Impact des nanoparticules d'or sur le métabolisme de la testostérone dans les microsomes hépatiques humains

Introduction

Les nanoparticules d'or (AuNP) ont été largement utilisées dans l'administration de médicaments, le diagnostic médical et la théranostic du cancer ainsi que dans les produits de consommation, c'est-à-dire les cosmétiques, les emballages alimentaires, en raison de leurs propriétés optiques et physiques uniques [1,2,3]. Lors de l'exposition à un mélange de protéines, les NP s'associent aux protéines et forment une couronne protéique, qui modifie la chimie de surface, les conformations d'une protéine adsorbée et les réponses biologiques ultérieures, c'est-à-dire la toxicité des NP, l'absorption cellulaire des NP, l'activité catalytique du cytochrome P450 (CYP ) enzymes vers les médicaments [4,5,6,7]. Des études in vitro avec des cellules épithéliales primaires et des lignées cellulaires cancéreuses suggèrent que l'AuNP était toxique pour les hépatocytes humains, la lignée cellulaire d'hépatome C3A et les spermatozoïdes [6,7,8]. Mais la formation d'une couronne protéique autour de NP a intensément atténué ou potentialisé la toxicité de l'AuNP d'une manière dépendante de la chimie de surface [6, 7]. La couronne protéique a interféré dans l'absorption cellulaire d'AuNP dans les hépatocytes humains, les cellules du tubule proximatif rénal, les cellules HepG2, la lignée cellulaire C3A, indépendamment de leur taille et de leurs charges de surface [6, 7, 9, 10, 11, 12].

Les enzymes CYP hépatiques sont principalement impliquées dans la synthèse et/ou le métabolisme des composés endogènes et exogènes, mais une large gamme d'agents, c'est-à-dire les médicaments, les pesticides ou les NP, affectent inversement la synthèse, le métabolisme et/ou la détoxification des hormones stéroïdes, entraînant des effets pharmacologiques. et la fonction physiologique [13,14,15,16,17]. La testostérone (TST) est un substrat important spécifique aux androgènes et au CYP3A4 (une conversion principale en 6β-OH TST) de manière régio- et stéréo-sélective [18]. Au cours du métabolisme de phase I, le TST est également hydroxylé en 2β-OH TST par le CYP3A4 et désalkylé en androstènedione (AD) par le CYP2D6 [17, 19]. Des études in vitro avec des hépatocytes humains, une lignée cellulaire C3A, des microsomes hépatiques humains (HLM) et des enzymes CYP recombinantes ont suggéré que l'AuNP nue et recouverte d'une couronne de protéines modulait une large gamme d'enzymes CYP qui comprenaient CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, et 3A4 [6, 7, 20, 21]. D'autres NP métalliques, l'AgNP nu, ont également supprimé la production de 6β-OH TST induite par le CYP3A4 dans les HLM [22]. AuNP fonctionnalisé avec de la polyéthylèneimine ramifiée (BPEI) et de l'acide lipoïque (LA) a diminué l'activité du CYP3A4 dans la lignée cellulaire C3A, mais la couronne de protéine plasmatique humaine (PC) l'a atténuée [7]. En revanche, nu (pas de PC) et PC BPEI-AuNP étaient inhibiteurs des CYP2C9 et 3A4 dans les hépatocytes humains, quelle que soit la taille des NP [6].

Des études in vivo ont rapporté que la petite taille d'AuNP (4 et 13 nm) s'accumulait principalement dans le foie et la rate chez les souris mâles BALB/c et induisait l'expression des gènes hépatiques Cyp1a1 et 2b [23]. D'autres NP métalliques, les NP d'oxyde de zinc ont inhibé l'activité hépatique des CYP1A2, 2C11 et 3A2 chez les rats mâles Sprague Dawley avec une augmentation des changements pathologiques dans le foie [24].

À ce jour, on sait peu de choses sur la manière dont AuNP associe le métabolisme du TST induit par le CYP (hydroxylation et désalkylation du TST) en l'absence et/ou en présence d'une couronne protéique biologiquement pertinente. Les objectifs de cette étude sont d'étudier l'impact du PC sur les propriétés physico-chimiques de l'AuNP cationique BPEI 40 et 80 nm, de l'AuNP anionique LA et de l'AuNP neutre en polyéthylène glycol (PEG). L'impact de l'AuNP sur le métabolisme du TST médié par le CYP avec et sans PC sera caractérisé à l'aide de pHLM. La variation individuelle du métabolisme du TST sera également étudiée au sein d'un HLM à donneur unique contenant divers degrés d'enzymes CYP.

Méthodes/Expérimental

Produits chimiques

Les 2,3,4- ¹³ C₃ la testostérone (CAS#327048-83-9) et la 6β-hydroxytestostérone (6β-OH TST, CAS#62-99-7) ont été obtenues auprès de MilliporeSigma (St. Louis, MO). Testostérone (TST, CAS# 58-22-0), 2α-hydroxytestostérone (2α-OH TST, CAS#004075-14-3), 2β-hydroxytestostérone (2β-OH TST, CAS#10390-14-4), 6α -hydroxytestostérone (6α-OH TST, CAS#2944-87-8), 11β-hydroxytestostérone (11β-OH TST, CAS#1816-85-9), 15β-hydroxytestostérone (15β-OH TST, CAS#39605-73- 7), 16α-hydroxytestostérone (16α-OH TST CAS#63-01-4), 16β-hydroxytestostérone (16β-OH TST, CAS#17528-90-4), 11-cétotestostérone (CAS#564-35-2) , androstenedione (AD, CAS#63-05-8), 4-hydroxy androstenedione (CAS#566-48-3) et 11β-hydroxy androstenedione (CAS#382-44-5) ont été achetés auprès de Steraloids (Newport, RI ). L'acétonitrile et l'acide formique de qualité LC-MS ont été obtenus auprès de Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ), tandis que l'eau ultrapure a été produite en interne par le système Synergy® UV-R de Merck KGaA (Darmstadt, Allemagne). Si non spécifié, tous les autres réactifs ont été achetés auprès de MilliporeSigma (St. Louis, MO).

Microsomes hépatiques humains

Des microsomes hépatiques humains regroupés (pHLM) (200 donneurs, 100 mâles et 100 femelles) et des microsomes hépatiques d'un seul donneur ont été obtenus auprès de Corning Inc. (Charlotte, NC). Les pHLM sont mutualisés par le fournisseur mais pas un pool d'un seul donneur HLM. Les caractéristiques et l'activité enzymatique sélectionnée du cytochrome P450 (CYP) du HLM donneur unique utilisé dans cette étude sont présentées dans le fichier supplémentaire 1 :tableau S1.

Synthèse de nanoparticules d'or

Biopure™ 40 et 80 nm sphérique AuNP fonctionnalisé avec de la polyéthylèneimine ramifiée cationique (BPEI), de l'acide lipoïque anionique (LA) et du polyéthylène glycol neutre (PEG) ont été achetés auprès de nanoComposix (San Diego, CA). Les matériaux de noyau ont été synthétisés via la réduction de l'hydrate de tétrachloroaurate d'hydrogène (III) (HAuCl₄ 3H₂ O) en solution aqueuse de carbonate de potassium et a subi le processus de vieillissement et de filtration à flux tangentiel (TFF). La surface AuNP a été fonctionnalisée avec du LA ou du PEG en ajoutant de l'acide dihydrolipoïque (0,2:1, w /w ) ou PEG à terminaison thiol-méthoxy (Laysan Bio Inc., Arab, AL) (0,5:1, w /w ), respectivement, avec lavage TFF et filtration stérile. Les surfaces fonctionnalisées par BPEI ont été synthétisées via la chimie EDC/NHS en liant l'acide carboxylique de LA aux amines de BPEI. Le BPEI non lié a été éliminé avec un lavage TFF et une centrifugation ultérieure.

Préparation de couronnes de protéines plasmatiques humaines

Plasma humain poolé (HP, n =5) a été obtenu auprès de Biological Specialty Corp. (Colmar, PA). Les AuNP 40 et 80 nm ont été incubées avec du plasma humain à un volume plasmatique physiologique dans le volume sanguin total, 55 % (v /v ) dans un incubateur orbital à agitation/rotation à 37 °C à 250 tr/min pendant 1 h. À la fin de l'incubation, la couronne de protéine plasmatique humaine (PC) entourant la NP a été collectée par centrifugation à 20 000 ×g à 20 °C pendant 20 min suivis de trois lavages avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les protéines non liées et faiblement liées ont été éliminées par centrifugation. Les PC AuNP résultants ont été dispersés dans du PBS et utilisés pour la caractérisation des propriétés physico-chimiques et de son interaction avec le TST.

Caractérisation physique de l'AuNP

La taille des particules et les propriétés de surface ont été mesurées par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et microscopie électronique à transmission (MET). Diamètres hydrodynamiques (D_H ), et le potentiel zêta des BPEI-, LA- et PEG-AuNP nus à 40 et 80 nm (sans PC) dans de l'eau déionisée (DI) et du PC AuNP dans du PBS ont été mesurés avec le Zetasizer Nano-Zs (Malvern Instruments, Worcestershire, Royaume-Uni) à 0 h à 25 °C. Le D_H , l'indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zêta ont également été obtenus pour l'AuNP nu et PC dans un tampon d'incubation microsomal (pH 7,4) à 0 min et 45 min à 37 °C. Les échantillons ont été mesurés cinq fois avec 11 sous-analyses de 10 s chacune. La MET a caractérisé la morphologie des AuNP nus et PC. Tous les AuNP ont été placés sur des grilles de cuivre revêtues de formvar et visualisés sur un Tecnai G2 Spirit BioTWIN avec un détecteur Oxford (FEI Company, Hillsboro, OR) à une tension d'accélération de 120 kV. La suite de microscopie GATAN (GATAN Inc., Pleasanton, CA) a mesuré les diamètres AuNP. Un spectre d'absorption optique a été mesuré avec le lecteur de microplaques multimode Spectra Max i3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Métabolisme in vitro de la testostérone en l'absence et en présence d'AuNP nu et PC

Des études préliminaires ont été menées pour déterminer le temps d'incubation et les concentrations de protéines microsomales afin de fournir un taux métabolique linéaire pour le TST (une concentration finale de 10 μM). La production de métabolites du TST était linéaire de 1,3 à 9,3 mg de protéine microsomale mL ⁻¹ jusqu'à 60 min. Les tests métaboliques ont été effectués comme décrit en détail [25]. En bref, pHLM dans un tampon d'incubation microsomal a été traité avec 10 μM de TST et par la suite, les AuNP nus à 40 et 80 nm (sans PC) ont été ajoutés à 0, 7, 32, 63, 143, 250, 400 et 571 μg mL ⁻¹ ; pour PC AuNP pHLM 0, 7, 32, 63 et 143 μg mL ⁻¹ . Un tampon d'incubation microsomal contenait 100 mM de tampon phosphate, 3,3 mM de MgCl₂ et 1 mM d'EDTA (pH 7,4). La réaction métabolique a été initiée avec et sans système de régénération du NADPH contenant 0,25 mM de NADP, 2,5 mM de glucose-6-phosphate et 2 U mL ⁻¹ glucose-6-phosphate déshydrogénase. Après 45 min d'incubation à 37 °C, la réaction a été stoppée en ajoutant 4 % (v /v ) solution aqueuse d'acide phosphorique (1:1, v /v ). Après une centrifugation à 3 500 tr/min pendant 20 min, un échantillon surnageant a été collecté et stocké à -20 °C jusqu'à utilisation ultérieure. De plus, le HLM d'un seul donneur dans un tampon d'incubation microsomal a été traité avec 10 μM de TST suivi d'une incubation avec 63 μg mL ⁻¹ de tous nus et PC AuNP pendant 45 min à 37 °C. À la fin de l'incubation, l'échantillon a été traité et conservé à − 20°C comme ci-dessus.

Normes et préparation des échantillons

Solutions mères étalons primaires de TST, de ses métabolites et de ¹³ C₃ Les TST marqués en tant qu'étalon interne (ISTD) ont été préparés dans du méthanol à une concentration de 1 mM et conservés à -20 °C jusqu'à utilisation ultérieure. Les concentrations pour les solutions étalons de travail de TST et de ses métabolites étaient de 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50, 100 et 200 μM avec des dilutions en série de la solution mère primaire. Pour les calibrateurs standard, une aliquote de 50 μL de chaque solution étalon de travail a été ajoutée à 450 μL de tampon de réaction, ce qui a donné des dilutions de 1:10, tandis que 0,1 μM de solution ISTD a également été préparée en utilisant une solution aqueuse d'acide phosphorique à 4 %. Des échantillons de contrôle qualité (CQ) ont été préparés à des concentrations de 0,01, 0,05 et 0,1 μM.

Après décongélation, les échantillons ont subi une centrifugation à 3 500 tr/min pendant 20 min à température ambiante. Le surnageant a été additionné de 50 μL de 0,1 μM d'ISTD et a subi une plaque d'élution à 96 puits Oasis PRIME HLB et une plaque de collecte dans le processeur Waters à pression positive-96 à 80 psi pendant 1 à 2 min. (Waters Corp., Milford, MA). Après lavage avec 300 μL d'eau avec 5% de méthanol et élution avec 50 μL de mélange acétonitrile/méthanol (90/10, v /v ), l'éluant résultant a été dilué dans 50 μL d'eau (un volume final de 100 μL) et soumis à une chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS/MS).

Chromatographie liquide-Spectrométrie de masse

Tous les échantillons ont été séparés sur une colonne Waters UPLC HSS T3 (2,1 × 50 mm, 1,8 μm) avec le système de chromatographie liquide Waters Acquity Ultra Performance avec détecteur triple quadripôle (UPLC TQD) (Waters Corp., Milford, MA). Les phases mobiles A et B étaient respectivement 0,1% d'acide formique dans l'eau et 0,1% d'acide formique dans le méthanol. Une méthode LC à gradient a été utilisée à un débit de 600 μL min ⁻¹ pendant 0 à 8,4 min. Le gradient était de 0 à 1 min (30 % de B), de 1 à 3 min (à 50 % de B), de 3 à 3,5 min (50 % de B), de 3,5 à 7 min (à 80 % de B), de 7 à 7,01 min ( à 98 % de B), 7,01 à 7,5 min (98 % de B) et 7,51 à 8,4 min (30 % de B). Les conditions de SEP ont été décrites brièvement ci-dessous. La source d'ionisation fonctionnait en électrospray positif (ESI ⁺ ) mode avec tension capillaire 4000 V ; pour la température de la source 150 °C ; et pour les températures de désolvatation 450 °C. Les débits de gaz de désolvatation (N₂ ), gaz conique (N₂ ) et le gaz de collision (argon) étaient de 900 L h ⁻¹ , 100 L h ⁻¹ , et 0,1 mL min ⁻¹ , respectivement. Le type d'analyse était la surveillance de réactions multiples (MRM) et le temps d'exécution MS était de 8,4 min. Les transitions MRM utilisées pour l'analyse ont été résumées dans le fichier supplémentaire 1 :tableau S2 et figure 2. Le volume d'injection était de 2 μL et la colonne a été maintenue à 50 °C tout au long de l'analyse. Toutes les méthodes de quantification étaient basées sur une courbe d'étalonnage à sept points sur des plages de concentration de 0,001 à 20 μM. La limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ) de 0,001 μM et 0,005 μM ont été établies pour le TST et les métabolites ciblés.

Analyse statistique

Les effets des dispersants sur D_H et PDI de nu et PC sur AuNP ont été évalués à l'aide du t de Student test avec une distribution bilatérale. Concentration inhibitrice demi-maximale (IC₅₀ ) et la moitié de la concentration d'activation maximale (EC₅₀ ) d'AuNP vers la production de métabolites TST dépendants du CYP dans pHLM ont été déterminés en ajustant une équation de Hill avec une pente variable aux données observées à l'aide de GraphPad Prism®. Une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) a été menée à l'aide de GraphPad Prism® pour évaluer les effets du traitement AuNP sur le métabolisme du TST dans le HLM à donneur unique. Lorsque les effets étaient significatifs, une comparaison multiple a été effectuée avec le test de différence significative honnête (HSD) de Tukey à un niveau de signification de 5 %. Coefficient de corrélation de Pearson (r ) entre l'activité CYP de HLM donneur unique et la production de métabolites TST dépendants du CYP a été déterminée à l'aide de GraphPad Prism® version 6.07 (La Jolla, CA).

Résultats et discussion

Caractérisation physicochimique de la protéine plasmatique nue et humaine Corona AuNP

L'impact de la couronne de protéine plasmatique humaine (PC) sur la taille, la charge de surface et la morphologie des NP ainsi qu'une propriété spectrale a été caractérisé à l'aide de la spectroscopie DLS, TEM et UV-Vis (Fig. 1). Les images MET ont démontré que tous les AuNP nus (pas de PC) et PC, à l'exception des PC BPEI-AuNP à 40 et 80 nm, étaient monodispersés avec une distribution de taille stable et des plages de spectre UV-Vis uniques (520 à 557 nm) (Fig. 1a, b) . Des PC distincts autour d'AuNP dans du PBS ont également été trouvés par MET. L'agrégation des polyéthylénimines ramifiées (BPEI)-AuNP enrobées de PC à 40 et 80 nm dans du PBS à 0 min à 25 °C a corrélé plusieurs pics dans la distribution de la taille et les décalages vers le rouge des spectres d'absorption par rapport au BPEI-AuNP nu (Fig. 1b). Le diamètre hydrodynamique (D_H ) les valeurs des PC BPEI-AuNP à 40 et 80 nm dissous dans du PBS à 0 min à 25 °C et dans un tampon d'incubation microsomal à 0 et 45 min à 37 °C n'ont pas été déterminées par DLS, ainsi que de multiples pics de distribution de taille. Le D_H les valeurs du BPEI- et LA-AuNP nu à 40 nm et du PEG-AuNP PC et du BPEI-AuNP nu à 80 nm dans le tampon d'incubation microsomal ont considérablement augmenté jusqu'à 45 min à 37 °C, alors que sa valeur a diminué pour le PC LA à 80 nm -AuNP (tableau 1). L'indice de polydispersité (PDI) du PEG-AuNP nu et PC de 40 nm et du PEG-AuNP de 80 nm a augmenté à 45 min à 37 °C. De plus, les valeurs potentielles zêta (z) du BPEI-AuNP nu à 40 et 80 nm et du PEG-AuNP nu à 40 nm ont considérablement diminué au fil du temps. Une étude précédente a rapporté que l'AuNP (7 et 70 nm) associée aux protéines microsomales du foie humain modifiait le maximum d'absorbance caractéristique dans la gamme UV-visible [21]. Ces résultats ont été corroborés par les études récentes dans notre laboratoire selon lesquelles la couronne de PC et d'albumine sérique humaine modifiait la taille des NP, le décalage vers le rouge de l'absorbance maximale et la morphologie indépendamment du milieu de dissolution et du temps d'incubation [6, 7, 10, 26]. Sur la base des modifications des propriétés physicochimiques des NP médiées par le PC et de la fonction enzymatique des activités du CYP [6, 7], l'effet potentiel de l'AuNP à 40 et 80 nm sur le métabolisme du TST microsomal hépatique humain médié par le CYP a été étudié en présence d'un mécanisme plus biologique. PC concerné.

Micrographies électroniques à transmission de (a ) les AuNP nus à 40 et 80 nm dans de l'eau déminéralisée et b le 40 et 80 nm PC AuNP dans du PBS à 0 h à 25 °C, le spectre d'absorption UV (encadré supérieur) et la distribution dynamique de diffusion de la lumière (encadré inférieur). Les flèches indiquent la formation de PC. BPEI polyéthylèneimine ramifiée, LA acide lipoïque, PEG polyéthylène glycol, ND non déterminé, PC couronne de protéines plasmatiques humaines, nu pas de PC

Métabolisme de la testostérone médié par AuNP dans des microsomes hépatiques humains regroupés

Un total de 11 métabolites du TST ont été criblés et six métabolites ont été trouvés dans des microsomes hépatiques humains (pHLM) regroupés à 10 μM de TST. L'analyse ciblée par LC-MS/MS du TST et des six métabolites sélectionnés est illustrée à la Fig. 2. La liste des métabolites sélectionnés comprenait cinq métabolites hydroxylés du TST (2β-OH TST, 6β-OH TST, 15β-OH TST, 16α -OH TST, 16β-OH TST) et un métabolite désalkylé (androstènedione, AD). Ceci est en corrélation avec les études précédentes utilisant des hépatocytes humains et des HLM selon lesquels le TST était principalement hydroxylé en 6β-OH TST et à un moindre degré en 2β-OH TST, 15β-OH TST, 16α-OH TST et 16β-OH TST ainsi qu'un métabolite désalkylé, AD [17, 19, 27].

Le chromatogramme ionique extrait (XIC) pour la testostérone (TST), ¹³ TCT marqué au C3, androstènedione, 2β-hydroxy testostérone (2β-OH TST), 16α-hydroxytestostérone (16α-OH TST), 16β-hydroxytestostérone (16β-OH TST), 6β-hydroxytestostérone (6β-OH TST) et 15β -hydroxytestostérone (15β-OH TST) produite dans un pool de HLM à la concentration finale de 10 μM de testostérone en présence de NADPH pendant 45 min à 37 °C. HLM microsomes hépatiques humains, NADPH un nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit

Le résultat de la coincubation du TST avec les AuNP nus à 40 et 80 nm dans pHLM a été montré dans les Fig. 3 et 4. Tous les AuNP nus à 40 et 80 nm ont modifié la production de 2β-OH TST, 6β-OH TST et 15β-OH TST dans pHLM avec un degré d'inhibition variable (Fig. 3a–f). Concentration inhibitrice demi-maximale (IC₅₀ ) les valeurs du BPEI-AuNP à 40 nm pour la production de 6β-OH TST étaient de 416 μg mL ⁻¹ ; pour 80 nm BPEI-AuNP 438 μg mL ⁻¹ ; et pour 80 nm PEG-AuNP 387 μg mL ⁻¹ (Fig. 3c, d). Pour la production de 15β-OH TST, IC₅₀ les valeurs du BPEI-AuNP à 40 nm étaient de 1113 μg mL ⁻¹ ; pour 80 nm BPEI-AuNP 415 μg mL ⁻¹ ; et pour 80 nm PEG-AuNP 480 μg mL ⁻¹ (Fig. 3e, f). Ces résultats ont été corroborés par des études in vitro avec des lignées cellulaires cancéreuses humaines et des tissus hépatiques selon lesquels un NP métallique, un AgNP et un NP de silicium poreux entravaient la production de 6β-OH TST dans les cellules d'adénocarcinome colorectal épithélial humain Caco2, les cellules de carcinome hépatocellulaire HepG2 et les microsomes hépatiques humains [22, 28]. Les AuNP nus à 40 et 80 nm n'étaient pas inhibiteurs de la production de 16α-OH TST et de 16β-OH TST, à l'exception du BPEI-AuNP à 40 nm qui a supprimé la production de 16β-OH TST à la concentration la plus élevée (517 μg mL ^{− 1} ) (Fig. 4a–d). Le BPEI-AuNP à 40 et 80 nm a augmenté la production d'androstènedione (AD) à la concentration la plus élevée avec les taux métaboliques correspondants de 4,3 et 2,1 pmol mg de protéine ⁻¹ min ⁻¹ , respectivement par rapport à celui du contrôle (0,7 pmol mg de protéine ⁻¹ min ⁻¹ ) (Fig. 4e, f). Mais le LA-AuNP à 80 nm était un inhibiteur de la production d'AD avec IC₅₀ valeur de 233 μg mL ⁻¹ . Ces résultats ont indiqué que l'AuNP nu médiait la production du métabolite TST sélectionné dans le revêtement de surface et de manière dépendante de la taille. De plus, tous les AuNP PC 40 et 80 nm n'étaient pas inhibiteurs de la production de six métabolites sélectionnés à partir du TST dans pHLM jusqu'à 143 μg mL ⁻¹ , quels que soient les revêtements de surface (Figs. 5 et 6). En particulier, le PC a atténué l'inhibition induite par le BPEI-AuNP nu à 40 nm de la production de 6β-OH TST et de 15β-OH TST à des concentrations plus élevées (32 μg mL ⁻¹ à 143 μg mL ⁻¹ ) (Fig. 3c, e et 5c, e). Ces résultats ont montré que les BPEI-, LA- et PEG-AuNP nus à 40 et 80 nm diminuaient l'hydroxylation du TST (2β-OH TST, 6β-OH TST et 15β-OH TST) d'une manière dose-dépendante (Fig. 7 ). De plus, le BPEI-AuNP nu à 40 et 80 nm a augmenté la production d'AD, mais le premier a diminué le 16β-OH TST. Une étude in vitro a rapporté que la production de 6β-OH TST principalement médiée par le CYP3A4 était inhibée par les nanotubes de carbone à paroi simple (SWCNT) de manière dose-dépendante, mais que la corona albumine de sérum bovin l'a atténuée [17, 29]. Notre laboratoire a récemment rapporté que le BPEI-AuNP nu et PC à 40 et 80 nm servait d'inhibiteur des CYP1A2, 2C9 et 3A4 aux niveaux cellulaire et transcriptionnel [6, 7]. Une étude in vivo a rapporté que le PEG-AuNP (4 et 13 nm) s'accumulait principalement dans le foie chez les souris mâles BALB/c et modifiait les niveaux de transcription des gènes hépatiques Cyp1a1 et 2b [23]. Souris ICR mâles avec i.v. injection de PEG-NH₂ -AuNP présentait une augmentation du taux plasmatique de TST de NP sans la morphologie et la fertilité des spermatozoïdes [30]. Autres NP métalliques, dioxyde de titane (TiO₂ ) s'accumulait dans les testicules des souris mâles CD1 et diminuait l'expression de cyp1b1 et 2e1 [31]. Une étude épidémiologique a rapporté qu'un homme adulte de la clinique d'infertilité du Massachusetts présentait de faibles taux plasmatiques de TST associés à un taux élevé de 3,5,6-trichloro-2-pyridinol (TCP) dérivé d'une forte exposition au chlorpyrifos (CFS), un perturbateur endocrinien connu et un inhibiteur du métabolisme du TST médié par le CYP [32]. Une étude précédente a rapporté que les insecticides perturbateurs endocriniens connus, le CFS, l'oxon du CFS, le fonofos, le phorate, le diéthyltoluamide (DEET) et la perméthrine inhibaient et/ou activaient considérablement la production des métabolites hydroxylés et/ou désalkylés du TST, c'est-à-dire le 2β-OH TST, 6β-OH TST, 15β-OH TST et AD et 4-hydroxy AD dans le foie humain [17]. Cela dit, il est raisonnable de postuler que l'AuNP peut être un perturbateur endocrinien potentiel en médiant un pouvoir inhibiteur et/ou activant contre le métabolisme du TST médié par le CYP.

Effet inhibiteur de AuNP nu (pas de PC) sur la production de 2β-OH TST (a , b ), 6β-OH TST (c , d ) et 15β-OH TST (e , f ) en pHLM. Les données représentent la moyenne ± S.D. (n =3). CI ₅₀ , concentration inhibitrice demi-maximale ; pHLM , microsomes hépatiques humains regroupés ; ND , non déterminé en ajustant une équation de Hill à pente variable aux données observées à l'aide de GraphPad Prism® ; PC , protéine plasmatique humaine; BPEI , polyéthylèneimine ramifiée; LA , l'acide lipoïque; PEG, polyéthylène glycol; Conc, concentration; 2β-OH TST, 2β -hydroxytestostérone; 6β-OH TST, 6β -hydroxytestostérone; 15β-OH TST, 15β -hydroxytestostérone

Un effet inhibiteur et stimulateur de l'AuNP nu (sans PC) sur la production de 16β-OH TST (a , b ), 16β-OH TST (c , d ) et AD (e , f ) en pHLM. Les données représentent la moyenne ± S.D. (n =3). CI ₅₀ , concentration inhibitrice demi-maximale ; CE ₅₀ , concentration d'activation demi-maximale ; pHLM , microsomes hépatiques humains regroupés ; ND , non déterminé en ajustant une équation de Hill à pente variable aux données observées à l'aide de GraphPad Prism® ; PC , protéine plasmatique humaine; BPEI , polyéthylèneimine ramifiée; LA , l'acide lipoïque; PEG , polyéthylène glycol; Conc, concentration; 16α-OH TST, 16α -hydroxytestostérone; 16β-OH TST, 16β -hydroxytestostérone; AD , androstènedione.

Effets de PC AuNP sur la production de 2β-OH TST (a , b ), 6β-OH TST (c , d ) et 15β-OH TST (e , f ) en pHLM. Les données représentent la moyenne ± S.D. (n =3). CI ₅₀ , concentration inhibitrice demi-maximale ; pHLM , microsomes hépatiques humains regroupés ; ND , non déterminé en ajustant une équation de Hill à pente variable aux données observées à l'aide de GraphPad Prism® ; PC , corona de protéine plasmatique humaine; BPEI , polyéthylèneimine ramifiée; LA , l'acide lipoïque; PEG , polyéthylène glycol; Conc, concentration; 2β-OH TST, 2β -hydroxytestostérone; 6β-OH TST, 6β -hydroxytestostérone; 15β-OH TST, 15β-hydroxytestostérone.

Effets du PC AuNP sur la production de 16α-OH TST (a , b ), 16β-OH TST (c , d ) et AD (e , f ) en pHLM. Les données représentent la moyenne ± S.D. (n =3). CI ₅₀ , concentration inhibitrice demi-maximale ; pHLM , microsomes hépatiques humains regroupés ; ND , non déterminé en ajustant une équation de Hill à pente variable aux données observées à l'aide de GraphPad Prism® ; PC , corona de protéine plasmatique humaine; BPEI , polyéthylèneimine ramifiée; LA , l'acide lipoïque; PEG , polyéthylène glycol; Conc, concentration; 16α-OH TST, 16α -hydroxytestostérone; 16β-OH TST, 16β -hydroxytestostérone; AD , androstènedione.

Schéma proposé du métabolisme de la testostérone dans les microsomes hépatiques humains mis en commun et la production de ses métabolites médiée par l'AuNP. AuNP nanoparticules d'or, BPEI polyéthylèneimine ramifiée, LA acide lipoïque, PEG polyéthylène glycol, PC couronne de protéines plasmatiques humaines. Flèche rouge, effet inhibiteur ; flèche bleue, effet stimulant

Métabolisme de la TST dans les microsomes hépatiques humains à donneur unique et sa modulation par AuNP

La production de six métabolites sélectionnés a été caractérisée avec un HLM de donneur unique isolé à partir de donneurs avec un degré variable d'activité CYP à la concentration non inhibitrice basée sur pHLM de 40 et 80 nm nu et PC AuNP (10 μg mL ⁻¹ ). Une variation individuelle du métabolisme du TST a été observée parmi trois différents HLM à donneur unique (Fichier supplémentaire 1 :Figure S1). La relation entre l'activité catalytique de chaque enzyme CYP et la production de métabolites dérivés du TST a été caractérisée au sein de trois HLM à donneur unique différents qui contenaient une activité catalytique CYP faible, moyenne et élevée (Fichier supplémentaire 1 :tableau S1). La production de 6β-OH TST est positivement corrélée à l'activité du CYP2C19 (r =0.99 et p =0,01) et CYP3A4 (r =0.99 et p =0,03) au sein des individus (Fichier supplémentaire 1 :Figure S2). La production d'AD était négativement corrélée avec le CYP4A11 (r =− 0,98 et p =0,04) (Fichier supplémentaire 1 :Figure S3). Ces résultats étaient cohérents avec une étude précédente rapportant que le CYP3A4 et le CYP2D6 jouaient un rôle clé dans la production d'un métabolite majeur du TST, le 6β-OH TST et AD, respectivement [17]. Cette étude a également suggéré qu'une variation individuelle du métabolisme du TST dépendant du CYP dépend des génotypes des enzymes du CYP et de leurs activités phénotypiques. Une étude précédente a rapporté que les polymorphismes et les phénotypes CYP sont les principales caractéristiques de la fonction CYP et aboutissent à des phénotypes pharmacogénétiques catégoriques en tant que métaboliseurs faibles, intermédiaires, extensifs et ultrarapides contribuant à une susceptibilité individuelle aux effets indésirables des médicaments et/ou à l'efficacité et à la dose du médicament suggérant qu'un métaboliseur faible de l'enzyme CYP, c'est-à-dire que le CYP3A4 peut être sensible au métabolisme du TST à la suite d'une exposition à l'inhibiteur du CYP, l'AuNP [33].

Comme le montrent les Fig. 8 et 9, la coincubation du TST avec AuNP à une concentration non inhibitrice a provoqué une augmentation et/ou une diminution du métabolisme du TST médié par le CYP parmi les HLM à donneur unique en fonction de la modification de la taille et du changement de surface. L'ANOVA a indiqué que des changements significatifs selon la taille de l'AuNP (p <0,0001), revêtements de surface (p <0,0001), et la formation du PC (p <0,0001) ont été observés pour la production de six métabolites sélectionnés du TST dans le HLM à donneur unique (HDA1, HDB2 et HDC3).

Effects of 40 nm naked and PC AuNP on the production of 2β-OH TST (A1–A3), 6β-OH TST (B1–B3), 15β-OH TST (C1–C3), 16α-OH TST (D1–D3), 16β-OH TST (E1–E3), and AD (F1–F3); in three different single donor HLM (HDA1, HDB2, and HDC3). Means followed by the same letter were not significantly different for each nanoparticle (Tukey’s honest significant difference =5%). Naked no PC, PC human plasma protein corona, HLM human liver microsomes, BPEI branched polyethylenimine, LA lipoic acid, PEG polyethylene glycol, 2β -OH TST 2β-hydroxytestosterone, 6β -OH TST 6β-hydroxytestosterone, 15β -OH TST 15β-hydroxytestosterone, 16α -OH TST 16α-hydroxytestosterone, 16β -OH TST 16β-hydroxytestosterone, AD androstenedione

Effects of 80 nm naked and PC AuNP on the production of 2β-OH TST (A1–A3), 6β-OH TST (B1–B3), 15β-OH TST (C1–C3), 16α-OH TST (D1–D3), 16β-OH TST (E1–E3), and AD (F1–F3); in three different single donor HLM (HDA1, HDB2, and HDC3). Means followed by the same letter were not significantly different for each nanoparticle (Tukey’s honest significant difference =5%). Naked no PC, PC human plasma protein corona, HLM human liver microsomes, BPEI branched polyethylenimine, LA lipoic acid, PEG polyethylene glycol, 2β -OH TST 2β-hydroxytestosterone, 6β -OH TST 6β-hydroxytestosterone, 15β -OH TST 15β-hydroxytestosterone, 16α -OH TST 16α-hydroxytestosterone, 16β -OH TST 16β-hydroxytestosterone, AD androstenedione

All 40 nm naked and PC AuNP decreased both 2β-OH TST and 6β-OH TST production in HDA1 and HDC3 except for PC PEG-AuNP in the former and naked LC-AuNP in the latter, whereas in HDB2, only PC AuNP potentiated inhibition of their productions, irrespective of surface coatings (Fig. 8(A1–B3)). The 40 nm naked LA-AuNP was an inhibitor for 15β-OH TST production in HDA1; for HDB2 PC PEG-AuNP; and for HDC3 naked BPEI- and PEG-AuNP and PC LA- and PC PEG-AuNP (Fig. 8(C1–C3)). All 40 nm naked AuNP were an activator for 16α-OH TST production in HDA1 but PC attenuated it except for PC BPEI-AuNP which potentiated its inhibition (Fig. 8(D1)). All 40 nm naked and PC AuNP did not influence the production of 16β-OH production within individuals (Fig. 8(E1–E3)). AD production was modulated by the 40 nm naked and PC AuNP with varying degrees of inhibition except for PC PEG-AuNP which served an activator in HDC3 (Fig. 8(F1–F3)).

The 80 nm naked and PC AuNP-mediated inhibition for 2β-OH TST production was observed within individuals except for 80 nm naked and PC PEG-AuNP which served as the activators in HDB2 and HDC3, respectively (Fig. 9(A1–A3)). These results were not consistent with all naked and PC 40 nm AuNP-mediated inhibition for 2β-OH TST, irrespective of surface coatings (Fig. 8(A1–A3)). For 6β-OH TST, the 80 nm naked AuNP were the activators except for LA-AuNP but PC potentiated its inhibition in HDB2 (Fig. 9(B2)), which was similar to the 40 nm naked and PC AuNP-mediated inhibition and/or activation, respectively (Fig. 8(B2)). For 15β-OH TST, 80 nm naked BPEI- and PEG-AuNP and PC PEG-AuNP were the activators in HDB2 and in HDC3, respectively (Fig. 9(C2 and C3)). The 80 nm naked AuNP increased 16α-OH TST production in HDA1, irrespective of surface coatings but PC attenuated it except for PC LA-AuNP which was an inhibitor (Fig. 9(D1)). This is similar to the 40 nm naked and PC AuNP-mediated activation and attenuation for 16α-OH TST production in HDA1 (Fig. 8(D1)). All 80 nm naked and PC were not inhibitory to 16β-OH TST production within all individuals, irrespective of surface coatings (Fig. 9(E1–E3)). These results were consistent with the 40 nm naked and PC-mediated its production within individuals (Fig. 8(E1–E3)). For AD production, the 80 nm naked BPEI- and PEG-AuNP were the inhibitors but PC attenuated and vice versa with naked and PC LA-AuNP in HDA1 (Fig. 9(F1)). The 80 nm naked and PC AuNP decreased its production in HDC3 except for PC PEG-AuNP, which was an activator (Fig. 9(F3)). This study strongly suggests that AuNP interaction with CYP enzymes in HLM cause a decrease and/or increase in TST conversion to hydroxylated and dealkylated metabolites within individuals and the presence of PC played the inhibitive or protective role. In vivo study reported that the male CD-1 mice orally administrated with ketoconazole, a noncompetitive CYP3A4 inhibitor showed that a decrease in serum TST level, gonadal TST secretion, and hepatic TST hydroxylation activity that included 6β-OH TST, 15α-OH TST, 15β-OH TST, and 16β-OH TST [34]. In vitro studies with human hepatocyte, C3A cell line, HepG2 cell line, HLM, and recombinant CYP enzymes suggested that AuNP modulated the activity of various CYP enzymes that included CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1, and 3A4 [6, 7, 20, 21]. PC and human serum albumin corona mitigated an inhibitory effect of BPEI- and LA-AuNP on CYP1A2, 2C9, and 3A4 enzyme activity in human hepatocytes and C3A cell line [6, 7]. That being said, it may be rational to propose that AuNP interference with CYP enzymes relates individual susceptibility to unexpected toxicological effects that may result in an altered circulating TST level tied to endocrine disrupting substance and/or drug-drug interaction sharing the same CYP enzymes [35].

Conclusions

These studies exhibit that AuNP interaction with PC definitely modulate CYP-dependent metabolism of TST in HLM derived from a large donor pool that better represents the average American population. The 40 nm naked (no PC) AuNP and to a lesser degree 80 nm naked AuNP inhibited TST hydroxylation but activated TST dealkylation at high concentration. Cationic BPEI-AuNP withheld the production of 6β-OH TST and 15β-OH TST in pooled HLM but the presence of a more biologically relevant PC alleviated their adverse effects as function of size and surface charge modification. In most cases, the 40 and 80 nm naked and PC AuNP are essentially inhibitory to TST metabolism in single donor HLM in a surface chemistry-dependent manner at the noninhibitory concentration. In addition, PC PEG-AuNP caused an activation of AD production in HDC3, irrespective of size. These results may indicate that individual variations in AuNP-mediated TST metabolism could be a factor for their toxicity and could be utilized to identify vulnerable subgroup to TST-disrupting NP.

Disponibilité des données et des matériaux

All data generated or analyzed during this study are included in this article and its supplementary information file.

Abréviations

11β-OH TST:

11β-hydroxytestosterone

15β-OH TST1:

5β-hydroxytestosterone

16α-OH TST:

16α-hydroxytestosterone

16β-OH TST:

16β-hydroxytestosterone.

2α-OH TST:

2α-hydroxytestosterone

2β-OH TST:

2β-hydroxytestosterone

6α-OH TST:

6α-hydroxytestosterone

6β-OH TST:

6β-hydroxytestosterone

AD :

Androstenedione

AgNP:

Nanoparticules d'argent

ANOVA:

One-way analysis of variance

AuNP:

Nanoparticules d'or

BPEI:

Branched polyethylenimine

CFS:

Chlorpyrifos

CYP:

Cytochrome P450

DEET:

Diethyltoluamide

D_H :

Hydrodynamic diameters

DI:

Eau déminéralisée

DLS :

Diffusion dynamique de la lumière

EC₅₀ :

Half maximal activation concentration

EDC/NHS:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide/N-hydroxysuccinimide

ESI ⁺ :

Electrospray positive

HLM:

Human liver microsomes

HSD:

Tukey’s honest significant difference

IC₅₀ :

Half maximal inhibitory concentration

ISTD:

Internal standard

LA:

Lipoic acid

LC-MS/MS:

Liquid chromatography-mass spectrometry

LOD :

Limite de détection

LQ :

Limit of quantitation

MRM :

Multiple reaction monitoring

NADP:

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

NADPH:

Reduced NADP

naked:

No PC

NP :

Nanoparticules

PBS :

Solution saline tamponnée au phosphate

PC:

Human plasma protein corona

PDI :

Indice de polydispersité

PEG :

Polyéthylène glycol

pHLM:

Pooled human liver microsomes

QC:

Quality control

SWCNT:

Single-walled carbon nanotube

TEM :

Microscopie électronique à transmission

TFF:

Tangential flow filtration

TiO₂ :

Titanium dioxide

TST:

Testosterone

UPLC TQD:

Ultra performance liquid chromatography system with Triple quadrupole Detector