque groupe est présenté sur la figure 4b. En comparaison avec le groupe de traitement NS (0,85 ± 0,09 g) et le groupe DMP (0,76 ± 0,11 g), le complexe DMP/siMcl1 a entraîné une réduction statistiquement significative du poids de la tumeur (0,34 ± 0,06 g, P <0,01), et pendant ce temps, le complexe DMP/siBcl-xl a provoqué une réduction statistiquement significative du poids de la tumeur (0,42 ± 0,08  g, P <0,01). Ces résultats suggèrent que l'injection intratumorale du complexe DMP/siRNA pourrait inhiber efficacement la croissance de la xénogreffe sous-cutanée du modèle de cancer du côlon C26. Les effets secondaires in vivo du complexe DMP/siRNA sur d'autres organes ont été examinés par analyse HE. Comme le montre la figure 4, aucun changement pathologique significatif dans le cœur, le foie, la rate, les poumons ou les reins n'a été observé.

Effets anticancéreux et sécurité du DMP/siRNA sur le modèle de xénogreffe de souris C26. un Courbe de développement tumoral, calculée en fonction du volume tumoral. b Poids moyen des tumeurs dans chaque groupe. Par rapport aux autres groupes de traitement, le groupe DMP/siMcl1 et le groupe DMP/siBcl-xl ont obtenu une réduction statistiquement significative du poids de la tumeur (***P , 0,001). c Images représentatives des tumeurs du carcinome du côlon C26. d Apoptose dans les tissus tumoraux détectée par le test TUNEL. e Analyse HE des principaux organes de chaque groupe de traitement dans les deux modèles. Aucun changement pathologique significatif n'a été observé dans le cœur, le foie, la rate, les poumons ou les reins

Discussion

Dans cette étude, des micelles hybrides DOTAP et MPEG-PCL auto-assemblées cationiques ont été préparées pour délivrer le siRNA Bcl-xl et le siRNA Mcl1 pour le traitement du cancer du côlon C26. Ces micelles DMP présentaient une excellente stabilité et étaient capables de combiner et de transmettre efficacement les siARN Bcl-xl et Mcl1 aux cellules C26. Plus important encore, les micelles DMP ont délivré sans précédent des siRNA (siRNA Bcl-xl et siRNA Mcl1) et pourraient induire efficacement l'apoptose des cellules C26, entraînant une inhibition de la croissance des cellules C26 à la fois in vitro et in vivo avec une sécurité élevée. Collectivement, notre étude a suggéré que le DMP est un vecteur potentiel de livraison de gènes pour l'ARNsi.

Il existe des rapports selon lesquels le lipide cationique DOTAP a été largement appliqué pour l'administration d'ARNsi, mais il engendre de fortes charges positives déclenchant l'hémolyse et présente une cytotoxicité élevée. Sur la base des liposomes cationiques DOTAP avec une efficacité de transfection élevée, mais leurs charges positives produiraient une toxicité, la raison peut être que la tête de sel d'ammonium quaternaire du DMP avec des charges positives a été exposée à la surface de la bicouche phospholipidique du liposome. Cependant, les micelles DMP basées sur le lipide DOTAP présentaient une transfection élevée et une faible cytotoxicité. Nous avons supposé que dans le processus d'auto-assemblage des micelles, le DOTAP était intégré à l'intérieur des nanoparticules de polymère, dont la tête de sel d'ammonium quaternaire n'était pas complètement exposée à la surface. Ainsi les charges positives partielles étaient masquées; en attendant, nos résultats montrent également que l'efficacité de transfection des micelles de DMP n'était pas faible par rapport à l'efficacité de transfection de PEI25K. Il a suggéré que les charges positives de DOTAP après avoir été recouvertes étaient encore partiellement exposées, montrant un potentiel approprié, et ce niveau de potentiel s'est avéré suffisant pour combiner et transmettre le siRNA. De plus, nos résultats ont indiqué que les micelles DMP basées sur MPEG-PCL sont un transporteur de gènes efficace et sûr, qui a été optimisé pour la cytotoxicité de DOTAP et conserve la capacité de transmission de gènes de DOTAP. Et une étude similaire avait rapporté que la cytotoxicité du DOTAP était réduite après avoir été combiné avec d'autres matériaux [23]. Récemment, un nouveau vecteur composé de DOTAP et de SWNT présentait une cytotoxicité plus faible dans l'administration d'ARNsi par rapport à la lipofectamine [8]. Les LPN qui sont des micelles DOTAP-PLGA préparées en utilisant une méthode d'évaporation de solvant à double émulsion (DESE) ont donné des supports de taille nanométrique [24,25,26]. Ces études concordaient bien avec celles décrites dans notre recherche et ont rendu notre conjecture plus convaincante dans une certaine mesure.

L'efficacité d'administration du vecteur de transfert de gène est fortement influencée par le sérum. Les protéines sériques dans le sérum pourraient neutraliser les charges positives à la surface des complexes nanocarrier/siARN, qui étaient affectées par les effets électrostatiques à la surface des cellules avec des charges négatives [27,28,29].

Dans notre étude, lorsque nous avons étudié l'efficacité de la transfection des micelles DMP, nous avons mis en place une série de milieu DMEM contenant 0 %, 10 %, 20 % et 30 % de FBS pour la transfection, en étudiant l'effet du sérum sur l'efficacité de la transfection des Nanoparticules d'ARNsi FAM. Nos résultats ont montré que la présence de FBS avait peu d'impact sur l'efficacité de la transfection. Dans cet article, nous avons utilisé MPEG-PCL pour couvrir DOTAP, et DOTAP a été intégré à l'intérieur de MP avec certaines parties laissées à la surface dans une proportion appropriée. Sur la base de cette structure, nous avons supposé que les charges positives du DOTAP étaient partiellement cachées en raison de la couverture de MPEG-PCL, qui diminuait le niveau d'exposition aux protéines sériques, de sorte que l'effet du sérum sur la transfection était évité. Cela impliquait qu'outre les charges de surface réduites des supports cationiques après modification, la présence de transfection sérique avait peu d'effet sur l'efficacité du support polymère cationique. En raison de l'excellente capacité de transfection dans l'environnement sérique démontrée par les micelles de DMP in vitro, cela a suggéré que le sérum avait peu d'affection pour l'expérience cellulaire in vitro de livraison de siRNA médiée par le DMP.

Conclusion

Dans cette étude, les micelles DMP préparées avaient la capacité de délivrer des siRNA. Et les micelles de DMP ont été utilisées pour délivrer le siRNA Bcl-xl et le siRNA Mcl1 dans les cellules C26 pour une étude de l'activité anticancéreuse in vitro. Nous avons étudié le processus de préparation des micelles DMP et sélectionné un excellent processus de préparation pour préparer des micelles DMP avec une taille étroite, un bon potentiel zêta et une excellente stabilité. En outre, les micelles de DMP préparées n'ont pas été affectées par la présence d'expérience de transfection in vitro dans le sérum. Plus important encore, DMP/siBcl-xl et DMP/siMcl1 peuvent inhiber l'expression du gène Bcl-xl et du gène Mcl1, induisant l'apoptose des cellules C26 et obtenant ensuite un effet thérapeutique d'inhibition de la croissance des cellules C26. L'injection intratumorale du complexe DMP/siRNA pourrait inhiber efficacement la croissance de la xénogreffe sous-cutanée du modèle de cancer du côlon C26. Aucun changement pathologique significatif dans le cœur, le foie, la rate, les poumons ou les reins n'a été observé. On pense que les micelles de DMP peuvent être considérées comme un vecteur efficace pour délivrer des siARN pour le traitement du cancer du côlon.

Abréviations

DOTAP :

N-[1-(2, 3-dioléoyloxy) propyl]-N, N, N, N-triméthylammonium méthylsulfate

mPEG-PCL :

Méthoxypoly (éthylène glycol) Poly (caprolactone)

MTT :

Bromure de 3-(4,5-diméthythiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium

ARNsi :

Petit ARN interférent